《cp实验操作》PPT课件

PCR-单链构象多态性(PCR-single-strandconformationpolymorphism，SSCP)单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对、氢键等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法即为单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)分析。基本原理将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，建立PCR-SSCP技术。基本过程：①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。PCR-SSCP基本过程SSCP的应用进行人类DNA多态性分析，大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变。如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等。用于检测引起人类遗传性疾病的研究上。如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中。用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中。Yap用巢式PCR对来自不同国家和地区的HBV标品进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不仅证明了HBVDNA具有地区性变异，而且排除了交叉性污染的可能性。PCR-SSCP的实验操作1.在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾和引物二聚体)。2.制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)（1）电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗，95％乙醇擦拭，通风橱自然晾干。两块玻璃对齐，底部和两侧用橡胶条封好，用1%琼脂糖胶封底，固定在垂直电泳槽上。（2）制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用5％～8％的凝胶较为合适。PCR-SSCP的实验操作在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA片段长度(核苷酸数)丙烯酰胺(%)1Kb～700b3.5700b～500b5500b～200b8200b10-12PCR-SSCP的实验操作PAGE的制备：成分：浓度：8%10%40%丙烯酰胺8ml10mlddH2O26ml24ml甘油4ml4ml10×TBE2ml2mlTEMED40ul40ul10%AP600ul600ulPCR-SSCP的实验操作10×TBE：Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）40ml，定容至1000ml，高压灭菌，4℃贮存。40%丙烯酰胺贮备液（交联度49:1）：39.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容至100ml，过滤，避光4℃贮存。10％过硫酸铵：过硫酸铵0.1g溶于1ml蒸馏水，4℃贮存数周。2×上样缓冲液：甲酰胺9.5g，0.5mol/LEDTA0.4ml，二甲苯蓝FF5mg,溴酚兰5mg，加水溶解，定容到10ml。试剂配制：PCR-SSCP的实验操作（3）按上表配制合适浓度的胶液，轻轻摇匀。用1ml移液器吸取胶液，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部，立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。小心取出点样梳，在电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。样品上胶前预电泳约30分钟。PCR-SSCP的实验操作3.扩增产物的处理：取0.4-1.2μlPCR扩增产物，加入15μl2×上样缓冲液中，混匀。100ºC变性10min，立即冰浴骤冷2分钟以上。然后将10μl混合物上样，以微量加样器上样。上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散。PCR-SSCP的实验操作4.电泳：根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。5.剥胶：电泳结束后，回收电泳缓冲液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。PCR-SSCP的实验操作6.银染法试剂：1.固定液（10%无水乙醇）：无水乙醇50ml，双蒸水定容至500ml。2.1%硝酸溶液：5ml硝酸，双蒸水定容至500ml。3.0.2%硝酸银溶液（现配）：1g硝酸银，双蒸水定容至500ml。4.显色液：15g无水碳酸钠，溶于500ml双蒸水，同时加入250ul甲醛，混匀。临用时配制。PCR-SSCP的实验操作步骤：1.凝胶用固定液浸泡5-10分钟，双蒸水漂洗2遍，每次2min；2.1%硝酸溶液浸泡5分钟，双蒸水漂洗2遍；3.0.2%硝酸银溶液浸泡20分钟，双蒸水漂洗2遍，每次约10s，轻轻漂洗；4.显色液中显色至条带清晰而背景不至于过深，双蒸水漂洗2遍；5.银染后的凝胶经SmartView成像，拍摄，电脑保存。PCR-SSCP的实验操作由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别。因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判定结果。检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化。例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有改变。另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果。另外，SSCP分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定。SSCP结果SSCP结果对出现异常泳动条带的样品，从PCR扩增到SSCP，均重复3次，获相同结果，再送测序确证，以排除PCR反应中的错配或电泳条件差异引起的偶然现象，既使结果可靠，又避免不必要的测序。质量控制1.DNA片段的大小和组成:用于SSCP分析的DNA片段越小，检测的敏感性越高。﹤200bp的DNA片段检出率为90%，200～500bp的DNA片段检出率为70～80%，而﹥500bp的DNA片段检出率﹤50%。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。另一方面，核酸片段中碱基的组成以及突变位点临近的核酸序列也可能影响其电泳速度，如富嘌呤序列较富嘧啶序列对碱基变异更敏感。PCR-SSCP注意事项2.PCR产量和特异性：PCR扩增产物的高度特异性是SSCP成功的前提。首先要优化PCR反应条件，以免非特异扩增带干扰结果分析；其次要避免PCR操作过程的污染。在使用大量PCR产物时，变性的单链DNA会很快地复性，从而影响SSCP检测的敏感性；但如果减少PCR产量，则可能因为单链DNA太少而降低敏感性，所以上样量也要进行摸索。PCR-SSCP注意事项3.游离引物:游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。PCR-SSCP注意事项4.低浓度变性剂:凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用2～3种条件做SSCP，可能提高敏感性。PCR-SSCP注意事项5.凝胶浓度、交联度及厚度:凝胶浓度和交联度决定凝胶孔径大小，因而影响单链DNA泳动速度和对构象的分辨率。不同大小DNA片段的最适浓度不同，本人以往实验根据有关文献选择了8%凝胶。凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。PCR-SSCP注意事项6.电泳温度：单链DNA的构象取决于温度和分子内部弱的稳定力之间的平衡，温度是SSCP分析中至关重要的影响因素，不同的DNA片段应尽可能调试在最适温度下进行电泳，一般4℃-15℃之间。但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。PCR-SSCP注意事项PCR-SSCP注意事项7.电泳电压的影响:在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(550V)，以后用400V左右电压进行电泳。这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离。在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压。8.假阴性:一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。PCR-SSCP注意事项9.结果分析:单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带。因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。PCR-SSCP注意事项