载体处理去磷酸化(1)

载体处理去磷酸化质粒载体单酶切后的去磷酸化1、去磷酸化体系的确定：一般有两种体系：20ul体系和50ul体系ddH2O            X to20ulSAPbuffer           2ulSAP              1ul（一般0.05-2μg的DNA用1ul的SAP足够）质粒载体           mul[m=（0.02nmol*质粒大小kb*660）/质粒浓度]2、反应条件：37℃反应30-60min65反应15-30min（灭活SAP）用1XTE将去磷酸化后的载体补足300ul（为了下一步纯化载体时减少损失）载体纯化（个人不建议用胶回收柱纯化，因为纯化的效率很低，除非你的载体浓度很高或者你的柱子效率很高。建议使用酚氯仿纯化DNA的方法纯化载体）加入酚：氯仿：异丙醇（25:24:1） 300ul 充分混匀10min左右8000rmp离心5min，分层后小心吸取上清于新离心管（千万不要吸到中间层，宁肯少吸点上清）加入300ul异丙醇于上清中，充分混匀8000rmp离心5min，小心倒去上清（一般载体纯化是看不到底部沉淀，但并不表示没有载体沉淀下来）加入300ul70％乙醇洗涤沉淀8000rmp离心5min，小心倒去沉淀，室温晾干5min,加20-50ul1XTE溶解载体。最后测浓度准备下一步连接体系的建立以下为转载前辈的去磷酸化方法，共大家参考：对单酶切后的产物去磷酸化是指5‘端的磷酸基团，（3’端是-OH）。用CIAP去磷酸化，它能将5‘端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构。单酶切的末端能够发生载体自连。CalfIntestinalAlkalinePhosphatase，简称CIAP，中文名称为小牛肠碱性磷酸酶，是一种可以催化DNA、RNA、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸水解释放5′末端或3′末端磷酸基团的酶。CalfIntestinalAlkalinePhosphatase也可以脱去蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的磷酸基团。经限制性内切酶酶切的质粒5'端带有磷酸基团，在进行基因克隆时为避免质粒发生自连，可以使用CalfIntestinalAlkalinePhosphatase去除5'末端磷酸基团。脱去5′末端磷酸基团的质粒不能发生自连。用途：去除DNA、RNA5′或3′末端的磷酸基团；通过去除载体或DNA片断5′末端的磷酸基团，防止载体或DNA片断自连；通过5′末端脱磷，为5′末端磷酸化放射性标记准备模板；用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。来源：小牛肠粘膜。使用说明：1.DNA5′末端的去磷酸化：a.参考如下表格设置去磷酸化反应：DNA0.05-2μgReactionBuffer(10X)2μl补充无核酸酶的去离子水至19μlCalfIntestinalAlkalinePhosphatase(1U/μl)1μlb.按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。c.37℃孵育30分钟。d.后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化已脱磷酸化的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。载体单酶切过夜，然后65度失活，直接加CIAP去磷酸化，再65度使之失活，不用酚仿抽提，直接做连接，行吗？是不是必须做对照？--------------------------------------------------------------------------------载体单酶切过夜，然后65度失活，直接加CIAP去磷酸化后，建议用酚、氯仿抽提或者用胶回收后做连接，因为CIAP去磷酸化酶在螯合剂存在下，经65度30分钟加热处理，99%的活性不可逆失活（根据反应条件不同有时也有外），用胶回收可以除去酶蛋白。最好做个对照，检验你的去磷酸化是否成功。--------------------------------------------------------------------------------前些天才做完载体单酶切连接，现将自己的经验介绍如下：1.载体单酶切三个小时足以，时间长并不一定好。2.如果不需要连接效率的话，可以不用去磷酸化，但载体单酶切纯化后最好马上与你新制备的具相同粘末端的目的片段进行连接反应，也就是说一定要保持单酶切后的载体与目的片段的“新鲜”。3.载体和目的片段单酶切后建议直接用柱纯化，我用的promega的柱，回收率很高。我的目的片段2KB，载体13KB。4.连接反应目的片段与载体的摩尔比要高，最好10-20:1，因为单酶切后的载体与目的片段具有相同的粘末端容易出现自连，过量的目的段可以促进两者的反应，有利于出现重组子。5.我的单酶切的载体没有去磷酸化，单酶切目的片段也没有磷酸化，4度24小时连接，挑24个单菌落有3个重组子。克隆中载体的处理和去磷酸化克隆实验的成功与否,除了与连接方式以及载体选择有关之外，载体的处理也是一个很重要环节。为了提高连接效率，处理载体时应注意以下几点：(1)应加入常用量5～10倍的内切酶水解载体，以保证载体被完全酶切；(2)如用双酶切割载体，则必须电泳回收载体片段，除去双酶切所产生的小DNA片段；(3)如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。对于3末端突出的DNA(如PstI水解，需用10倍于5末端突出DNA(如EcoRI,HindⅢ)的CIP进行去磷酸化，以达到最少的载体自身环化。去磷酸方法如下：①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液，5端突出的DNA，每100pmol5磷酸基团加入1个单位的CIP，37℃反应30分钟。平末端或3端突出的DNA，每2pmol5磷酸基团加1个单位CIP，37℃保温15分钟后，再加CIP，55℃反应45分钟(2μg5kb的线性DNA约含14pmol左右的5磷酸基团)；②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分别至终浓度05%、5mmol/L和50μg/ml，混匀后56℃反应30分钟；或加EDTA(pH8.0)至终浓度为5mmol/L，65℃保温1小时或75℃，10分钟灭活CIP;③冷却至室温后，加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次;10mmol/LZnCl210mmol/LMgCl2100mmol/LTris・HCl,pH8.0。