DNA条形码及其在海洋浮游动物生态学研究中的应用

生物多样性2011,19(6):805–814Doi:10.3724/SP.J.1003.2011.10173BiodiversitySciencehttp://www.biodiversity-science.net——————————————————收稿日期:2011-09-30;接受日期:2011-11-16基金项目:国家重点基础研究(973)发展(2011CB403604)、国家科技支撑计划(2008BAC42B01)、国家自然科学基金(41106133)和海洋公益性行业专项经费项目(200805042)*通讯作者Authorforcorrespondence.E-mail:lcl@qdio.ac.cnDNA条形码及其在海洋浮游动物生态学研究中的应用李超伦1*王敏晓1程方平1,2孙松1,31(中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室,青岛266071)2(中国科学院研究生院,北京100049)3(中国科学院胶州湾海洋生态系统国家野外研究站,青岛266071)摘要:浮游动物的准确鉴定是浮游动物生态学研究的基础。传统的基于形态特征的鉴定不仅费时费力,而且部分类群特别是浮游幼体由于形态差异细微,鉴定存在困难,导致物种多样性被低估。DNA条形码(DNAbarcodes)技术为浮游动物物种鉴定提供了一个有力工具,已迅速应用于海洋浮游动物生态学研究。本文介绍了DNA条形码的基本概念、优势及局限性,了该技术(主要是基于线粒体细胞色素C氧化酶第一亚基(mtCOI)基因序列片段的DNA条形码)在海洋浮游动物物种快速鉴定、隐种发现、营养关系研究、生物入侵种监测、群落历史演变反演、种群遗传学以及生物地理学中的成功应用。随着DNA条形码数据库信息量覆盖率的不断提高和新一代测序技术的快速发展,DNA条形码将提供除了种类鉴定外更加丰富的信息,从而帮助人们更好地理解海洋浮游动物的多样性及其在生态系统中的功能,推动海洋浮游动物生态学的发展。关键词:DNA条形码,线粒体细胞色素C氧化酶第一亚基基因,物种鉴定,浮游动物生态学DNAbarcodinganditsapplicationtomarinezooplanktonecologyChaolunLi1*,MinxiaoWang1,FangpingCheng1,2,SongSun1,31KeyLaboratoryofMarineEcologyandEnvironmentalSciences,InstituteofOceanology,ChineseAcademyofSci-ences,Qingdao,Shandong2660712GraduateUniversityoftheChineseAcademyofSciences,Beijing1000493JiaozhouBayMarineEcosystemResearchStation,InstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Qingdao,Shandong266071Abstract:Asthemaincomponentsofmarinebiota,zooplanktonplayvitalrolesinthemarinebiodiversity,trophicrelationshipsandecosystemdynamics.However,morphologicalidentificationofzooplanktonistime-consumingandevenimpossibleforsometaxa,especiallyforpelagiclarvae.Diversityofmarinezoo-planktonisbelievedtobeunderestimated.DNABarcodes(shortDNAsequencesforspeciesrecognitionanddiscrimination)providepowerfultoolsforrapidspeciesidentificationandarequicklyappliedinmarinezoo-planktonecologicalresearches.Herewegiveageneralintroductionontheconcept,advantages,andlimita-tionsofDNAbarcoding.WereviewthemultipleapplicationsofDNAbarcodes(mainlyfocusedonthemi-tochondrialcytochromecoxidasesubunitI(mtCOI)gene)inthemarinezooplanktonecologicalresearches,whichincluderapidspeciesidentification,crypticspeciesreveal,trophicrelationshipanalysis,invasivespe-ciesmonitoring,historicalrangeexpansion,populationgeneticandbiogeographicanalysis.WeanticipatethatDNAbarcodingtechniqueswillbeincreasinglyusedbymarineecologists.WiththeDNAbarcoderef-erencelibrariescompletingandnewhigh-throughputtoolssuchasnextgenerationsequencingdeveloping,DNAbarcodingwillprovidesmoreinformationthat,notonlyforspeciesidentificationanddiscovery,butalsohelptoimproveourunderstandingofzooplanktonbiodiversityandtheirfunctionsinmarineecosystems.806生物多样性BiodiversityScience第19卷Keywords:DNAbarcoding,mitochondrialcytochromecoxidasesubunitI(mtCOI)gene,speciesidentifica-tion,marinezooplanktonecology浮游动物是指自主游泳能力较弱,主要行随波漂流运动方式的海洋动物(Zhengetal.,1984),是海洋生态系统的重要组成部分。浮游动物通常具有生活史短、代谢活动强、分布广泛等特点,因此该类群对于海洋环境的扰动非常敏感(Haysetal.,2005),是海洋生态系统长期变化的重要指示(Planque&Taylor,1998;Beaugrand,2009)。所以,浮游动物研究一直是海洋生态学研究的核心内容之一。浮游动物不同种类的生态功能存在一定的差异,因此种类的准确鉴定是深入了解该类群生态功能的重要基础。但是浮游动物不仅数量巨大,而且种类繁多,涵盖11个门类。根据国家海洋局“我国近海海洋综合调查与评价专项”最新结果,仅中国近海就到浮游动物1,316种(王春生等未发表资料)。传统上基于形态特征的浮游动物种类鉴定费时费力,且需要较高的专业知识。另外,由于浮游动物同一类群的幼体形态差异细微,多数幼体仅能鉴定到大类(Carvalhoetal.,2010);浮游动物不同种间形态特征的趋同进化以及同种内性别二态性、表型可塑性的普遍存在,使得浮游动物的多样性被显著低估(Knowlton,1993),这也使得基于形态特征的传统物种鉴定分析方法的局限性日趋明显。基于分子生物学技术的DNA条形码(DNAbar-coding)种类鉴定技术具有以下优势:(1)不受物种性别及发育阶段的限制;(2)可以检测残缺甚至降解的样本,例如肠道内含物;(3)可以准确区分两似种并指导发现隐种;(4)准确鉴定表型可塑性高的物种;(5)方便数据共享,而且建立统一的物种鉴定,避免鉴定人员因主观经验造成的误差等(Dupontetal.,2007)。因此,该方法建立后立即受到研究者的广泛关注并迅速应用到实际研究中。本文重点围绕DNA条形码这一分子生物学技术在浮游动物生态研究中的应用进行综述。1条形码的概念与发展历程DNA条形码是分子系统发育学以及分子分类学发展的产物(Bucklinetal.,2011)。广义而言,DNA条形码是使用标准化的DNA标记进行物种准确鉴定的技术,像商品的条形码一样建立DNA标记与物种信息之间的一一对应关系(Hebert&Gregory,2005)。Arnot等(1993)最早提出了DNA条形码概念,但直到2003年Hebert提出建立基于DNA条形码的数据库以实现物种的快速鉴定后(Hebertetal.,2003),该技术才得到了生物学界的普遍认可并迅速发展。合适的DNA条形码标记需要满足以下标准(Taberletetal.,2007):(1)该DNA标记需具有合适的变异速率,种内不同个体间序列差异小于不同种间序列差异,存在条形码间隙(barcodegap);(2)该DNA标记应实现标准化,不同类群应尽量使用同一DNA位点;(3)DNA位点中具有足够的系统发育信号,可以将未标记的种类划分到合适的类群;(4)需要具有序列保守区以设计通用引物,保证各类群生物可以进行稳定的PCR扩增以及DNA测序;(5)DNA序列不宜过长,从而方便PCR扩增以及后续的测序检测。其中第(1)条最为关键,是评价DNA条形码优劣的首要指标(Meyer&Paulay,2005)。线粒体细胞色素C氧化酶第一亚基(mtCOI)编码属于线粒体基因组,因此没有内含子且大多严格遵循母系遗传,重组频率极低,几乎不发生重组;较高的拷贝数使得PCR扩增更加简单、可靠;mtCOI基因5′末端约658bp的片段两侧序列非常保守,已有适合几乎所有的后生动物的通用引物;最为重要的是mtCOI序列蕴含从种内到种间不同水平的系统发育信号,绝大多数类群中mtCOI序列均存在明显的条形码间隙(Bucklinetal.,2011)。以上特点让mtCOI序列成为了后生动物物种鉴定分子标记的首选,mtCOI序列658bp的片段序列也已经成为了后生动物DNA条形码的同义词。下文中“DNA条形码”不加说明均指上述基于mtCOI序列的定义。然而以mtCOI序列为框架构建的DNA条形码体系也存在一些不足,主要包括:(1)mtCOI在不同类群间变异速率存在较大差异:软体动物部分种类由于存在其线粒体的父系遗传(Kvistetal.,2003;Terranovaetal.,2007),其进化速率远高于其他后生动物;而海绵等类群由于线粒体可能存在特殊的修复机制,变异速率则慢得多(Huangetal.,2008)。因第6期李超伦等:DNA条形码及其在海洋浮游动物生态学研究中的应用807此基于mtCOI单一基因的DNA条形码难以准确完成所有类群的种类鉴定;(2)核基因中的线粒体假基因(Numt)可能会造成DNA条形码的错误鉴定(Bensassonetal.,2001);(3)基因渐渗在许多类群中普遍存在,线粒体序列此时无法准确反演不同类群之间的关系,从而影响物种鉴定的准确性(Ballard&Whitlock,2004)。尽管如此,对于绝大多数浮游动物而言,使用DNA条形码可以实现准确的物种鉴定(Bucklinetal.,2007,2010a,b)。2浮游动物主要类群DNA条形码研究进展浮游动物包括多个门类,包含大量的隐种,因此DNA条形码技术提出后很快应用于浮游动物研究(Bucklinetal.,2010b)。特别是海洋浮游动物普查计划(CensusofMarineZooplankton:http://www.cmarz.org/)的实施极大促进了浮游动物DNA条形码研究,以mtCOI为核心的DNA条形码的有效性已经在桡足类、磷虾类、介型类、端足类、毛颚类、枝角类等类群中得到验证。下面就海洋浮游动物主要类群的研究进展作一简单介绍。(1)桡足类。桡足类是海洋浮游动物中最早开展DNA条形码研究的类群之一。已有研究表明,该类群条形码间隙明显,种内遗传差异在0.8%左右,种间遗传差异大于20%(Bucklinetal.,2010a;王敏晓,2010),DNA条形码可以准确鉴定绝大多数桡足类物种(Bucklinetal.,2003;王敏晓,2010)。相对于线粒体16SrRNA和核ITS序列等分子标记,DNA条形码具有更高的解析能力,可以提供桡足类种内系统发育的有效信息(Bottger-Schnack&Machida,2011)。桡足类是浮游动物中分类学研究较为透彻的一个类群,但在多个物种内存在较大的种内遗传分化,可能存在大量未被鉴定的隐种。DNA条形码的研究证实该类群的多样性可能被低估,许多全球广布种实际上应为多个近缘种(Thum&Harrison,2009;Staurlandaar-bakkeetal.,2011)。(2)介型类。Bucklin等(2010b)分析了大西洋马尾藻海27种介型类的DNA条形码,结果与桡足类相似,种内遗传差异(0.7%)远小于种间(27.8%),条形码间隙明显,可以实现物种的准确鉴定。浮游动物物种信息平台(http://www.zooplankton.cn/)中记录了我国近海17种介型类DNA条形码,证实DNA条形码在该类群中种类鉴定的有效性,同时发现部分种类种内遗传差异较大,中国近海与大西洋种群的遗传差异达到4%,不同海区可能存在隐种的分化(未发表结果)。介型类的某些种类是无性的,根据DNA条形码的研究结果,其不同种群间遗传差异往往较大,甚至可能发生隐种的分化(Hebert&Cywinska,2002),因此该类群的多样性可能也被严重低估(Brandaoetal.,2010)。(3)磷虾类。磷虾类在大洋生态系统中具有重要的作用。Bucklin等(2007)分析了全球10属40个种磷虾的DNA条形码,结果表明种内遗传差异通常小于2%,种间遗传差异均值达23.7%,DNA条形码可以准确区分其近缘种。虽然磷虾的形态学研究基础较好,但该类群中也存在待定的隐种。短小磷虾(Euphausiabrevis)大西洋种群和太平洋种群间的遗传差异达到13%,可能存在隐种分化(Bucklinetal.,2007)。太平洋两侧的太平洋磷虾(E.pacifica)同样可能存在亚种甚至隐种的分化(王敏晓等,2011)。(4)端足类。已有研究结果表明,DNA条形码可以在区域范围内有效鉴别端足类到种(Radulovicietal.,2009;Bucklinetal.,2010ab)。Costa等(2009)系统比较了钩虾属(Gammarus)近缘种的DNA条形码,发现种内遗传差异(0.8%)远小于种间遗传差异(26.8%),可以实现该类群物种准确的分子鉴定;DNA条形码的结果显示钩虾属内存在隐种分化。类似隐种分化的例子还出现在Hyalella(Wittetal.,2006)、Epimeria(Lorzetal.,2009)、Orchomenella(Havermansetal.,2011)和Eusirus(Bairdetal.,2011)等属中。(5)毛颚类。毛颚动物结构简单,传统的形态鉴定存在困难。DNA条形码可以准确进行箭虫等类群的分子鉴定。同时通过DNA条形码比对,发现大尺度地理隔离的箭虫种群间形成了较明显遗传结构差异,不同种群间可能存在一定隔离(Jenningsetal.,2010b)。Miyamoto等(2010)发现深海毛颚动物存在隐种分化,隐种分布在不同水层。中国近海采自同一站点的强壮宾箭虫(Aidanosagittacrassa)遗传差异也较大,可能对应不同的生态型(王敏晓等,2011)。(6)枝角类。枝角类总共有600余种,但真正的海洋种类仅有8种。Durbin等(2008a)分析了6种海洋枝角类的DNA条形码,其中4种具有较深的种内遗传分化(>5%)以及显著的地理种群结构分化,认为枝角类中的全球广布种不同种群在百万年前的冰川纪发808生物多样性BiodiversityScience第19卷生分化,其遗传差异水平与其他浮游动物隐种分化的水平相当,是否分化为不同种有待开展深入研究。(7)浮游软体动物。DNA条形码已成功应用于海洋软体动物的各个类群中(Desalleetal.,2007;Huntetal.,2010;Lietal.,2011),可以鉴定大多数软体动物种类,并且可以揭示软体动物中的隐种(Johnsonetal.,2008)。Jennings等(2010a)系统分析了不同海区41种浮游螺的DNA条形码,发现种内遗传差异(3%)远小于近缘种间遗传差异(21%),可以实现种类的准确鉴定。除了准确区分近缘种,DNA条形码还可以识别部分种类的亚种和生物型。虽然部分全球广布的浮游螺种群间不存在遗传分化,但多数种类大尺度地理隔离的种群间遗传差异明显,这些种类可能存在隐种。(8)刺胞动物。由于刺胞动物门珊瑚亚门生物(非浮游动物)mtCOI序列变异速率相当慢,使用传统的DNA条形码无法准确区分该亚门的近缘种(Shearer&Coffroth,2008),建议将16SrRNA(Sinnigeretal.,2008)和核ITS(Parketal.,2007)序列作为该亚门生物DNA条形码的主要备选序列。但在水母亚门中,mtCOI序列的变异速率正常(Huangetal.,2008),种内和种间遗传差异显著,以mtCOI为核心的DNA条形码可以准确区分近缘种(Folino-Roremetal.,2009;Ortmanetal.,2010)。大型钵水母的爆发已成为全球性的生态灾害,DNA条形码已被应用到大型水母的生态监测中,并发现钵水母中许多全球广布种存在复杂的隐种(Dawson,2005),海月水母(Aureliaaurita)可以细分为13种隐种(Dawson&Jacobs,2001;Dawson,2003;Dawsonetal.,2005),我国近海的海月水母为Aureliasp.1(未发表)。(9)栉水母。与海绵和珊瑚等低等类群相似,栉水母mtCOI的变异速率仅为其他后生动物的1/10,近缘种间未形成足够的遗传差异(Bucklinetal.,2011)。此外,常用的通用引物对该类群的mtCOI序列扩增效率很低,目前该类群的DNA条形码数量非常少,因此急需针对该类群的物种鉴定筛选合适的分子标记和引物,开发有效的DNA条形码。3在海洋浮游动物生态学研究中的应用3.1种类鉴定如前所述,由于浮游动物形态具有进化保守性,许多最近分化的物种形态差别细微,同属的近缘种往往也只能依据一些数量性状进行区分(郑重等,1984;Lee&Frost,2002)。Bucklin等(2010a)利用DNA条形码比对分析方法,快速检测和鉴定了北冰洋浮游桡足类种类组成。Machida等(2009)使用该方法研究了密克罗尼西亚群岛的浮游动物组成,并成功识别了多种浮游生物。王仁诚等(2011)首次在国内使用宏遗传组学(metagenetics)分析方法研究了胶州湾夏季海洋浮游动物的群落组成。通过将获得的149条环境样品DNA条形码序列与“中国近海浮游动物DNA条形码库”(http://www.zooplankton.cn/)分析比对,共检出37个OTU(operationtaxonomicunit),分别隶属于12个类群,其中19个OTU与已知序列相似程度非常高(>97%),可以鉴定到种。鉴定结果与基于形态特征的镜检分析基本一致,高丰度种类在不同分析方法中均以较高频率检出。证实通过构建环境样品的mtCOI序列文库,可以实现海区浮游动物的物种丰度和群落组成情况的快速评估。新一代测序技术(Solexa、Solid、454GSFLX等)的发展使得基于DNA条形码的群落分析更加经济、快捷。新技术无需构建文库,且测序通量成百万倍地增加,虽然尚未见应用于浮游动物研究的报道,但该方法已被证明是研究微型真核生物多样性的有力工具(Boenigketal.,2010)。浮游动物分子方法的快速鉴定不仅可以提高工作效率,还可以实现浮游动物的完整生活史监测。幼体丰度的时空变化是了解关键种种群动力学的基础(Kochziusetal.,2008),然而幼体由于缺少必要的形态分类信息,在浮游动物研究中通常仅被作为一大类计数。DNA条形码技术可以通过PCR从哪怕最小的卵和幼体中扩增出足量的DNA进行种类鉴定。Webb等(2006)在南极海域的研究结果表明,在完善的数据库支持下,使用DNA条形码鉴定浮游动物幼体是完全可行的。Sewell等(2010)分析了南极大洋2,000多个浮游幼体的DNA条形码,结合形态特征和DNA条形码等多种分子标记的结果,共鉴定出53个分子操作分类(molecularoperationtaxonomicUnit,MOTU,即最低可能分类学单元)。但是由于幼体体型较小,单个样品获得的DNA模板质量通常不能满足使用通用引物扩增DNA条形码序列的要求,因此许多类群需要重新设计引物。3.2发现新种和隐种浮游动物随波逐流,早期学者认为其种群间缺第6期李超伦等:DNA条形码及其在海洋浮游动物生态学研究中的应用809乏生殖隔离,因此不易发生物种的分化。然而近年来研究人员发现浮游动物物种分化水平远高于预期,隐种和两似种可能大量存在(Knowlton,1993,2000;Mcmanus&Katz,2009)。而DNA条形码技术的应用使大量隐种和新种的分类学地位得到了确认(Ueda&Bucklin,2006;Goetze,2010)。一些浮游动物的不同地理种群之间可能存在隐种的分化,海月水母隐种的发现就是很好的例子。根据DNA条形码等分子生物学数据结果,形态特征高度一致的广布种海月水母不同地理种群间遗传差异很大(>13%),已经达到了中间遗传差异的水平,认为这些分化较大的地理种群应划分为多个隐种(Dawson&Jacobs,2001),此分类体系也得到了后续基于生活史、生理生态等研究的验证(Dawson,2003,2005)。发现新种和划分隐种是一项复杂的系统性工作。DNA条形码可以为发现新种(隐种)提供线索,但是并不能取代传统形态鉴定:通过DNA条形码比较不同种群间的遗传差异,如果种内分化较大则可能种群间存在生殖隔离,进而形成种类分化;但新种的最终确定仍需整合形态、早期发育等多重数据进行分析,详见DeSalle和Goldstein(2011)的综述。浮游动物中许多广布种存在显著的种内遗传分化,DNA条形码识别的“分子物种”数量高于“形态物种”(Chen&Hare,2008;Mouraetal.,2008;Radu-lovicietal.,2009;Bucklinetal.,2010a),这些种类有待开展形态学的深入研究。Ueda和Bucklin(2006)发现生活在近岸低盐海域的太平洋纺锤水蚤(Acartiapacifica)种群与大洋种群之间的DNA条形码差异高于种内水平,进一步分析发现不同“种群”生物个体的生殖节等形态特征存在细微差异,推断低盐海域的纺锤水蚤是新种A.ohtsukai。同样,Chen和Hare(2008)基于DNA条形码分析发现,切萨皮克湾的汤氏纺锤水蚤(A.tonsa)存在两个分支,分别生活在不同盐度的海域,进而认为盐度的选择造成了物种的分化,上述两个分支属于不同的物种。尽管尚未得到形态分类的证实,但生境的差异、发育路径的区别等特征表明这些种类很可能的确属于不同的种类。中国近海也发现一些浮游动物种类,例如腹突乳点水蚤(Pleuromammaabdominalis)、太平洋磷虾在大地理尺度上存在遗传分化,也可能存在隐种(王敏晓,2010;王敏晓等,2011)。因此,中国近海浮游动物多样性可能存在低估,亟待整合分子生物学、形态特征等资料开展深入研究。3.3食物网营养关系研究食物网及其动力学研究对于理解生态系统物质、能量传递及生态系统功能具有重要意义(Duffyetal.,2007)。然而肠道内含物中的浮游动物样品大多降解严重,根据形态特征难以鉴定到种类,DNA条形码则为这些样品物种组成分析提供了新的有效途径。使用DNA条形码进行摄食分析主要有两种策略:(1)针对研究生物的摄食对象类群设计特异引物(Jonesetal.,2011)。该方法需要研究物种摄食对象的背景资料,因此多数情况下并不适用于浮游动物。(2)使用通用引物(Blankenship&Yayanos,2005)。扩增产物可能包含大量捕食者的DNA条形码序列,影响后续分析。通常的方法是使用限制性内切酶去除捕食者DNA的扩增产物,然而寻找合适的内切酶十分困难,限制了该方法的使用。Vestheim和Jarman(2008)使用阻断引物(blockingprimers,特异性地阻止需屏蔽生物DNA目标片段PCR扩增的引物)研究磷虾的现场摄食,发现PCR产物中几乎检测不到捕食者的序列信息,从而快速有效地利用DNA条形码鉴定磷虾的摄食对象。定量PCR技术的出现使基于DNA条形码的肠道内含物研究从定性研究向定量研究发展。例如Tobe等(2010)通过分子探针技术发现南极大磷虾(E.superba)的摄食对象主要是长腹剑水蚤属(Oithona)。Durbin等(2008b)使用DNA条形码定量分析了肉食性桡足类对汤氏纺锤水蚤无节幼体的现场摄食率等。新一代测序技术的快速发展使得基于DNA条形码的摄食研究更加经济、高效(Taberletetal.,2009),从而促进了人们对海洋生态系统物质能量流动的路径和效率的理解。3.4生物入侵研究DNA条形码可以准确鉴定海洋入侵种。Radulovici等(2009)使用DNA条形码在圣劳伦斯湾发现了未记录的端足类入侵种。Durbin等(2008a)分析了6种海洋枝角类的DNA条形码,发现枝角类可能存在生物入侵。Pilgrim和Darling(2010)的研究显示,美国近岸太平洋海域端足类存在大量未被发现的入侵种。Briski等(2011)的研究结果表明,使用DNA条形码可以快速检测出压舱水中入侵浮游动810生物多样性BiodiversityScience第19卷物的休眠卵,即便在数据库并不完善的情况下,其种类鉴定成功率也远高于传统分类鉴定。此外,结合种群遗传学分析方法,DNA条形码数据还可以用来分析入侵种的来源和历史(Audzijonyteetal.,2009;Krebesetal.,2010),关于海洋生物入侵种的遗传学研究,详见Geller等(2010)的综述。3.5浮游动物群落的历史变迁反演研究研究不同历史时期海洋生物的群落组成对于理解全球气候变迁过程及其对海洋乃至全球生态系统的影响具有重要作用。然而由于体型细微,浮游动物样品极易破碎,通过形态特征几乎不可能鉴定沉积物中的浮游动物组成。DNA条形码则可以揭开冰山一角,还原部分环境中生物群落组成的变迁历史。当然,以DNA为基础的古环境生态分析对于生物样品的保存环境条件也有一定的要求,目前相关研究主要集中在寒冷环境中(冰芯或极地环境)和低氧环境中(深海沉积物)的样品。例如,Wang等(2011a)利用南极长城湾和西湖地质柱状样,通过DNA条形码技术分析了桡足类的群落组成及其演替变化过程,进而分析了气候变化对浮游动物群落乃至整个南极海洋生态系统的影响。Boere等(2011)从更新世深海沉积样品中成功分离出浮游生物的DNA,并使用小片段的18SrRNA分析古环境中的浮游生物物种组成的历史变迁,发现海洋生物的DNA相对于陆源生物DNA更容易降解,认为选用短的扩增片段作为条形码可能是提高分析成功率的关键。4种群遗传学和生物地理学研究通过定量统计物种的遗传多样性及其结构(种群遗传学),描述不同遗传谱系的地理分布模式(谱系地理学),可以了解种群的来源以及不同种群之间的联系,从而更好地理解洋流、温盐梯度等海洋环境要素对海洋生物分布的影响,揭示冰川等古地质事件对现今生物分布格局的作用。此外,了解种群之间的关系及有效种群数量也是海洋生物资源保护与管理的基础。包括DNA条形码在内的分子标记已成为研究浮游动物种群遗传特征的重要工具(Cowen&Sponaugle,2009;Hellberg,2009)。DNA条形码已广泛用于海洋浮游动物种群连通性及基因流的研究中。浮游动物不同种类间基因流的差异很大,例如海月水母(Kietal.,2008)、飞马哲水蚤(Calanusfinmarchicus)(Provanetal.,2009)、南极大磷虾(Goodall-Copestakeetal.,2010)、中华哲水蚤(Calanussinicus)(王敏晓,2010)等种类其种群间几乎没有分化,基因流显著;而太平洋哲水蚤(Calanuspacifica)(Nuweretal.,2008)、精磷虾(Euphausiacrystallorophias)(Jarmanetal.,2002)、北极哲水蚤(Calanusglacilis)(Nelsonetal.,2009)以及新糠虾(Neomysisinteger)(Remerieetal.,2009)的不同种群间则形成了较为明显的遗传结构差异,基因流水平较低。对于桡足类等终生浮游动物而言,垂直移动行为,物种对温度、盐度的耐受范围,以及各种古地质历史事件等是影响种群间基因流水平的主要因素(Bucklinetal.,2011)。生物冰期避难及其后期重新扩散是影响现今种群的遗传结构最主要的古地质事件。包括汤氏纺锤水蚤(Hill,2004)、沟虾(Gammarustigrinus)(Kellyetal.,2006)在内的多种浮游动物种群间DNA条形码的分支进化都是冰川期后不同种群重新扩散的结果。基于DNA条形码的分析结果,Goodall-Copestake等(2010)认为南极大磷虾在近十万年内发生了种群扩张。基齿水蚤属(Rhincalanus)的不同两似种显示出迥异的种群遗传特性,其原因可能是巴拿马地峡的隆起导致了地理隔离(Blanco-Bercialetal.,2011)。以mtCOI为核心的DNA条形码虽然可以提供大量种群遗传信息,但在许多浮游动物物种中,由于它变异速率太慢,无法解析小地理尺度内较近的种群分化。Wang等(2011b)通过比较不同区域中华哲水蚤的线粒体基因组,发现mtCOI的变异速率远低于非编码区,即便与线粒体其他基因比较,其变异速率仍较慢,无法解析种群间的浅层的遗传分化(王敏晓,2010)。Shen等(2010)也认为由于变异速率的限制,mtCOI并非南极大磷虾种群遗传学研究的最佳工具。因此有必要在DNA条形码的基础上开发微卫星等其他分子标记用以浮游动物的种群遗传学分析。5研究展望目前DNA条形码数据库的信息量覆盖率还相对较低,已获得DNA条形码的海洋浮游动物种数还不到已记录种数的1/10(Bucklinetal.,2011),其中栉水母门等一些浮游动物尚未筛选出合适的DNA第6期李超伦等:DNA条形码及其在海洋浮游动物生态学研究中的应用811条形码,从而极大降低了DNA条形码技术的准确性、效率以及在海洋生态学研究中的实际应用。因此,提高浮游动物DNA条形码数据库的信息量覆盖率,筛选适合于浮游动物所有门类的DNA条形码(单一片段或者片段组合),以及发展环境样品中DNA条形码的提取和生物信息学分析技术成为当前的研究热点和趋势。随着人们对DNA条形码技术的认可,覆盖全球海洋范围的国际海洋生物条形码计划(MarBOL)已经正式启动实施,势必极大推动海洋生物DNA条形码数据库的丰富和完善。另外,新一代高通量测序、实时定量PCR、基因芯片和分子杂交等技术的发展极大推动了DNA条形码的应用范围,使得基于DNA条形码的快速、准确、简便的浮游动物多样性监测和浮游动物等海洋生物的现场实时定性、定量分析成为可能(Kochziusetal.,2008),手持式物种浮游动物物种鉴定终端已非天方夜谭。随着测序成本的不断降低,未来DNA条形码将从单一基因的片段扩展到整个基因组,将提供除了种类鉴定外更加丰富的信息,从而使人们更好地理解海洋生物的多样性及其在生态系统中的功能(Carvalhoetal.,2010)。我国海域辽阔,海洋生物多样性丰富。目前已经获得300多种浮游动物常见种的DNA条形码信息(中国海洋浮游动物物种信息平台,http://www.zooplankton.cn/),并且基于DNA条形码的海洋浮游动物多样性研究、浮游动物种群遗传学研究等已经逐步开展(王敏晓,2010;Wangetal.,2011b)。随着数据库的完善和分析技术的发展,新兴的DNA条形码技术将为我国海洋生态系统监测、海洋生物多样性保护以及海洋生态学研究的发展提供强有力的支撑。参考文献ArnotDE,RoperC,BayoumiRAL(1993)DigitalcodesfromhypervariabletandemlyrepeatedDNA-sequencesinthePlasmodium-FalciparumCircumsporozoitegenecange-neticallybarcodeisolates.MolecularandBiochemicalParasitology,61,15–24.AudzijonyteA,WittmannKJ,OvcarenkoI,VainolaR(2009)InvasionphylogeographyofthePonto-CaspiancrustaceanLimnomysisbenedenidispersingacrossEurope.DiversityandDistributions,15,346–355.BairdHP,MillerKJ,StarkJS(2011)Evidenceofhiddenbiodiversity,ongoingspeciationanddiversepatternsofgeneticstructureingiantAntarcticamphipods.MolecularEcology,20,3439–3454.BallardJWO,WhitlockMC(2004)Theincompletenaturalhistoryofmitochondria.MolecularEcology,13,729–744.BeaugrandG(2009)Decadalchangesinclimateandecosys-temsintheNorthAtlanticOceanandadjacentseas.Deep-SeaResearchPartII:TopicalStudiesinOceanogra-phy,56,656–673.BensassonD,ZhangDX,HartlDL,HewittGM(2001)Mitochondrialpseudogenes:evolution’smisplacedwitnesses.TrendsinEcologyandEvolution,16,314–321.Blanco-BercialL,Alvarez-MarquesF,BucklinA(2011)ComparativephylogeographyandconnectivityofsiblingspeciesofthemarinecopepodClausocalanus(Calanoida).JournalofExperimentalMarineBiologyandEcology,404,108–115.BlankenshipLE,YayanosAA(2005)UniversalprimersandPCRofgutcontentstostudymarineinvertebratediets.Mo-lecularEcology,14,891–899.BoenigkJ,MedingerR,NolteV,PandeyRV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