英语演讲稿-Presentation中的衔接句

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)申请公布号CN112680364A(43)申请公布日2021.04.20(21)申请号202110104706.2A01G18/20(2018.01)(22)申请日2021.01.26B09B3/00(2006.01)C12R1/645(2006.01)(83)生物保藏信息CGMCCNo.210792020.12.02(71)申请人方荣俊地址212018江苏省镇江市中国农业科学院（江苏科技大学）蚕业研究所(72)发明人方荣俊　陈玉莲　(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人唐循文(51)Int.Cl.C12N1/14(2006.01)A01G18/00(2018.01)A01G18/40(2018.01)权利要求1页说明书9页附图4页(54)发明名称一株来自鬼桑的桑树桑黄菌株及其应用(57)摘要一株来自鬼桑的桑树桑黄菌株及其应用，已于2020年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21079。该菌株同时适合在普通PDA或桑叶粉为基质的培养基培养。菌丝在普通PDA培养基或桑叶粉培养基中生长具有生长快、产量高、异常牢固，易于将整块菌丝体从培养基直接分离而无残留、不变异、不易老化、质量稳定等优点，非常适合用普通PDA培养基或桑叶粉培养基常年工厂化生产桑树桑黄菌丝体，培养基配制简单，成本低廉，无需特定设备及复杂的培养环境条件。CN112680364ACN112680364A权　利　要　求　书1/1页1.一株来自鬼桑的桑树桑黄菌株（Sanghuangporus sanghuang）野桑元1号，已于2020年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21079。2.权利要求1所述来自鬼桑的桑树桑黄菌株在以PDA培养基或桑叶粉培养基直接生产菌丝体中的应用。3.权利要求1所述来自鬼桑的桑树桑黄菌株在以纯桑枝为原料进行子实体培养中的应用。4.权利要求1所述来自鬼桑的桑树桑黄菌株在蚕桑生产废弃物处理利用中的应用。5.蚕桑生产废弃物处理组合物，其特征在于有效成分为权利要求1所述来自鬼桑的桑树桑黄菌株。2CN112680364A说　明　书1/9页一株来自鬼桑的桑树桑黄菌株及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株来自鬼桑的桑树桑黄菌株及其应用。背景技术[0002]桑黄(Sanghuangporus sanghuang)，是一种寄生于桑树(Morus L)上的的黄色无柄蕈类，是目前国际上公认的抗癌效率最好的药用真菌之一(Tetsuro IKEKAWA等，1968，《Antitumoraction of some Basidiomycetes,especially PHllinus linteus》)，素有“森林黄金”的美称。[0003]近二十年来，桑黄以其卓越的药用价值，越来越受到美日韩等国及国内研究人员的重视。然而，随着桑黄热的兴起，围绕桑黄的应用及研究却仍然比较混乱。[0004]在桑黄应用方面，由于真正的桑黄(桑树桑黄)极为稀少，世人极少见过，人们往往将各种长在桑树以外其他树种上的黄色无柄蕈类误认为是桑黄。一些商家出于商业利益的考虑，将形状各异、无任何桑树属性的黄色无柄蕈类当作桑黄售卖，价格昂贵，消费者难以辨认，逐渐引起市场混乱。[0005]在桑黄研究方面，桑黄的菌属分类也长期存在认知的争议，是药用真菌中少见的(吴声华等，2020《，药用真菌桑黄的种类解析》)。直到2016年，中国台湾学者研究发现，桑黄及相近种类既不属于纤孔菌属，也不属于木层孔菌属，而是一个独立的新属——桑黄孔菌属 (Sanghuangporus)，并认为桑黄孔菌属有12个属内种。至2020年，桑黄孔菌属的属内种扩增至14个，包括除桑树桑黄外的杨树桑黄、暴马丁香桑黄、漆树桑黄等(吴声华等，2016，《桑黄的分类及开发前景》；Sheng‑Hua Wu等，2019，《Sanghuangporus toxicodendri sp.nov. (Hymenochaetales,Basidiomycota)from China》；吴声华等，2020《，药用真菌桑黄的种类解析》)，它们以“桑”冠名，并不是他们长在桑树上，而是它们属于是桑黄孔菌属，和真正的桑黄(桑树桑黄)是近缘物种。真正能简称“桑黄”的，只有桑树桑黄一种，即真正的桑黄仅一种——桑树桑黄；桑树桑黄与生长的树种具有专一性，只长在桑树树干上(吴声华等，2016《，桑黄的分类及开发前景》；吴声华等，2020《，药用真菌桑黄的种类解析》)。因此，确认真正的“桑黄”，第一个条件是看菌株是否来自于桑树。[0006]然而，寄生于桑树的黄色无柄蕈类并非都是桑树桑黄。目前所发现的着生于桑树的黄色无柄蕈类除了正宗桑树桑黄外，还有一种是粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus)，分布在华北、山东及新疆等地区。粗毛纤孔菌的新鲜子实体质地较软，质量轻，易撕裂，干燥后较脆，易于人工培养，但却没有特别好的药效(吴声华等，2016《，桑黄的分类及开发前景》)。粗毛纤孔菌属于纤孔菌属(Inonotus)，一般不将其认定为桑树桑黄，原因是粗毛纤孔菌的广泛寄主并非桑树，却是豆科、蔷薇科、木犀科(如水曲柳)、胡桃科(如核桃楸)等阔叶树种，对寄主树种的专一性不强，并且为一年生(昝立峰等，2011《，粗毛纤孔菌的研究进展》；吴声华等，2020《，药用真菌桑黄的种类解析》)。因此，确认真正的“桑黄”，第二个条件是看菌株是否属于桑黄孔菌属。[0007]总之，只有野外专一性寄生于桑树、在分类上属于桑黄孔菌属的黄色无柄子实体，3CN112680364A说　明　书2/9页才算是正宗的桑黄，即桑树桑黄。[0008]尽管如此，在2012年前，却没有任何学术记载及标本馆标本显示中国境内有长在桑树上的桑黄真菌(吴声华等，2020《，药用真菌桑黄的种类解析》)。因此，在2012年前的诸多文献中所述的桑黄，很难让人确信其是否为来源于桑树的桑黄。迄今为止，国内外诸多文献也极少能提供让人信服的真正长在桑树上的桑黄子实体生境图片。造成上述混乱的原因之一，是桑树桑黄的稀缺性，极少有人见过真正的桑树桑黄。[0009]目前，中日韩等国市面上的所谓栽培桑黄，大都是杨树桑黄(杨树黄，杨黄)，也有一部分是暴马丁香桑黄及其他杂黄，并非桑树桑黄。原因是由于真正的桑树桑黄菌种难以获得、目前仍然难以人工培养(吴声华等，2016《，桑黄的分类及开发前景》；吴声华等，2020，《药用真菌桑黄的种类解析》)。[0010]以菌丝体大量培养，可在一定程度上代替子实体培养。桑黄菌丝体的几项有效成分及功效的试验结果并不输给子实体，菌丝体产品生长快速、成本低、质量稳定、效果良好，是桑黄产业的一个方向(吴声华等，2016《，桑黄的分类及开发前景》)。菌丝体发酵培养是桑黄菌丝生产的一种方法，但发酵培养需要一定的设备、特定的培养基，生产成本高，工序繁琐，对环境要求严苛。同时，由于菌种的遗传因素，以及菌种在培养、操作等环节的外界因素，桑黄菌种在经过多次无性繁殖和其他条件影响下，常常出现老化、退化、变异现象，即多次接种后菌丝往往生长变慢、变细、变稀疏，培养的桑黄子实体出现变小、畸形等。桑黄菌种这种保藏困难，易变异的特点，往往需要配置特定的培养基、定期复壮或重新从子实体分离菌种，才能保持菌种原有特征。[0011]因此，亟需获得一种来自于桑树、在分类上属于桑黄孔菌属的真正的桑树桑黄菌种。在此基础上，该菌种需易于培养、易于保存、不易变异、质量稳定，适合以菌丝体大量培养。更进一步的，该菌株需同时适合以桑枝为原料进行子实体培养。只有具备上述特点的桑树桑黄菌株，才能真正助力于桑黄的诸多研究、应用及蚕桑综合利用，有助于摆脱我国桑黄产业目前的困境。发明内容[0012]解决的技术问题：本发明提供一种适合以普通PDA培养基或桑叶粉培养基直接生产菌丝体，同时适合以纯桑枝为原料培养子实体的桑树桑黄菌株及其应用。[0013]技术：一株来自鬼桑的桑树桑黄菌株野桑元1号，已于2020年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.21079。[0014]本发明所述的桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)菌株，在分类上属锈革孔菌科 (Hymenochaetaceae)、桑黄孔菌属(Sanghuangporus Sheng H.Wu,L.W.Zhou&Y.C.Dai)的桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)。该菌株是从一株鬼桑(Morus mongolica C.K.Schneid.var. diaobolica Koidz.，鬼桑为桑树的桑种之一，是蒙桑的变种，属野生类型，而非栽培类型桑树) 树干上的桑树桑黄子实体分离获得，经逐代筛选、驯化，命名为野桑元1号。[0015]本发明桑树桑黄菌株野桑元1号的特征在于：[0016]1、菌丝形态特征4CN112680364A说　明　书3/9页[0017]菌丝在普通PDA培养基(每升培养基所用去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH 值自然)上生长，有如下特征：[0018](1)菌丝形态和色泽：菌丝绒毛状，菌落质地呈毡状，表面平整、均匀，无晕圈；菌丝能分泌大量黄色色素，色泽金黄。[0019](2)菌丝微观特征：PDA培养基插片观察，发现桑树桑黄菌丝在呈簇状生长，分枝众多。显微镜下可见多条细嫩菌丝绞合呈“绳”状的菌丝束，初生菌丝从成串的菌丝束向四周延伸。菌丝无锁状联合，直径1.58～7.23μm。初生菌丝纤长，有分枝，无分隔，菌丝无色透明，顶端钝圆。老熟菌丝呈金黄色，偶尔可见分隔，常见囊泡状结构和异常粗大的金黄色菌丝(直径4.68～7.23μm)。[0020]2、生物学特征[0021](1)生长条件[0022](a)生长温度：野桑元1号的菌丝在普通PDA培养基内最适宜生长温度为28℃。[0023](b)PH值的适应特征：野桑元1号菌丝在PH值6.0‑8.8的PDA培养基中均能正常生长，长期用PH值6.0‑8.8的PDA培养基保存菌种，未发现桑树桑黄菌种有任何退化、变异等现象，无需复壮，即能用纯桑枝制作子实体菌袋(除桑枝和水分外无任何添加物质)顺利培养出桑树桑黄子实体。[0024](2)适合在普通PDA培养基中生长[0025](a)菌丝生长快：在28℃黑暗条件下，菌丝在上述普通PDA培养基上菌落生长速度约为2.65mm/d，用灭菌后的打孔器挑取面积0.25cm2的菌丝块，置于直径9cm的培养皿(内含 20mL的PDA培养基)，在上述条件下生长25d后，菌丝体平均鲜重达3.387g。[0026](b)菌丝体异常牢固：在上述普通PDA培养基28℃培养25d以上，由于菌丝异常牢固，很难用镊子从中间挑取小块菌丝，但可轻易将整块菌丝体从PDA培养基分离，并且整块菌丝体不易撕裂；在普通PDA培养基中无基内菌丝，菌丝体整体分离后培养基中无残留。[0027](c)不变异、不退化：在普通的PDA培养基上反复转接培养，5年内没有发现任何颜色、性状的改变，菌种转接到纯桑枝制作的子实体菌袋(除桑枝和水分外无任何添加物质) 后，仍然能顺利诱导出子实体，故该菌株无需复壮或重新从子实体分离。[0028](d)不易老化：在普通PDA培养基28℃培养，40d内不会老化，培养55d以上，仅有极少褐色菌丝出现。[0029]野桑元1号具备的上述特征，使其非常适合以普通PDA为培养基，直接大规模生产菌丝体。[0030](3)适应桑叶粉培养基[0031]称取市售干桑叶粉，加水，使含水率达60％。搅拌均匀后，培养基PH＝7.0，每个50mL 的锥形瓶底部平摊4g(湿重)培养基，高温高压灭菌后制作成桑叶粉培养基。用灭菌后的打孔器挑取面积0.25cm2的菌丝块，转入桑叶粉培养基中28℃黑暗培养。[0032]野桑元1号能很快适应桑叶粉培养基，在转接的第2天即可观察到菌丝开始启动生长；转接7d内，可覆盖培养基表面，平均生长速度为3.57mm/d；生长至第25d，平均鲜重达3.370 g，与在普通PDA培养基中第25d产量(鲜重3.387g)接近，菌丝由嫩黄转为金黄色，菌丝体也同样牢固，便于将菌丝体从培养基分离；菌丝体在上述桑叶粉培养基生长55d内，保持不老化。5CN112680364A说　明　书4/9页[0033]长期用桑叶粉培养基人工培养、保存该菌种，至今5年内未发现有任何退化、变异等现象，菌株无需复壮，即能用纯桑枝制作子实体菌袋(除桑枝和水分外无任何添加物质)顺利培养出桑树桑黄子实体。表明野桑元1号适合在桑叶为基质的培养基生长，能有效利用桑叶中的营养成分。因此，野桑元1号同样适合以桑叶粉为培养基，大规模生产菌丝体。[0034]由于桑叶来源广泛，成本低，桑叶粉培养基配置容易，野桑元1号在桑叶粉培养基中培养，可进一步降低大规模工厂化生产成本。[0035](4)子实体培养特性[0036]将野桑元1号菌种转接到以桑树枝条为袋料的菌种袋(仅含桑树枝条和水分，无任何添加物，高温高压灭菌制作而成)，28℃培养。菌丝长满菌袋后开口，开口20d后，子实体厚度可达2.5cm左右，子实体密度较大，平均达0.5208g/cm3(鲜重)。[0037]桑树桑黄菌株野桑元1号具备的上述生物学特征，非常适合直接利用普通PDA培养基或桑叶粉培养基大规模生产菌丝体，同样适合以桑树枝条为原料大规模生产子实体，开展蚕桑生产废弃物的综合利用与研究。[0038]3、遗传学特征[0039]本发明桑树桑黄菌株野桑元1号子实体DNA，经核糖体基因rDNA内转录间隔区(internaltranscribed spacer,ITS)序列设计的通用引物对ITSl/ITS4进行PCR扩展，获得757bp的片段。[0040]上述序列经过比对，野桑元1号的ITS序列与GenBank中查得与桑黄孔菌属类群 (Sanghuangporus)的ITS序列相似性最高，聚为一类。野桑元1号是一株在分类上属于锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、桑黄孔菌属(Sanghuangporus)的桑树桑黄(Sanghuangporussanghuang)菌株。[0041]有益效果：本发明首次从野生类型的桑树(鬼桑)分离到桑树桑黄菌株，经逐级筛选、驯化，获得了一株桑树桑黄菌株，命名为野桑元1号。该菌株同时适合在普通PDA或桑叶粉为基质的培养基培养。菌丝在普通PDA培养基或桑叶粉培养基中生长具有生长快、产量高、异常牢固，易于将整块菌丝体从培养基直接分离而无残留、不变异、不易老化、质量稳定等优点，非常适合用普通PDA培养基或桑叶粉培养基常年工厂化生产桑树桑黄菌丝体，培养基配制简单，成本低廉，无需特定设备及复杂的培养环境条件。该菌株同样适合以纯桑枝为原料进行子实体培养，由于桑树枝条属于蚕桑生产的废弃物，故该菌株可应用于蚕桑生产废弃物的综合利用与研究。因此，该菌株在生产和研究中具有广阔的应用前景。附图说明[0042]图1为野桑元1号寄生的鬼桑的叶片及雌花(箭头所指为绒毛，刺芒或花柱)。A,鬼桑带绒毛的叶背及具刺芒的叶缘；B,鬼桑带绒毛和长花柱的雌花(未成熟)。[0043]图2为野桑元1号菌丝微观特征。A,菌丝在PDA培养基中插片生长状态观察；B,“绳”状的菌丝束；C,初生菌丝(箭头所指为分枝)；D,老熟菌丝(箭头所指为横隔)；E,菌丝的囊泡状结构；F,异常粗大的菌丝。[0044]图3为7种菌丝体在PDA培养基中28℃生长25d的鲜重。相同字母组别表示差异不显著，不同字母的组别表示具有显著差异(P<0.05)。[0045]图4为杨树桑黄和野桑元1号菌丝体在PDA培养基中28℃生长25d的状态。A,杨树桑6CN112680364A说　明　书5/9页黄出现老化“吐水”现象；B,野桑元1号菌丝体在PDA培养基中生长状态；C,野桑元1号菌丝体从PDA培养基揭下后摊晾；D,以野桑元1号的菌丝体为原料生产的超细粉。[0046]图5为各种菌种在桑叶粉培养基28℃条件下的生长状态。A,转接7d；B,转接12d。1.漆树桑黄，2.松树桑黄，3.暴马桑黄，4.槭树桑黄，5.栎树桑黄，6.杨树桑黄，7.桑树桑黄(野桑元1号)。[0047]图6为纯桑枝袋料培养的野桑元1号子实体(开口20d)。[0048]图7为7种菌种在袋料中的子实体密度。相同字母组别表示差异不显著，不同字母的组别表示具有显著差异(P<0.05)。[0049]图8为野桑元1号与桑黄孔菌类群的系统进化关系。具体实施方式[0050]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。[0051]实施例1、桑树桑黄采集及菌种分离培养[0052](1)我国分布的桑树有15个桑种，4个变种。根据不同纬度、不同类型桑树的代表性分布区域，考察包括东北、华北、华中、华南、西南及新疆、西藏自治区等地区。采集了生于不同地区、不同桑树的桑黄子实体，合计12个。[0053](2)分离上述12个子实体的菌种，保存于普通PDA培养基(每升培养基所用去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH值自然)。[0054]实施例2、桑树桑黄菌株的筛选、驯化[0055](1)黄色色素产生能力和形态初步筛选[0056]选择上述12个分离的桑树桑黄菌株，以灭菌后的打孔器挑取面积0.25cm2的菌丝块，置于上述普通PDA培养基(每升培养基所用去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH值自然)，28℃黑暗培养。各菌株黑暗条件下产生黄色色素的能力和菌落形态具有一定差异，肉眼即能辨别。选择10株黄色色素较多、菌丝生长形态较为匀称的株系继续培养。[0057](2)生长速度及产量筛选[0058]选择上述10个株系，用灭菌后的打孔器挑取面积0.25cm2的菌丝块，置于9cm直径的培养皿(内含相同体积的普通PDA培养基20mL)，每个株系转接3个培养皿，在28℃黑暗条件下继续培养。生长25d后，揭下菌丝体，调查鲜重。筛选出8株生长快、产量相对较高的桑树桑黄株系继续培养。[0059](3)老化时间筛选[0060]选择上述8个株系，用灭菌后的打孔器挑取面积0.25cm2的菌丝块，置于9cm直径的培养皿(内含相同体积的普通PDA培养基20mL)，每个株系重复三次，在28℃黑暗条件下继续培养，调查各个株系的老化时间。菌丝老化后，则由黄色转为褐色，并出现“吐水”现象(菌丝体表面分泌出水分，呈水珠状)，以此作为老化。筛选出老化时间相对较长的6个桑树桑黄株系，用作后续筛选实验。[0061](4)菌种驯化及侵染能力筛选[0062]将风干的桑树枝条粉碎成直径约0.5cm大小碎末，加水搅拌后，使其含水率达60％，装入25×30cm的塑料子实体培养菌袋，制作重量相等的纯桑枝菌袋(菌袋中除桑枝及水分外，无任何添加物质)。菌袋高温高压灭菌(121℃高压灭菌120min)，冷却后备用。选择7CN112680364A说　明　书6/9页上述6 个桑树桑黄株系，用灭菌后的打孔器分别挑取面积0.25cm2的菌丝块，接入上述菌袋中央，每个株系分别接种3袋，28℃黑暗培养。[0063]上述6个桑树桑黄株系长期用纯桑枝为基质(除桑枝和水分外无任何添加物质)人工驯化培养，各个株系菌丝布满整个菌袋后，取菌袋中央被桑树桑黄菌丝侵染的桑枝碎末，超净台中再次转接到相同的纯桑枝菌袋(菌袋中除桑枝和水分外无任何添加物质)培养，如此反复转接一年。[0064]一年后，调查上述6个桑树桑黄株系的菌丝布满整个菌袋的时间。各个株系对桑树枝条的侵染能力有所差异，菌丝布满整个菌袋的平均时间为21d至32d不等。选择菌丝布满整个菌袋的时间最短的株系(21d)，作为筛选出来的目标菌株。[0065](5)获得目标菌株[0066]通过上述逐级筛选、驯化，最终获得一株桑树桑黄菌株。该菌株在28℃黑暗培养的条件下，在普通PDA培养基(每升培养基所用去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH值自然)中具有如下特点：能分泌大量黄色色素，色泽金黄，菌丝形态匀称；生长速度快，菌丝平均生长速度为2.65mm/d；菌丝体产量高，在直径9cm培养皿(内置20mL普通PDA培养基)中生长25d后，菌丝体鲜重平均达3.387g；不易老化，培养55d以上，仅有极少褐色菌丝出现。该菌株对桑树枝条的侵染能力强，长满25×30cm的菌袋的平均时间为21d，菌袋开口20d后，子实体厚度可达2.5cm左右。该菌株来源于一个寄生在野生桑树树干的子实体，被寄生的桑树植株具有典型的鬼桑特征：叶缘呈三角形锯齿，齿尖，有刺芒，长约2厘米，叶尖尾状、锐头，叶背密生绒毛；雌花长花柱，柱头内侧具乳头状突起，子房壁和花柄具绒毛，未成熟呈青色，成熟后紫红色(图1)(夏明炯，2015《，桑属植物的分类检索及中国桑种的特征性状与分布》)。中国分布的桑树有15个桑种，4个变种。鬼桑属于蒙桑的变种，为野生类型，而非栽培类型的桑树(夏明炯，2015《，桑树的分类及研究简史》)。该菌株被命名为“野桑元1号”。[0067]实施例3、形态学特征观察[0068]本实施例对野桑元1号的形态学特征进行了研究。[0069](1)菌丝形态和色泽：普通PDA培养基中，菌丝绒毛状，菌落质地呈毡状，表面平整、均匀，无晕圈；菌丝能分泌大量黄色色素，色泽金黄。[0070](2)菌丝微观特征：PDA培养基插片观察，发现桑树桑黄菌丝在呈簇状生长，分枝众多。显微镜下可见多条细嫩菌丝绞合呈“绳”状的菌丝束，初生菌丝从成串的菌丝束向四周延伸。菌丝无锁状联合，直径1.58～7.23μm。初生菌丝纤长，有分枝，无分隔，菌丝无色透明，顶端钝圆。老熟菌丝呈金黄色，偶尔可见分隔，常见囊泡状结构和异常粗大的金黄色菌丝(直径达4.68～7.23μm)(图2)。[0071]实施例4、菌丝生长的温度梯度实验[0072]本实施例将面积0.25cm2的野桑元1号菌丝块接入相同体积的上述普通PDA培养基，培养温度设置为25～32℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度3个重复。观察菌丝在各种温度条件下生长速度和状态。结果发现，菌丝在25‑32℃均能存活并生长，在25d内均能长满整个9cm的培养皿。在28℃以下，野桑元1号菌丝25d的生长量(以鲜重计算，下同)随温度的上升有增加的趋势。超过28℃，则菌丝不仅生长量未能增加，反而更易老化。超过31℃，菌丝老化明显加快，生长也受到遏制。因此，野桑元1号的菌丝在普通PDA培养基中，最适宜的生长温度为28℃(表1)。8CN112680364A说　明　书7/9页[0073]表1野桑元1号的菌丝在不同温度条件下的生长量和老化天数测定[0074][0075]实施例5、菌丝对pH值适应性实验[0076]本实施例将面积0.25cm2的野桑元1号菌丝块接入相同体积的上述普通PDA培养基，培养基pH值范围5.6～9.0，每0.2为一个梯度，每个温度梯度3个重复。观察菌丝在各种pH 值条件下生长状态。结果发现：pH值低于6.0，培养基明显偏软，野桑元1号菌丝尽管能生长，但生长形态不匀称，菌丝体很难从PDA培养基人工分离，不适合人工转接菌种或大规模生产菌丝体；pH值超过9.0，野桑元1号菌丝尽管能存活生长，但由于培养基过硬，菌丝易于老化。野桑元1号菌丝在pH值6.0‑8.8的PDA培养基均能正常生长，长期用pH值6.0‑8.8 的PDA培养基保存菌种，未发现桑树桑黄菌种有任何变异或退化、变异等现象，无需复壮，即能用纯桑枝制作子实体菌袋(菌袋中除桑枝和水分外无任何添加物质)顺利培养出桑树桑黄子实体，或直接揭下整个培养皿中的菌丝体，以菌丝体大规模生产桑黄粉。由于普通PDA 培养基pH值自然条件下，实测约为6.8～7.0，适合野桑元1号生长，故后续实验中普通PDA 培养基均无需调节pH值，pH值自然即可。[0077]实施例6、生物学特征调查[0078]本实施例通过比较桑树桑黄的近缘种类，研究了野桑元1号的生物学特性。在考察中寻找桑树桑黄的同时，也采集桑树桑黄近缘的黄色无柄蕈类，它们常被人们误认为桑树桑黄，包括市场上常见的漆树桑黄、松树桑黄、暴马丁香桑黄、槭树桑黄、栎树桑黄、杨树桑黄，此类黄色无柄蕈类虽然也被称为“桑黄”，但它们寄生的树种并非桑树。分离上述黄色无柄蕈类菌种，作为研究野桑元1号生物学特征的对照。[0079](1)野桑元1号适合在普通PDA培养基中生长[0080](a)菌丝生长快：用灭菌后的打孔器挑取面积0.25cm2的菌丝块，在直径9cm的培养皿 (内置20mL普通PDA培养基)中28℃黑暗培养。供试的所有菌种中，野桑元1号菌丝在 PDA培养基上生长速度快：菌丝平均生长速度为2.65mm/d，在20d内能覆盖整个培养皿；产量最高：在上述条件下，生长至第25d，菌丝体明显增厚，鲜重平均达3.387g。上述部分菌种生长速度也较快，如杨树桑黄，生长速度略低于野桑元1号，但由于菌丝体结构疏松，生长量并不高(图3)。9CN112680364A说　明　书8/9页[0081](b)菌丝体异常牢固：在普通PDA培养基28℃培养25d以上，由于菌丝异常牢固，很难用镊子从中间挑取小块菌丝，但可轻易将整块菌丝体从PDA培养基分离，并且整块菌丝体不易撕裂；在普通PDA培养基中无基内菌丝，菌丝体整体分离后培养基中无残留。而上述供试的非桑树来源的其他菌种，均无此特点，此类菌丝体结构疏松、易断裂，部分菌种有基内菌丝，无法从普通PDA培养基中分离出完整的菌丝体块。[0082](c)不变异、不退化：野桑元1号在普通的PDA培养基上反复转接培养，5年内未发现任何颜色、性状的改变，菌种转接到纯桑枝制作的子实体菌袋(菌袋中除桑枝和水分外无任何添加物质)后，仍然能顺利诱导出子实体，故无需复壮或重新从子实体分离。而其他供试的菌丝体在普通PDA培养基培养半年至1年后，菌丝体发生变异、退化，需要复壮或重新从子实体分离菌种，否则无法顺利诱导出子实体，或培养的子实体形状及颜色产生变化。[0083](d)不易老化：野桑元1号菌丝在普通PDA培养基28℃培养，40d内不老化，培养55d 以上，仅有极少褐色菌丝出现。而供试的其他所有黄色无柄蕈类的菌丝体在PDA培养基28℃培养条件下，25d以内均明显老化，老化菌丝转为褐色或枯萎，并大量“吐水”(图4.A,B)。[0084]由于野桑元1号具备上述特征，非常适合以普通PDA为培养基直接大规模生产菌丝体(图 4C)，目前已经应用于常年工厂化生产。[0085](2)野桑元1号适应桑叶粉培养基[0086]称取市售干桑叶粉，加水，使含水率达60％。搅拌均匀后，培养基pH＝7.0，每个50mL 的锥形瓶底部平摊4g(湿重)培养基，高温高压灭菌后制作成桑叶粉培养基。各菌种分别挑取面积0.25cm2的菌丝块，转入桑叶粉培养基中28℃黑暗培养。[0087]供试的非桑树来源的菌丝在转接后2d内生长受到抑制，未见有任何生长现象，在第3d才陆续启动生长。转接12d后，各菌株的菌丝可覆盖培养基表面，但很快转为褐色，之后陆续枯亡，表明上述非桑树来源的菌株并不适合以桑叶粉为培养基进行培养(图5)。[0088]野桑元1号则最快适应桑叶粉培养基，在转接的第2天即可观察到菌丝开始启动生长；野桑元1号菌丝转接7d内，可覆盖培养基表面，平均生长速度为3.57mm/d；生长至第25d，平均鲜重达3.370g，与在普通PDA培养基中第25d产量(鲜重3.387g)接近，色泽也由嫩黄转为金黄，菌丝体也同样牢固，便于将菌丝体从桑叶粉培养基分离；在55d内，野桑元1号菌丝仍然保持不老化。[0089]长期用桑叶为基质的培养基人工驯化培养、保存该菌种，至今5年内未发现有任何退化、变异等现象，无需复壮，即能用纯桑枝制作子实体菌袋(除桑枝和水分外无任何添加物质) 顺利培养出桑树桑黄子实体。表明野桑元1号适合在桑叶为基质的培养基生长，能有效利用桑叶中的营养成分。因此，野桑元1号同样适合以桑叶粉为培养基，大规模生产菌丝体。[0090]由于桑叶来源广泛，成本低，桑叶粉培养基配置容易，野桑元1号在桑叶粉培养基中培养，无需复杂的生产工艺条件，可进一步降低大规模工厂化生产成本。[0091]实施例7、子实体培养[0092]以直径约0.5cm大小桑树枝条碎末为原料制作成含水率为60％的纯桑枝菌袋(菌袋中除桑枝及水分，无任何添加物质)，菌袋高温高压灭菌(121℃高压灭菌120min)，冷却后备用。选择上述供试菌种和野桑元1号，用灭菌后的打孔器分别挑取面积0.25cm2的菌丝块，接入上述菌袋中央，28℃培养。菌丝长满菌袋后开口，开口后仍以28℃培养。20d后，野桑元1 10CN112680364A说　明　书9/9页号子实体厚度可达2.5cm左右(图6)，密度平均达0.5208g/cm3(鲜重)，是供试黄色无柄蕈类中最致密的一种(图7)。[0093]由于桑枝条属于蚕桑生产的废弃物，蚕桑生产中可大量获得，故该菌株可应用于蚕桑生产废弃物的综合利用与研究。[0094]实施例8、ITS测序鉴定[0095]本实施例提取桑树桑黄菌株野桑元1号子实体的DNA，以核糖体基因rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列通用引物ITSl(5'‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3')及 ITS4(5'‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3')进行PCR扩增，扩增产物凝胶回收、纯化，经测序，该片段大小为757bp。[0096]从GenBank中查得与桑黄孔菌属类群(Sanghuangporus)的ITS序列，应用MEGA7软件构建系统进化树。野桑元1号菌株ITS序列与桑黄孔菌属的桑树桑黄ITS序列(Genbank 登录号分别为：KT693275.1,KT693244.1，JN642587.1,MN153568.1,MG209821.1,JQ860316.1) 相似性最高，聚为一类(图8)。因此，野桑元1号是一株在分类上属于锈革孔菌科 (Hymenochaetaceae)、桑黄孔菌属(Sanghuangporu)的桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)菌株。[0097]以上描述仅为本发明的实施例，谅能理解，在不偏离本发明构思的前提下，对本发明的简单修改和替换皆应包含在本发明的技术构思之内。11CN112680364A说　明　书　附　图1/4页图1图212CN112680364A说　明　书　附　图2/4页图3图4图513CN112680364A说　明　书　附　图3/4页图6图714CN112680364A说　明　书　附　图4/4页图815