病毒感染力的滴定(TCID50的测定)(2)

病毒感染力的滴定（TCID50的测定）概念：半数感染量（medianinfectivedose，ID50）表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。一、实验目的  了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50(50%lethaldose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg50%infectivedose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50%tissuecultureinfectivedose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100µl。3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCID50的计算方法1、Reed-Muench两氏法病毒液稀释度出现CPE孔数（cytopathiceffect,细胞病变效应）无CPE孔数累计出现CPE孔所占的%CPE孔数无CPE孔数10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6（11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）CPE：Cytopathiceffect（细胞病变效应）距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8怎么计算？查看下例karber法计算lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。2、Karber法病毒液稀释度出现CPE的孔数出现CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-600/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数（-1）D：稀释度对数之间的差（lg10-1-lg10-2=1）S：阳性孔比率总和（110.8750.3750.125=3.375）lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。实例1鸡新城疫活疫苗（一）培养病毒 将鸡新城疫病毒（lasota株）接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h收获病毒，供检测与制苗用。（二）检测尿囊液病毒的EID501．EID50的概念 EID50为半数鸡胚感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种鸡胚后，能使半数鸡胚发生感染的病毒量。2．病毒EID50的测定（1）稀释病毒 将收获的尿囊液充分混匀后取1ml，作10倍递进稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…稀释度。（2）接种鸡胚 每个稀释度接种9～11dSPF鸡胚5枚，接种量为0.1ml/枚，37℃温箱培养，逐日观察至120h，其间死亡的鸡胚及时拿出冷藏，至第5d时将所有的鸡胚置4℃冰箱中冷却4h或过夜，收获每枚鸡胚的尿囊液，分别存放。（3）检测血凝价，判断感染情况 用微量血凝试验逐枚检测鸡胚尿囊液中病毒的血凝价，当HA≥1:128时判为感染。3．根据血凝价计算EID50：EID50计算举例(1)EID50测定结果见表EID50测定结果         (接种剂量0.1ml)病毒稀释度观察结果累计结果感染数     无感染数      感染%感染数  无感染数    感染%10-5         5      0      100       10     0      10010-6         3      2      60        5      2      7110-7        2      3       40        2      5      2910-8         0      5      0         0     10      0（2）按Reed和Muench法计算EID50EID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数本例高于50%感染鸡胚的病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.5，稀释系数的对数为-1。代入上式则：lgEID50=（-6）＋0.5×（-1）=-6.5∴ EID50=10-6.5/0.1ml即：将病毒悬液作10-6.5稀释后，给鸡胚接种0.1ml，可以使50%的鸡胚感染。(3)结果判断在生产实践中，通过EID50检测，当尿囊液中病毒的EID50≥10-6.0时，方可作为制苗毒液，达不到标准的毒液应弃去或浓缩处理，达到毒价标准后方可灭活制苗。实例2鸡传染性法氏囊炎弱毒活疫苗制备（一）培养病毒按实训五制备鸡胚成纤维细胞悬液，通过细胞计数结果，调细胞数为100万个/ml。按0.3%～0.5%的量同步接种鸡传染性法氏囊弱病毒，置37℃5%CO2培养箱培养72～96h，观察CPE，由法氏囊炎病毒所致的CPE主要表现为细胞变圆、拉丝、脱落等。细胞出现70%以上的CPE时即可将培养瓶反复冻融3次，收获病毒，供检测用。（二）检测TCID501．TCID50的概念 TCID50为半数细胞培养物感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后，能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。2．病毒TCID50的测定（1）稀释病毒液 将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释，即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…。（2）接种细胞培养板 取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合，接种于96孔细胞培养板上。每个稀释度接种4～6孔，每孔100µL，同时设立病毒对照和细胞对照组。置37℃5%CO2培养箱培养72h。观察记录病变情况。（3）判断　70%以上的细胞出现CPE判为感染。3．TCID50计算举例（1）CPE结果见表TCID50测定结果       (接种剂量100µL)病毒稀释度观察结果累计结果CPE数  无CPE数  感染%CPE数 无CPE数 感染%10-5      5    0    100    11     0     10010-6      4    1    80    6     1     8610-7     2    3    40    2     4     3310-8     0    5     0     0     9      0（2）计算按Reed和Muench法TCID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数本例高于50%病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.68，稀释系数的对数为-1。代入上式则：lgTCID50=（-6）＋0.68×（-1）=-6.64∴　TCID50=10-6.64，100µL即：将病毒悬液作10-6.64稀释后，给细胞培养物接种100µL，可以使50%的细胞产生CPE。（3）结果判断 当细胞培养毒液中病毒的TCID50≥10-6.0方可判为合格。