慢病毒转染PROTOCOL

第一天 病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。 加入 1 ml 适当的完全培养基(含有血清和抗生素)孵育过夜。在传染当天细胞应该达到约50%平铺(Day 2)。 注意:也可用其它型号培养板转导。这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。 第二天 准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物,Polybrene 终浓度为:5 μg/ml。 移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中(适用于12 孔板)。 注意:Polybrene 是一种聚阳离子,可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定(通常范围为2-10 μg/ml)。过长时间暴露于Polybrene(> 12 小时)可对某些细胞产生毒性作用。 在室温下溶化慢病毒颗粒,使用前轻轻混匀。 培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。 轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。 注意:溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。 注意:当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞,我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。此外,我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照(sc-108080)。 注意:用copGFP 对照慢病毒颗粒:sc-108084 观察转导效率。 第三天 移去培养液并添加1 ml 完全培养基(不含Polybrene)。 孵育细胞过夜。 第四天 欲选择稳定表达shRNA 的克隆,根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。 第五-六天及以后 用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。 Puromycin 筛选法:用足够剂量的Puromycin 杀死非转导的细胞。Puromycin 浓度范围为2 到10 μg/ml 是常用计量,但对于新的细胞株建议先做Puromycin 滴度。 每3-4 天更换含有新鲜Puromycin 的培养基,直到耐药克隆可以被确认。选择几个克隆,扩增并进行稳定shRNA 表达鉴定。 注意:因为慢病毒结构整合到细胞基因的数量不同,使Puromycin 耐药克隆可能出现不同水平shRNA 表达。 注意:用蛋白免疫印迹法(Western Blot)对shRNA 进行表达分析时,细胞裂解液准备方法如下: 用PBS 漂洗细胞一次。 细胞置于100 μl 的2x 电泳上样缓冲液(sc-24945)和PIPA 裂解液(sc-24948)的1:1 混合液并轻轻振动12 孔板或用加样器冲打以裂解细胞。 必要时冰上超声裂解。 注意:如果用RT-PCR 对shRNA 进行表达分析,请参考P. Chomczynski and N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159) 描述的RNA 分离方法或使用商品化RNA 分离试剂盒。 生物安全性 慢病毒颗粒可用于二级生物安全组织培养设施(并且需要按照同级别的其它传染性物质的要求进行处理)。慢病毒颗粒是没有自我复制功能的,并且设计为当shRNA转导并且整合到宿主DNA后,丧失其活性。