乳制品

国家职业资格教材编审委员会编食品检验工(中级)黄高明主编第四章乳及乳制品的检验熟练掌握分析天平、电热干燥箱、恒温水浴锅、组织捣碎机、培养箱、超净工作台、显微镜、分光光度计、干燥器的正确；熟练掌握乳中脂肪、蛋白质、乳糖、蔗糖、亚硝酸盐、硝酸盐及膳食纤维测定的原理、方法及操作要点；掌握测定细菌总数、大肠菌群、霉菌、酵母菌及乳酸菌的方法和技能。第一节　乳及乳制品中脂肪的测定一、罗紫-哥特里法(１)乙醚　分析纯。(２)石油醚　分析纯，沸程３０～６０℃。(３)９５％(体积分数)乙醇　分析纯。(４)浓氨水　分析纯。１)罗兹-哥特里抽脂瓶(见图４-１)。２)１００mL脂肪瓶。３)移液管(２５mL)。３.仪器２.试剂１.原理第一节　乳及乳制品中脂肪的测定４)电热恒温水浴锅。５)电热恒温干燥箱。６)分析天平。图４-１　罗兹-哥特里抽脂瓶第一节　乳及乳制品中脂肪的测定１)乳类脂肪虽然也属游离脂肪，但因脂肪球被乳中酪蛋白钙盐包裹，又处于高度分散的胶体分散系中，故不能直接被乙醚、石油醚提取，需预先用氨水处理，故此法也称为碱性乙醚提取法。２)若无抽脂瓶时，可用容积１００mL的具塞量筒替用，待分层后读数，用移液管吸出一定量醚层。３)加氨水后，要充分混匀，否则会影响下步醚对脂肪的提取。６.说明及注意事项５.结果计算４.操作方法第一节　乳及乳制品中脂肪的测定４)操作时加入乙醇的作用是沉淀蛋白质以防止乳化，并溶解醇溶性物质，使其留在水中，避免进入醚层，影响结果。５)加入石油醚的作用是降低乙醚极性，使乙醚与水不混溶，只抽提出脂肪，并可使分层清晰。６)对已结块的乳粉，用本法测定脂肪，其结果往往偏低。二、巴布科克法和盖勃法(１)硫酸　相对密度为１.８２～１.８２５(２０℃)。２.试剂１.原理第一节　乳及乳制品中脂肪的测定(２)异戊醇　相对密度为０.８１１±０.００２(２０℃)，沸程１２８～１３２℃。１)盖勃氏乳脂计(如图４-２所示)：颈部刻度为０～８.０％，最小刻度值为０.１％。２)巴布科克乳脂瓶(如图４-３所示)：颈部刻度有０～８.０％、１０.０％两种，最小刻度值为０.１％。３)移乳管(１７.６mL，１１mL)。４)乳脂离心机。５)盖勃氏离心机。３.仪器第一节　乳及乳制品中脂肪的测定图４-２　盖勃氏乳脂计第一节　乳及乳制品中脂肪的测定图４-３　巴布科克氏乳脂瓶４.操作方法第一节　乳及乳制品中脂肪的测定(１)盖勃法　在乳脂计中先加入硫酸(相对密度为１.８２～１.８２５)１０mL，沿管壁小心加入鲜乳１１mL，不要使其混合，然后加异戊醇１mL塞上橡胶塞，用力摇动(瓶口向外向下，避免冲出而腐蚀衣物)使其成均匀棕色液体。(２)巴布科克法　以标准移乳管吸取２０℃均匀鲜乳１７.６mL，置入巴布科克氏乳脂瓶中，沿管壁缓缓加入１７.５mL浓硫酸(１５～２０℃)，手持瓶颈回旋，使液体充分混匀，至无凝块并呈均匀的棕色为止。５.说明及注意事项第一节　乳及乳制品中脂肪的测定１)硫酸的浓度要严格遵守规定的要求，如过浓会使乳炭化成黑色溶液而影响读数；过稀则不能使酪蛋白完全溶解，会使测定值偏低或使脂肪层浑浊。２)硫酸除可破坏脂肪球膜，使脂肪游离出来外，还可增加液体相对密度，使脂肪容易浮出。３)盖勃法中所用异戊醇的作用是促使脂肪析出，并能降低脂肪球的面张力，以利于形成连续的脂肪层。４)１mL异戊醇应能完全溶于酸中，但由于质量不纯，可能有部分析出掺入到油层，而使结果偏高。５)加热(６５～７０℃水浴中)和离心的目的是促使脂肪离析。第一节　乳及乳制品中脂肪的测定６)巴布科克法中采用１７.６mL标准吸量管取样，实际上注入巴布科克氏乳脂瓶中的样品只有１７.５mL，牛乳的密度为１.０３ｇ／ｍＬ，故样品质量为１７.５ｍＬ×１.０３ｇ／ｍＬ＝１８g。７)盖勃法所用移乳管为１１mL，实际注入的样品为１０.９mL，样品的质量为１１.２５g，乳脂计刻度部分(０～８％)的容积为１mL，当充满脂肪时，脂肪的质量为０.９g，１１.２５g样品中含有０.９g脂肪，故全部刻度表示脂肪的质量分数为(０.９/１１.２５)×１００％=８％，刻度数即为脂肪含量。第二节　乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定１)亚铁氰化钾溶液：称取１０.６g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至１００mL。２)乙酸锌溶液：称取乙酸锌结晶２１.９g，加３mL冰醋酸，加水溶解并稀释至１００mL。３)费林化液(甲液及乙液)①甲液：称取３４.６３９g硫酸铜(CuSO４·５H２O)，加适量水溶解，加０.５mL浓H２SO４，再加水稀释至５００mL，用精制石棉过滤。２.试剂１.原理第二节　乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定②乙液：称取１７３g酒石酸钾钠与５０g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至５００mL，用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。４)亚甲蓝(次甲基蓝)指示剂：１０g/L，水溶液。５)６mol/L盐酸溶液。６)200g/L氢氧化钠溶液。７)20g/L甲基红-乙醇溶液：取０.２g甲基红，溶于１００mL２０％(体积分数)乙醇溶液中。３.操作方法第二节　乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定(１)样品处理　准确称取３g左右的样品于小烧杯中，用１００mL水分数次溶解并洗入２５０mL容量瓶，慢慢加入醋酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各５mL，轻轻摇动容量瓶。(２)乳糖的测定和计算１)测定①样品溶液预测定：吸取费林甲液、乙液各５.０mL，置于１５０mL锥形瓶中，加水１０mL，加入玻璃珠２粒，控制在２min内沸腾，趁沸以先快后慢的速度滴加样品溶液，待颜色变浅时，加入亚甲蓝指示剂２～３滴，趁沸以０.５滴／ｓ的速度继续滴定至蓝色刚好退去为止。记录消耗样液的体积。第二节　乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定②样品溶液的测定：吸取费林甲液、乙液各５.０mL，置于１５０mL锥形瓶中，加水１０mL，加入玻璃珠２粒，从滴定管加入比粗滴定约少０.５～１mL的样品溶液，加热使之在２min内沸腾，并维持沸腾２min。加入亚甲蓝指示剂２～３滴，趁沸０.５滴／ｓ的速度继续滴定至蓝色刚好退去为止，记录消耗样液的体积。２)结果计算：每１００ｍＬ样液中乳糖的质量(ｍｇ)为：第二节　乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定表４-１　乳糖及转化糖因数表(１０mL费林氏液)第二节　乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定表４-２　乳糖滴定量校正值表第二节　乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定(３)蔗糖的测定和计算１)转化前转化糖的计算：利用测定乳糖时的滴定量，从表４-１中查出相对应的转化糖因子，即可计算出转化前１００ｍＬ样液中转化糖的质量：２)样品溶液的转化和滴定：吸取糖提取液５０mL，置于１００mL容量瓶中，加６mol/L盐酸溶液５mL，在６８～７０℃水浴中加热１５min。３)蔗糖质量分数的计算公式为１)测定乳及乳制品中乳糖及蔗糖的含量也可采用第三章介绍的测还原糖及蔗糖的方法。４.说明及注意事项第二节　乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定２)费林氏甲、乙液要分别配制、分别贮存，临用时按等量混合，以免在碱性溶液中氢氧化铜被酒石酸钾钠缓慢地还原，从而析出少量氧化亚铜，使有效浓度降低。３)本法中费林氏液需用乳糖及蔗糖(分析纯)校正。第三节　乳及乳制品中脲酶的定性测定１)1g/L酚红乙醇液。２)０.０６mol/L磷酸二氢钠：取４.６８ｇNaH２PO４·２H２O溶于５００mL水中。３)０.０６mol/L磷酸氢二钠：取２１.５１gNa２HPO４·H２O溶于１０００mL水中。４)１０％(质量分数)脲素溶液。３.试验步骤２.试剂１.适用范围第四节　乳及乳制品中亚硝酸盐的测定(１)亚铁氰化钾溶液　称取１０６g亚铁氰化钾［K４Fe(CN）６·３H２O］，溶于水并稀释至１０００mL。(２)乙酸锌溶液　称取２２０g乙酸锌［Zn(CH３COO）２·２H２O］，加３０mL冰醋酸溶解，用蒸馏水稀释至１０００mL。(３)饱和硼砂溶液　称取５g硼酸钠(Na２B４O７·１０H２O)溶于１００mL热水中，冷却后备用。２.试剂１.原理第四节　乳及乳制品中亚硝酸盐的测定(４)4g/L对氨基苯磺酸溶液　称取０.４g对氨基苯磺酸，溶于１００mL２０％(体积分数)盐酸中，避光保存。(５)2g/L盐酸萘乙二胺溶液　称取０.２g盐酸萘乙二胺，以水稀释至１００mL，避光保存。(６)亚硝酸钠标准液　精密称取０.１０００g亚硝酸钠(事先于硅胶干燥器中干燥２４h)，用重蒸馏水溶解并定容至５００mL。(７)亚硝酸钠标准使用液　吸取标准液５.００mL于２００mL容量瓶中，用重蒸馏水定容。第四节　乳及乳制品中亚硝酸盐的测定１)分光光度计。２)５０mL比色管。(１)样品处理　称取５.０g混匀的样品置于５０mL烧杯中，加１２.５mL硼砂饱和液，搅拌均匀；以３００mL　７０℃的水将样品洗入５００mL容量瓶中，于沸水浴中加热１５min，取出后冷却至室温；然后边转动边加入５mL亚铁氰化钾溶液，摇匀；再加入５mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质；加水至刻度，摇匀，放置３０ｍｉｎ，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液３０mL，所得滤液备用。４.测定方法３.仪器第四节　乳及乳制品中亚硝酸盐的测定(２)标准曲线绘制　吸取０.００、０.２０ｍＬ、０.４０ｍＬ、０.６０ｍＬ、０.８０ｍＬ、１.００ｍＬ、１.５０ｍＬ、２.００ｍＬ、２.５０mL亚硝酸钠标准使用液，分别置于５０mL比色管中，加入２.０mL4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀；静置３～５min后，各加入１.０mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀；静置１５min，用２cm比色皿，以空白调零，于分光光度计５３８nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。(３)试样测定　吸取４０mL样品处理液置于５０mL比色管中，其余操作同标准曲线的绘制。５.结果计算第五节　乳及乳制品中硝酸盐的测定１)氨缓冲液(pH＝９.６～９.７)：量取２０mL浓盐酸加５０mL水，混匀后加５０mL氨水，用水稀释至１０００mL。２)稀氨缓冲液：取５０mL氨缓冲液，用水稀释５００mL。３)０.１mol/L盐酸：取５mL浓盐酸加水稀释至６００mL。２.试剂１.原理第五节　乳及乳制品中硝酸盐的测定４)硝酸钠标准液：准确称取０.１２３２g硝酸钠(已于１１０～１２０℃干燥恒重)，加水溶解，移于５００mL容量瓶中，并定容。５)硝酸钠标准使用液：吸取标准液２.５０mL置于１００mL容量瓶中，加水定容。６)亚硝酸钠标准使用液：同亚硝酸盐测定。７)其他同亚硝酸盐测定。１)镉柱３.仪器第五节　乳及乳制品中硝酸盐的测定①海绵状镉的制备：投入足够的锌皮或锌棒于500mL20%(体积分数)硫酸镉溶液中，经3～4h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌皮，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾泻法多次洗涤，然后移入组织捣碎机中，加500mL水，捣碎约2s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20～４０目之间的部分。第五节　乳及乳制品中硝酸盐的测定②镉柱的装填(如图4-4)：用水装满镉柱玻璃管，并装入2cm高的玻璃棉作垫，将玻璃棉压向柱底时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下加入海绵状镉至8～10cm高，上面用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗，末端要穿过橡胶塞与镉柱玻璃管紧密连接。如无上述镉柱玻璃管时，可用25mL酸式滴定管代用。③镉柱每次使用完毕后，应先以25mL0.1mol/L盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25mL，最后用水覆盖镉柱。２)分光光度计。３)５０mL比色管。第五节　乳及乳制品中硝酸盐的测定图４-４　镉柱装填1—贮液漏斗(内径35mm，外径37mm)　2—进液毛细管(内径0.4mm，外径6mm)3—橡胶塞　4—镉柱玻璃管(内径12mm，外径16mm)5、7—玻璃棉　6—海绵状镉　8—出液毛细管(内径2mm，外径8mm)第五节　乳及乳制品中硝酸盐的测定(１)样品处理　同亚硝酸盐测定。(２)镉柱还原效率的测定　先以２５mL稀氨缓冲液冲洗镉柱，流速控制在３～５mL／min。(３)标准曲线的绘制　同亚硝酸盐测定。(４)试样中亚硝酸盐质量的测定４.测定方法第五节　乳及乳制品中硝酸盐的测定１)样液的还原：吸取２０mL样品处理液置于５０mL烧杯中，加５mL氨缓冲液，混匀后注入贮液漏斗，使其流经镉柱还原，以下按镉柱还原效率测定操作进行，收集还原后样液于１００mL容量瓶，并定容。２)吸取１０～２０mL还原后的样液置于５０mL比色管中，以下按镉柱还原效率的测定操作进行，测定吸光度，从标准曲线上查出亚硝酸盐的质量。(５)亚硝酸盐的测定　吸取４０mL未经镉柱还原的样品处理液置于５０mL比色管中，按镉柱还原效率测定操作进行，测定吸光度，从标准曲线上查出亚硝酸盐的质量。５.结果计算第五节　乳及乳制品中硝酸盐的测定１)镉是有害元素之一，在制作海绵状镉或处理镉柱时，不要用手直接接触，同时注意不要弄到皮肤上，一旦接触应立即用水冲洗。２)样品处理中饱和硼砂液、亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂。６.说明第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定１)烧杯：４００ｍＬ或６００mL高脚型。２)过滤用坩埚：玻璃滤板，孔径为４０～６０μm，容量为６０mL。３)真空装置：真空泵或抽气机；１L厚壁抽滤瓶；与抽滤瓶相配套的橡胶圈。４)振荡水浴箱：自动控温使温度能保持在(９８±２)℃；恒温控制在６０℃。５)天平：分析级，精确至±０.１mg。３.仪器２.适用范围１.原理第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定６)马弗炉：温度控制在(５２５±５)℃。７)干燥箱：温度控制在１０５℃和(１３０±３)℃。８)干燥器：用二氧化硅或同等的干燥剂。９)ｐＨ计：注意温控，用pH值为４.０、７.０和１０.０缓冲液标化。１０)移液管及套头：容量为１００μＬ和５mL。１１)分配器或量筒：(１５±０.５)mL(供分配７８％(体积分数)的乙醇、９５％(体积分数)的乙醇以及丙酮)；(４０±０.５)mL(供分配缓冲液)。１２)磁力搅拌器和搅拌棒。４.试剂第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定１)乙醇溶液：８５％(体积分数)(取８９５mL９５％(体积分数)乙醇于１L量筒中，用水稀释至刻度)；７８％(体积分数)(取８２１mL９５％(体积分数)乙醇于１L量筒中，用水稀释至刻度)。２)丙酮。３)供分析用酶，在０～５℃下储存。①热稳定α-淀粉酶溶液：Cat.No.A３３０６，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO６３１７８，或Termamyl３００L，Cat.No.３６１-６２８２，Novo-Nordisk，Bagsvaerd，Denmark，或等效的酶。第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定②蛋白酶：Cat.No.P３９１０，SigmaChemicalCo.，或等效的酶。当天用MES/TRIS缓冲液现配５０mg/mL酶溶液。③淀粉葡糖苷酶溶液：Cat.No.AMGA９９１３，SigmaChemicalCo.，或等效的酶。４)硅藻土：酸洗(Celite５４５AW，No.C８６５６，SigmaChemicalCo.，或等效的成分)。５)洗涤液：铬酸洗液或试验室用液体清洁剂。６)MES-TRIS缓冲液：０.０５mol/L，２４℃时pH值为８.２。第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定①MES：２-(N-吗啉代)磺酸基乙烷(No.M-８２５０，SigmaChemicalCo.或等效的成分)。②TRIS：三羟(羟甲基)氨基甲烷(No.T-１５０３，SigmaChemicalCo.或等效的成分)。７)盐酸溶液(０.５６１mol/L)：取９３.５mL６mol/L盐酸于７００mL水中，用水稀释至１L。(１)样品制备　固体样品粒度大于０.５mm，研磨后过４０～６０目筛(孔径为０.４５～０.２８ｍｍ)；高脂肪样品脂肪的质量分数大于１０％，用石油醚去脂。(２)样品消化５.操作方法第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定１)准确称取两份(１.０００±０.００５)g样品(m１和m２)，置于高脚烧杯中。２)在每个烧杯中加入４０mLMES-TRIS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌直至样品完全分散，(防止团块形成，使受试物与酶能充分接触)。３)用热稳定的淀粉酶进行酶解处理：加１００μL热稳定的淀粉酶溶液，低速搅拌。４)冷却：将所有烧杯从水浴中移出，冷却至６０℃打开铝箔盖，用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离，以使样品能够完全地酶解。第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定５)用蛋白酶进行酶解处理：在每个烧杯中各加入１００μL蛋白酶溶液。６)pH值的测定：３０ｍｉｎ后，打开铝箔盖，搅拌中加入５mL０.５６１mol/LHCL至烧杯中。７)用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理：搅拌同时加１００μL淀粉葡糖苷酶溶液。(３)测定１)总膳食纤维的测定①用乙醇沉淀膳食纤维：在每份样品中，加入预热至６０℃的９５％(体积分数)乙醇２２５mL，乙醇与样品的体积比为４∶１，室温下沉淀１ｈ。第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定②过滤装置：用１５mL７８％(体积分数)乙醇将硅藻土湿润并重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。③酶解过滤：用７８％(体积分数)乙醇和刮勺将所有物微粒移至坩埚中(注意：如果一些样品形成胶质，可用刮勺破坏其表面，以加速过滤)。第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定④分别用１５mL的７８％(体积分数)乙醇、９５％(体积分数)乙醇和丙酮冲洗残渣各２次，将坩埚内的残渣抽干后在１０５℃下烘干过夜。将坩埚置于干燥器中冷却至室温并称重。坩埚的质量，包括膳食纤维残渣和硅藻土的质量(精确称至０.１mg)，减去坩埚和硅藻土的质量，即可计算出残渣的质量。⑤蛋白质和灰分的测定：取成对样品中的一份测定蛋白质，用凯氏定氮法测定。２)不溶性膳食纤维的测定第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定①称适量样品进行酶解，过滤前用３mL水将硅藻土湿润并重新分布在预先处理好的坩埚上，保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。②过滤并冲洗烧杯，用１０mL７０℃水冲洗残渣２次，然后再过滤并用水冲洗，转移至６００mL高脚烧杯中，保留用以测定可溶性膳食纤维。③分别用１５mL７８％(体积分数)乙醇、９５％(体积分数)乙醇和丙酮各冲洗残渣２次(注意：应及时用７８％(体积分数)乙醇、９５％(体积分数)乙醇和丙酮冲洗残渣，否则会导致不溶性膳食纤维数值的增大)。④用双份样品测定蛋白质和灰分的质量。第六节　乳及乳制品中膳食纤维的测定３)可溶性膳食纤维的测定①将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到６００mL高脚烧杯中，对比烧杯和滤出液，估计容积。②加约为滤出液４倍量并已预热至６０℃的９５％(体积分数)乙醇，或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混合液调至８０g，再加入预热至６０℃的９５％(体积分数)乙醇３２０mL。③室温下沉淀１ｈ，其他操作同总膳食纤维的测定步骤②～⑤。６.结果计算第七节　乳及乳制品中非脂乳固体的测定１)２号或３号砂芯漏斗：洗净，在１００℃烘箱中干燥后冷却，称重。２)电热恒温干燥箱。３)分析天平。３.操作方法２.仪器１.试剂４.结果计算第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定一、乳及乳制品中霉菌、酵母菌的测定(１)采样　选取有代表性的样品并避免采样时的污染。(２)样品处理１)以无菌操作称取检样２５g(或２５mL)，放入盛有２２５mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇３０min，即为１∶１０稀释液。４.操作步骤３.检验程序２.培养基和试剂１.设备和材料第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定２)用灭菌吸量管吸取１∶１０稀释液１０mL，注入试管中，另用带橡胶乳头的１mL灭菌吸量管反复吹吸５０次，使霉菌孢子充分散开。３)取１mL１∶１０稀释液注入含有９mL灭菌水的试管中，另换一支１mL灭菌吸量管吹吸５次，此液为１∶１００稀释液。４)按上述操作顺序做１０倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支１mL灭菌吸量管。(３)接种培养　根据对样品污染情况的估计，选择３个合适的稀释度，分别在做１０倍稀释的同时，吸取１mL稀释液置于灭菌平皿中，每个稀释度做２个平皿，然后将冷却至４５℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于２５～２８℃温箱中，３天后开始观察，共培养观察５天。第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定(４)计算方法　通常选择菌落数在１０～１５０之间的平皿进行计数，一个稀释度使用两个平板，采用两个平板的平均数；选择稀释度也选择平均菌落数在１０～１５０之间的稀释度，菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)检样中所含霉菌和酵母菌的菌落总数。二、乳及乳制品中乳酸菌的测定１)改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)(见附录K)。１.培养基和试剂第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定２)改良MC培养基(ModifiedChalmers培养基)(见附录K)。３)1g/L美蓝牛乳培养基(见附录K)。４)65g/L氯化钠肉汤(见附录K)。５)pH＝９.６葡萄糖肉汤(见附录K)。６)４０％(体积分数)胆汁肉汤(见附录K)。７)淀粉水解培养基(见附录K)。８)精氨酸水解培养基(见附录K)。９)七叶苷培养基(见附录K)。１０)革兰氏染色液(见附录K)。１１)３％(质量分数)过氧化氢溶液。第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定１２)蛋白胨水、靛基质试剂。１３)明胶培养基。１４)硝酸盐培养基、硝酸盐试剂。１５)０.８５％(质量分数)灭菌生理盐水。１)无菌吸量管(２５mL、１mL、１０mL)。２)无菌三角瓶(带玻璃珠)。３)无菌试管。４)灭菌平皿：直径９０mm。５)旋涡均匀器。６)恒温培养箱：３６℃±１℃。２.仪器和器具第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定７)恒温水浴锅：４６℃±１℃。８)显微镜：１０×～１００×。９)冰箱：０～４℃。１０)灭菌刀、剪子、镊子。１１)架盘药物天平：O～５００g，精确至０.５g。３.检验程序(见图４-５)第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定图４-５　检验程序４.操作步骤第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定１)以无菌操作将经过充分摇匀的检样２５mL(g)放入盛有２２５mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成１∶１０的均匀稀释液。２)用１mL灭菌吸量管吸取１∶１０稀释液１mL，沿管壁徐徐注入含有灭菌生理盐水的试管内(注意吸量管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀。３)另取１mL灭菌吸量管，按上述操作顺序，做１０倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用１支１mL灭菌吸量管。第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定４)选择２～３个以上适宜稀释度，分别在做１０倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸量管移１mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。５)稀释液移入平皿后，应及时将１５ｍＬ冷却至５０℃的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿，并转动平皿使其混合均匀。６)待琼脂凝固后，翻转平板，置于３６℃±１℃温箱内培养７２h±３h，观察乳酸菌菌落特征(见表４-３)，选取菌落数在３０～３００之间的平板进行计数。７)乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征具体见表４-３。第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定表４-３　乳酸菌在不同培养基上的菌落特征(１)菌种制备　自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于３６℃±１℃，２４～４８h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。５.乳酸菌的鉴定第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定(２)乳酸杆菌鉴定试验　极少见还原硝酸盐、不液化明胶、不产生靛基质和硫化氢的乳酸杆菌。(３)常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应(见表４-４)。表４-４　常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应(４)产乳酸的链球菌的鉴别试验(见表４-５)。第八节　乳及乳制品中霉菌、酵母菌、乳酸菌的测定表４-５　产乳酸的链球菌的鉴别表第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例(１)仪器　罗紫-哥特里抽脂瓶、１００mL脂肪瓶、移液管　(２５mL)、电热恒温水浴锅、电热恒温干燥箱、分析天平、吸量管(２mL、１０mL)。(２)试剂　乙醚、沸程为３０～６０℃的石油醚、９５％(体积分数)乙醇、浓氨水。１)数据记录：将试验数据填入下表。３.数据记录及处理２.操作步骤１.仪器及试剂第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例表格２)按式(４-１)计算乳粉中脂肪的质量分数。(１)仪器　２５０mL容量瓶、５０mL酸式滴定管、可调电炉、５mL吸量管。(２)试剂　１０６g／L亚铁氰化钾溶液、２１９g/L乙酸锌溶液、标定好的费林氏液(甲液及乙液)、１mg/mL乳糖标准溶液。１.仪器及试剂第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例(１)样品处理　准确称取０.７～０.８g乳粉样品，置于２５０mL容量瓶中，加５０mL水，摇匀后慢慢加入５mL乙酸锌及５mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置０.５h。(２)样液预测　吸取已用乳糖标定好的碱性酒石酸铜甲液及乙液各５.００mL，置于２５０mL锥形瓶中，加水１０mL，加玻璃珠３粒，使其在２min内加热至沸。２.操作步骤第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例(３)样液测定　吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各５.００mL，置于２５０mL锥形瓶中，加玻璃珠３粒，从滴定管中加入比预测体积少１mL的样品液，使其在２min内加热至沸。１)数据记录：将试验数据填入下表中。表格２)按下式计算乳粉中乳糖的质量分数。１.仪器及试剂３.数据记录及处理第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例(１)仪器　分光光度计、５０mL比色管、吸量管(１mL、２mL、５mL)。(２)试剂　１０６g/L亚铁氰化钾溶液、２２０g/L乙酸锌溶液、饱和硼砂溶液、4g/L对氨基苯磺酸溶液、2g/L盐酸萘乙二胺溶液、５μg／mL亚硝酸钠标准使用液。２.操作步骤第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例(１)样品处理　称取５.０g乳粉，置于５０mL烧杯中，加１２.５mL硼砂饱和液，搅拌均匀，以３００mL７０℃的水将样品洗入５００mL容量瓶中，于沸水浴中加热１５min，取出后冷却至室温，然后边转动边加入５mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入５mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。(２)标准曲线绘制　吸取０.００、０.２０ｍＬ、０.４０ｍＬ、０.６０ｍＬ、０.８０ｍＬ、１.００ｍＬ、１.５０ｍＬ、２.００mL亚硝酸钠标准使用液(相当于０、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、７.５μｇ、１０μg亚硝酸钠)，分别置于５０mL比色管中。第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例(３)试样测定　吸取４０mL样品处理液置于５０mL比色管中，其余操作同标准曲线的绘制。１)数据记录①将测定的吸光度填入下表中。表格②将两次平行测定数据填入下表中。３.数据记录及处理第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例表格２)以各标准液中的亚硝酸钠质量为横坐标，测得各标准液的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。３)按下式(４-９)计算乳粉中亚硝酸盐的含量。１.仪器及试剂第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例(１)仪器　无菌吸量管(２５mL、１mL、１０mL)、无菌三角瓶(带玻璃珠)、无菌试管、无菌培养皿、旋涡均匀器、恒温培养箱、恒温水浴锅、冰箱、灭菌刀、剪、镊子、架盘药物天平。(２)试剂　改良TJA培养基、改良MC培养基、1g/L美蓝牛乳培养基、65g/L氯化钠肉汤、pH＝９.６的葡萄糖肉汤、４０％(体积分数)胆汁肉汤、淀粉水解培养基、精氨酸水解培养基、七叶苷培养基、革兰氏染色液、３％(质量分数)过氧化氢溶液、蛋白胨水、靛基质试剂、明胶培养基、硝酸盐培养基、硝酸盐试剂、０.８５％(质量分数)灭菌生理盐水。第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例１)以无菌操作将经过充分摇匀的检样２５mL(g)放入含有２２５mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成１∶１０的均匀稀释液。２)用１mL灭菌吸量管吸取１∶１０稀释液１mL，沿管壁徐徐注入含有灭菌生理盐水的试管内(注意吸量管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，使其混合均匀。３)另取１mL灭菌吸量管，按上述操作顺序，做１０倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用１支１mL灭菌吸量管。２.操作步骤第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例４)选择２～３个以上适宜稀释度，分别在做１０倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸量管移１mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。５)稀释液移入平皿后，应及时将１５ｍＬ冷却至５０℃的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿，并转动平皿使其混合均匀。６)待琼脂凝固后，翻转平板，置于３６℃±１℃温箱内培养７２h±３h，观察乳酸菌菌落特征(见表４-３)，选取菌落数在３０～３００之间的平板进行计数。１)将各稀释平板上的菌落数填入下表。３.数据记录及处理第九节　乳及乳制品的检验技能训练实例表格２)根据试验结果及参考第三章第四节、一、６“菌落计数报告”报告检验结果：