标记HRP——简易过碘酸钠法(4)

1.　原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体试剂及器材(1)　0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠溶于10ml蒸馏水中。(2)　1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml加蒸馏水至2,000ml。(3)　0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:Na２CO３ 0.32克NaHCO３ 0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)　NaBH４溶液(4mg／ml):临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。(5) 0.15M PH7.4 PBS（6） 饱和硫酸铵操作步骤(1)　称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)　将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。(4)　加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)　加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。(6)　将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。(7)　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。(8)　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(9)　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。结果判定定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62酶量(mg／ml)  IgG量(mg／ml)  酶量克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 440,000   　160,000   IgG量操作步骤（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO４溶液，混匀，  4℃静置30分钟。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。（4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜。（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置4 ℃, 2h。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。（7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。（8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。注意事项（1）为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中的抗体含量。（2）碘酸钠要新鲜配制。操作步骤(1) 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1%DNFB无水乙醇溶液0.1ml，室温下轻微搅拌1h；(2) 加入新鲜配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml，此时溶液由原棕色变为墨绿色，置4℃放置30min，此时溶液由原棕色变为墨绿色；(3) 加入2.5%乙二醇1ml， 室温下轻微搅拌1h，终止反应；(4) 加入待标记的抗体5-10mg， 用1.0mol/L， pH9.5 CBS，调节pH值至9.0；(5) 混匀，置4℃过夜(6) 加入硼氢化钠溶液0.1ml，混匀，4℃放置3h；(7) 对0.01mol/L，pH7.4 PBS，4℃透析过夜，换液3次；(8) 3000r/min离心30min，去除沉淀物；(9) 收集上清液即为酶标记抗体。【注意事项】(1) 在氧化HRP时，以pH5.6醋酸盐缓冲液溶解酶为宜。(2) 一般认为氧化HRP 5mg， NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml为宜，不能低于0.015mol/L 0.5ml。(3) 氧化HRP时间以15-30min为宜。(4) 加入DNFB的目的是为了封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。(5) 加入乙二醇的目的是终止反应；为便于在加入抗体后调pH值，故乙二醇要用0.05mol/L CBS配制。 改良过碘酸钠法：①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min；② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h；⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，否则需要调整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。