人皮肤成纤维细胞的获取-

人皮肤成纤维细胞的获取一、材料：手术过程中获取的老年人皮肤组织二、所需试剂：DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，PBS缓冲液，青霉素，链霉素三、方法：1.提前准备好含有添加过青霉素和链霉素的PBS缓冲液的15ml离心管低温放置。2.将得到的皮肤组织置于含有PBS（添加300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的15ml离心管中，并以冰盒存放拿至实验室立马进行实验。3.在生物安全柜中将得到的皮肤组织于培养皿内用（含300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的PBS缓冲液反复漂洗3-5次。4.用无菌手术刀片和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉和脂肪组织。或在PBS清洗前，用70%酒精浸泡半分钟。5.清理干净的皮肤组织转移至新培养皿内，用含抗生素的PBS反复清洗后，取出皮肤组织转移到新的皿中。6.用剪刀将皮肤剪成体积约1mm3大小的组织块。7.将小组织块贴附于一新的培养皿底部，每平方厘米均匀接种10-15块组织。8.5-10分钟后（以团块贴紧培养皿为准），加入少量含10%FBS的DMEM培养液，使组织块刚刚接触培养液即可（不能浸没组织，防止组织块飘起来），置于CO2培养箱。9.2-3h后沿培养皿边缘缓慢加入含10%FBS的DMEM培养液浸没组织块，随后将培养皿轻轻放置于培养箱内，在移动过程中严禁剧烈晃动培养皿影响组织块的贴壁。10.间隔2-3天观察组织块贴壁情况，并进行换液。11.观察细胞爬出情况，当组织块周边细胞生长汇合率达90%以上时进行胰蛋白酶的消化传代。剩余的组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，细胞达到融合后，再消化传代，然后剩余组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，反复上面的步骤。