宏基因组 PPT课件

宏基因组产生背景人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)的完成，从结构基因组学进入以功能性基因组研究为主的后基因组时代人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制，还与其他生物基因组相关。已证明体内菌群的组成和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组学及其相互关系的研究。宏基因组学宏基因组学是一种基于无需预先培养来利用环境样品基因组资源，获得活性物质和功能基因的新技术，因而绕过了菌种纯培养障碍，可直接从自然界获取遗传信息，极大拓宽了微生物资源的利用空间，正成为国际生命科学研究最重要的热点之一宏基因组学的发展宏基因组学的发展经历了4个阶段：环境基因组学微生物基因组学宏基因组学人类宏基因组学的阶段。环境基因组学1991年首次提出环境基因组学(environmentalgenomics)的概念，同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库。1998年美国国立环境卫生科学研究所启动了环境基因组计划(environmentalgenomeproject，EGP)，开展有关人体遗传变异与环境胁迫相互关系的研究环境基因组学第一次提出特定生态条件下，全部生物基因组总体概念，这是基因组学的重要进展微生物基因组学1998年提出生命研究对象应是生物环境中全部微小生物的基因组，首次提出针对特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和进行研究的这一宏基因组(metagenome)概念2007年3月，美国国家科学院以“环境基因组学新科学——揭示微生物世界的奥秘”为题发表咨询报告，指出宏基因组学为探索微生物世界的奥秘提供新的方法，这是继发明显微镜以来研究微生物方法的最重要进展，是对微生物世界认识的革命性突破宏基因组（广义）广义宏基因组是指特定环境下所有生物遗传物质的总和，它决定了生物群体的生命现象。它是以生态环境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律的一门科学宏基因组（狭义）狭义宏基因组学则以生态环境中全部细菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它不是采用传统的培养微生物的基因组，包含了可培养和还不能培养的微生物的基因，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律人类宏基因组学把人体内所有微生物菌群基因组的总和称为“人体宏基因组”(humanmetagenome)。人类宏基因组学(humanmetagenomics)研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。人类宏基因组计划目标是：把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能宏基因组的研究步骤分离特定环境生物DNA纯化大分子量DNA进行克隆将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系对宏基因组文库的DNA进行分析EnvironmentsamplesEnrichmentCultivationDNAisolation(in-situandex-situlysis)VectorsligationSmallsize(plasmid)Largesize(Cosmid,Fosmid,BAC,YAC)TransformtohostsandconstructmatagenomiclibrariesLibraryscreeningFunction–drivenscreeningSequence-drivenscreeningCompoundConfigurationscreeningSIGEXscreening样品中DNA的提取和富集采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原则是在最大提取量和最小剪切力之间折中常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法(细胞提取法)直接裂解法操作方法：将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等)和化学法、酶法等提取方法差别：细胞破壁的方式不同优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好缺点：但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1—50kb))且多为平端，不利于建库，同时难以完全去除酚类物质间接提取法操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。优点：可获得大片段DNA(20—500kb)且纯度高缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比原位裂解法少10—100倍载体选择克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等大肠杆菌，链霉菌和假单胞菌大片段插入载体、表达载体、穿梭载体Comparisonofdifferentclonevectorstransformationmammalialinear>1000MACtransformationSaccharomyceslinear250~2000YACtransformationEscherchiacolicircular100~300PACtransformationEscherchiacolicircular120~300BACtransductionEscherchiacolicircular70~100Pl-clonetransductionEscherchiacolicircular35~45Cosmid,fosmidtransductionEscherchiacolilinear24λphageTransformmethodsExpresslionhostsVectorstructureSizeofinsersegmentsCloningvectors宏基因组文库的建立宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体和宿主菌株直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插入的宏基因片段一般小于10kb宏基因组文库的筛选筛选技术大致可分为四类：①基于核酸序列差异分析；②基于目的克隆功能的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的表达；④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。基于序列的筛选方法根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因对含有16SrRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序。优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。基于功能的筛选方法功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆不需要已知序列的信息，能较快地找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测，如利用其在选择性培养基上的表型特征进行筛选。这种方法具有较高的灵敏度，可检测到较少的目的克隆。另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行。基于功能的筛选方法优点是筛选过程比较简单、快速，只要基因能表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，不需要复杂的实验过程。缺点是这种筛选方法依赖于目的基因在新的宿主中表达，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低，工作量大底物诱导基因表达筛选(substrate-inducedgene-expressionscreening，SIGEX)原理：SIGEX是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用来筛选代谢相关基因及酶基因。由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈簇存在，通常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。底物诱导基因表达筛选(substrate-inducedgene-expressionscreening，SIGEX)优点：提供了一个有效的和经济的检测手段增加了筛选的容量和效率节省了时间为高通量筛选提供了保障不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心因修改底物而产生毒性可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能尤其适合在工业上使用底物诱导基因表达筛选(substrate-inducedgene-expressionscreening，SIGEX)缺点：目标基因的结构性和适应性很敏感，无法用于分析不能进入细胞质的底物，FACS对进样设备的要求也比较高；代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都相邻；有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导，有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表达基于稳定性同位素技术筛选方法具有相同原子序数但不同中子数目且不具放射性的元素称为稳定同位素(stableisotopeprobing，SIP)。环境中的许多物质都可以用SIP来标记，鉴定和分析复杂样本中进行有特殊代谢功能的微生物荧光原位杂交技术利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞。海洋微生物1、海洋生物活性产物的痕量存在；2、海洋生物活性物质难于化学合成；3、产生活性物质的海洋微生物难于人工培养宏基因组工程与海洋生物学进行有机的结合，促使人类了解许多为培养海洋微生物的基因组序列及其功能产物，在海洋天然药物研究、海洋极端环境微生物研究、海洋微生物多样性探索中具有十分重要的应用前景。环境保护和污染修复挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发现新的生物物种。发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制，帮助极端环境的污染修复。从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、有害有害化合物、重金属。环境保护和污染修复可以有效地从环境中分离新的基因、化合物和生物催化剂；所构建的工程菌可用于处理各种复杂污染物，是非常有前景的降解酶系基因筛选方法；所获取的多样性信息可以在废水处理的各种反应器系统、污染物降解过程中微生物的作用和调控、营养物循环和富营养作用的微生物生态、微生物对环境和气候的监测等研究中发挥作用分析微生物种群多样性，检测评价环境健康开拓天然产物新资源2000年8月,Brady和Clardy等人构建了一个含有约7000000个重组子的环境DNA(eDNA)粘粒文库,筛选出具有抗芽孢杆菌活性的克隆65个,并从其中一个克隆发酵物中分离出一系列具有抗菌活性的长链N2酰基酪氨酸类新化合物1213开拓天然产物新资源2000年3月,Wang等人首次以链霉菌为宿主构建了土壤样品宏基因组文库,并从中分离得到了外源基因的表达产物TerragigineA2E和Norcardamine。其中,Terragigine类为首次从eDNA重组微生物产物中发现的新类型的化合物。医学领域Breitbart等利用宏基因组方法分析了人粪便中不可培养的病毒群体，发现该群体中包含1200个病毒基因型，对其序列分析表明大多数是之前没有报道的Walter等对小鼠大肠微生物群构建了宏基因组文库，并对表达β-葡聚糖酶活性的克隆进行了筛选，发现2个克隆是来自不可培养微生物Diaz—Torres等利用宏基因组学方法，对口腔细菌群体中耐药基因进行了分析。结果证明用宏基因组学方法进行耐药情况调查和研究是可行的Gill等建立了人肠道微生物群的宏基因组，并对其代谢特征进行了分析Manichanh等利用宏基因组方法对比研究了正常人和节段性回肠炎病人肠道微生物多样性，发现病人肠道微生物多样性大大降低，尤其是硬壁菌门的细菌种类大大减少医学领域新感染性疾病的发现(例如临床存在很多不明原因的发热病人．他们中是否有被不可培养微生物感染的可能．值得深入探讨)；正常人及某些疾病患者的肠道生境中微生物群体多样性分析，以及与疾病的可能关系；不可培养微生物耐药情况及其机制分析，以及在耐药传播机制中的作用；特殊微生物群体致病机制研究(例如生物膜的研究)从微生物生境中发现有医学应用价值的生物活性新物质新型生物催化剂开发传统的新型酶的筛选方法大大限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学通过直接从环境中提取DNA样品,尽可能为后面的筛选提供更加全面和多样的基因资源,从而有效地提高了新酶的筛选效率。一般来说,新功能酶的筛选主要还是基于活性筛选。这种不依赖于序列的方法总体上可对所有新酶的活性或特异性进行鉴定。虽然,基于序列的筛选方法可能不像功能筛选那样具有较强的目标性,但通过有目的地设计杂交探针或PCR引物,可一定程度地减少文库的容量,缩小筛选的范围。待解决问题文库的质量，目前已发表的文库很少能够覆盖整个宏基因组，这需要进一步优化DNA的提取及克隆方法。高通量的有效筛选平台，目前从几万或几十万个克隆中只能筛选到几个有活性的基因，这主要是由于微生物多样性高，宏基因组比较复杂，以及外源基因在宿主菌中的表达障碍等等。宏基因组学研究主要集中于原核生物，对真菌等真核生物研究较少，所构建文库多为DNA文库，cDNA文库较少。解决方法利用富集等方法简化宏基因组需要发展新的载体和宿主菌，提高异源表达效率，同时建立更为敏感的高通量筛选方法开发样品中真核微生物的裂解方法以及RNA的分离方法