PCR产物和质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

PCR产物和质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析实验原理电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系DNA的分子量DNA的构象*琼脂糖浓度*影响琼脂糖电泳迁移率的主要因素分子量MarkerDNA(EcoRIHindIII)100bpMarker1kbMarkerDNAMarker1、DL2000不同构像质粒质粒的电泳质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋>线性>开环质粒DNA的存在形式有3种:1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.开环超螺旋线性分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶中DNA的观察溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下红色荧光主要实验器材凝胶电泳槽铺胶凝胶凝固后取出梳子加缓冲液准备样品点样电泳凝胶成像系统电泳槽结构操作步骤琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相溶胶准备胶槽凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml注意观察溴酚蓝染液的迁移紫外灯下观察电泳结果照相2、1kbDNALadder不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大致的量如下（按0.5μg上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）：