多克隆抗体的制备 实验报告

实验二多克隆抗体的制备实验目的和要求:1、掌握多克隆抗体制备2、多克隆抗体纯化、保存及效价测定实验:1、猪链球菌(2、7、9型)分型血清制备2、猪链球菌(2、7、9型)分型血清效价测定实验方法和步骤:(一)相关免疫血清的制备2014年11.25达,2014年12.2注射2.0ml抗体1、实验动物分组:成年家兔4组,2只/组2、适应新环境之后,进行免疫:加入之前实验制备的猪链球菌全菌抗原,2ml/只,首免-2w后二免-4w后三免3、采血:首免后2w-4w-6w采血,耳缘静脉采血3mL5、分离血清之后,-20℃保存备用(二)琼脂扩散实验:材料和试剂1、PH8.6,0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液巴比妥钠10.3g,巴比妥1.84g,硫柳汞100mg(防腐剂),蒸馏水加热溶解并定容至500ml。2、1%预复琼脂(或琼脂糖)1g琼脂(或琼脂糖)加蒸馏水100ml溶化即可。3、1%琼脂糖凝胶1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解(注意不要溢出且注意加入蒸发的水),然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀,置4℃保存备用。4、抗原及相应免疫血清。操作步骤1.预复琼脂玻板的制备将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上,使之能将面覆盖即可,放于温箱内干燥(或自然干燥),即可用以制备凝胶板。2.凝胶板的制备溶化琼脂糖,在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上,制成厚度约3~4mm厚的琼脂糖凝胶板,待冷却后根据所需形状打孔(注意不宜在室温下放置过久,尽量缩短操作时间,以免干燥)。3.免疫扩散及结果观察将抗原加入中心孔,倍比稀释的免疫血清加入周围孔,留1孔加双蒸水,以作空白对照(注意:加样至孔满为止,不可外溢)。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中(如需要可重复加样,加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入,以免孔周围形成不透明的白色圈)。湿盒于25℃中,一般保温24~48h,观察抗原抗体产生的白色沉淀线。4.免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时,抗原也可倍比稀释,多做几个梅花孔以作比较。(三)标本的保存为了保存标本,可染色处理,步骤如下:1用生理盐水浸洗待保存的玻板2~3天,每天换水1~2次,洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。2浸洗后于玻板的凝胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂,用湿的优质滤纸覆在凝胶上(两者之间不要有空气),37℃过液使其彻底干燥。3打湿滤纸,轻轻揭下,洗净胶面。4用0.05%氨基黑(用5%醋酸配)染色10min,再用5%醋酸脱色至背景无色为止,干燥保存。也可用0.1~0.5%考马斯亮蓝(10~20%醋酸配制)染色5~15min,再用10~20%醋酸脱色至背景无色,干燥保存。实验结果讨论参考文献