BLOT-HP-2012幽门螺杆菌抗体分型

幽门螺杆菌及其分型的临床意义幽门螺杆菌（H.pylori） 1982年澳大利亚学者Marshall和Warren从胃黏膜中分离出Hp 常见于人的胃窦和幽门部位 可通过一端多条鞭毛移动 是一种革兰氏阴性螺旋菌 分泌高活性的尿素酶和过氧化氢酶 VacA、CagA导致宿主的炎症反应革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。*Marshall和Warren1979年根据活组织切片检查结果，Warren发现50%左右的病人的胃腔下半部分附生着许多微小的、弯曲状的细菌。Warren的发现引来了同行的质疑，但也引起了Marshall的极大兴趣，他们决定联合对取自100个病人的活组织切片进行研究。经过反复试验，Marshall成功地培育出一种当时尚不为人知晓的细菌——后来被命名为幽门螺杆菌。基于试验结果，Marshall和Warren认为，幽门螺杆菌是导致胃炎、十二指肠溃疡或胃溃疡的关键因素。发现这种细菌，使胃炎、十二指肠溃疡或胃溃疡的诊断治疗变得及其简单。伟大的发现1983年Marshall写论文投给某杂志，但遭到编辑部的拒绝：“我们需要56篇文章，而你是第67篇。1984年7月，Marshall决定用自己的胃做实验，他把60毫升的幽门螺杆菌培养液喝了下去！14天后，马歇尔出现了明显的恶心、呕吐症状，10天后的胃镜检查发现他确实患了胃炎。2005年诺贝尔医学奖2005年10月3日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布，把2005年诺贝尔生理学或医学奖授予澳大利亚科学家BarryJ.Marshall和J.RobinWarren，以表彰他们发现了导致胃炎和胃溃疡的细菌-幽门螺杆菌。诺贝尔奖委员会在授奖词中说，由于BarryJ.Marshall和J.RobinWarren的发现，使得原本慢性的、经常无药可救的胃溃疡变成了只需抗生素和一些其他药物短期就可治愈的疾病。幽门螺杆菌与消化道疾病1994年世界卫生组织（WHO）把Hp归为一级致癌物内窥镜诊断传播途径幽门螺杆菌能在人体内生长、繁殖，又能通过粪便及唾液排出体外，人是幽门螺杆菌的传染源。它通过口－口传播、粪一口传播、经内窥镜传播或密切接触等方式进行传播。内科学(p.380)幽门螺杆菌作为慢性浅表性胃炎最主要病因的确立基于如下证据：1，绝大多数慢性活动性胃炎患者胃粘膜中可检出幽门螺杆菌；2，幽门螺杆菌在胃内的分布与胃内炎症分布一致；3，根除幽门螺杆菌可使胃粘膜炎症消退；4，从志愿者和动物模型中可复制幽门螺杆菌感染引起的慢性胃炎。…………….幽门螺杆菌通过上述产氨作用、分泌空泡毒素A（VacA)等物质而引起细胞损害；其细胞毒素相关基因（CagA)蛋白能引起强烈的炎症反应；其菌体胞壁还可作为抗原诱导免疫反应。这些因素的长期存在导致胃粘膜的慢性炎症。Maastricht1-1995年观点强烈地建议治疗消化道溃疡疾病消化道出血性溃疡低级别胃粘膜相关淋巴瘤有严重反常的胃炎胃癌切除术之后早期亚太地区共识-1997年观点推荐指征:消化道溃疡疾病溃疡出血或穿孔伴有溃疡和消化不良病史,NSAID治疗早期胃癌切除术低级别胃粘膜相关淋巴瘤胃癌家族史消化不良（检测到Hp）Maastricht2-2000年观点强烈建议治疗DU/GU(活动的或不活动，包括PUD)胃粘膜相关淋巴瘤萎缩性胃炎胃癌切除术后GC病人的直系亲属病人的要求Maastricht3-2005年观点对于检测准确性高的可以确认Hp感染的血清学检测方法，可以用于Hp现症感染的检测中国庐山共识-2007年观点幽门螺杆菌根治适应证：消化性溃疡胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤慢性胃炎伴胃粘膜萎缩、糜烂慢性胃炎伴消化不良症状………个人要求治疗亚洲HP的流行病学中国的HP流行病学参考：张万岱，胡伏莲等.中国自然人群幽门螺杆菌感染的流行病学调查.，2006HP检测的方法 侵入性方法（依赖胃镜活检） 非侵入性方法（不依赖内径检查） 快速尿素酶试验（RUT） 13C或14C尿素酶呼气试验（UBT） 病理切片染色 粪便Hp抗原检测（HpSA) 细菌培养 血清和分泌物抗体检测 基因检测（PCR等） 基因芯片，蛋白芯片检测等HP检测方法的比较能不需要数小时取血WBT否酶标仪数小时取血ELISA否不需要数分钟取血金标法否质谱仪或放射性物质检测仪数小时吹气UBT否PCR检测设备数小时胃镜PCR否不需要数分钟胃镜尿素酶法否Hp培养设备数天胃镜细菌培养否病理检查设备数小时胃镜组织学法能否分型辅助设备所需时间取材方式方法小结 HP和消化道疾病密切相关，检测很重要 中国健康人群HP感染率59%，检测量很大 目前主流的呼气试验和血清抗体检测，没有检测毒性幽门螺杆菌的致病HP基因多态性是造成HP感染后不同临床结局主要的原因，现在认为与空泡毒素A（VacA）基因和细胞毒相关基因（CagA）及其基因表达的蛋白质与致病有关。VacA和CagA蛋白是HP毒素的主要标志。部分革兰阴性和阳性致病菌的染色体上毒力因子基因的特殊区域称为“致病岛”。CagA致病岛是HP的主要毒力因子。CagA基因序列的拓展研究发现，CagA是Cag致病岛中基因之一，CagE是诱导胃上皮细胞产生白介素8（IL）的主要基因，IL是诱发胃黏膜炎症的主要细胞因子。HP毒力因子空泡毒素（VacA）：是HP分泌的一种蛋白毒素，可引起作用的靶细胞发生空泡化、细胞凋亡、细胞骨架重排、甚至细胞死亡等形态学改变，是HP重要的毒力因子。细胞毒素(CagA)：虽不直接介导毒素活性，但与空泡毒素（VacA）的表达密切相关，常与空泡毒素（VacA）同时存在，故将其命名为HP细胞毒素相关蛋白简称CagA。CagA可能与VacA的转录、折叠运转及功能有关，CagA可导致宿主出现严重的炎症反应。尿素酶（Urease）：幽门螺杆菌能够在胃里生存只要依靠尿素酶。尿素酶可以分解产生的氨，使细胞能量代谢发生障碍，并出现病理性改变。HP分型的定义Ⅰ型：产细胞毒素HP菌株，其检出率约占总HP感染的50％～60％。这类菌株感染能使胃上皮细胞出现空泡、变形和损害，引起溃疡和诱发癌变。Ⅱ型：不产生细胞毒素的HP，即：CagA(-)和VacA(-)，这一类HP菌株毒性较小，感染后一般仅引起慢性浅表性胃炎而无临床症状。　HP分型的临床意义HP分型能为临床开展“选择性根治”提供了重要的实验诊断依据。对于感染了HP的上消化道疾病患者，应引起临床医师的足够重视，进行毒力分型检测，帮助制定根除HP、胃镜及病理检查随访的诊疗，利于胃癌的预防并合理节约医疗资源。Ⅰ型：产细胞毒素HP菌株，其检出率约占总HP感染的50％～60％。这类菌株感染能使胃上皮细胞出现空泡、变形和损害，引起溃疡和诱发癌变。Ⅱ型：不产生细胞毒素的HP，即：CagA(-)和VacA(-)，这一类HP菌株毒性较小，感染后一般仅引起慢性浅表性胃炎而无临床症状。Ⅰ型的HP感染者中的胃癌和溃疡的患病率显著高于Ⅱ型HP的感染者，说明Ⅰ型HP感染可能更易导致较为严重的上消化道疾患，如溃疡或癌肿。因此，Ⅰ型HP感染患者有必要进行根除治疗HP分型的治疗建议有症状Ⅰ型感染Ⅱ型感染无症状需治疗个人意愿不需治疗胃镜检查李兆申上海政府网站截图2007国家科技进步二等奖上海长海医院消化内科李兆申教授等筛选出幽门螺杆菌(Hp)的重要致病因子——细胞毒素相关抗原(CagA)和空泡变性细胞毒素(VacA)。研究者还提出Hp毒力存在差异的新理论,并应用Hp重组CagA建立检测CagA的血清学方法,研制相关的检测试剂盒。相关成果日前获得2007年度国家科学技术进步二等奖。李教授介绍,该项目针对Hp毒力因子众多、致病机制复杂、临床诊断有待规范等问题,开展了大规模流行病学调查,筛选出Hp两个重要致病因子——CagA和VacA,同时证明了CagA是导致消化性溃疡发生的关键因子,也是胃癌发生的重要危险因素。研究小组发现,Hp中国菌株的CagA、VacA和致病岛阳性率高、毒力强,阐明了Hp的“中国特色”。研究者还提出Hp分类学说,认为Hp菌株分为有毒株(CagA、VacA阳性)和无毒株(CagA、VacA阴性)。该学说得到学术界广泛认同,被SCI他引407次。该项目研究人员采用Hp重组CagA建立了检测Hp的血清学方法,并研制出可同时检测血清CagA、VacA和尿素酶抗体的免疫印迹诊断试剂盒,可判断Hp毒力。该技术可覆盖国内95%以上的临床检测需要和科研需求。同时,研究人员根据Hp毒力进行选择性根治,将已有的Hp根治进行优化,增强了治疗的针对性和有效性,节约了医疗资源。（中国医学论坛报）深圳市伯劳特公司国内刚刚拿到、唯一有产品注册证的幽门螺杆菌分型检测试剂盒生产商研发过程2000年7月获得中检所新生物制品审评检验报告2002年5月上海医疗器械质量监督检验中心的注册检验2002年7月瑞金医院的临床试验报告2002年7月长宁区中心医院的临床试验报告2002年8月上海市药监局颁发医疗器械注册证2003年12月国家药监局颁发医疗器械注册证2005年6月和2007月7月北京医疗器械质量监督检验中心的注册检验2007年12月获得国家科技进步二等奖。2010年1月完成上海长海医院、青海省人民医院和吉林大学中日友谊医院临床试验。2010年3月获得中国药品生物制品检定所注册检验报告2011年7月获得国家食品药品监督管理局产品注册证获奖证免疫印迹法背景介绍免疫印迹技术：它与内切酶的发现和PCR基因扩增技术一起，在上世纪做为分子生物学领域三大发现之一。给人类生物工程带来了革命性进展。基本原理：将提取的蛋白混合物先进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质按照分子量大小不同分离然后再转印至印迹膜，显色后按照显色带位置不同判断分子量多少和所含蛋白质数量，称为Southernblot。其制造主要有三个工序：将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离；将分离的组分转印到印迹膜上；对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测。免疫印迹检测原理本产品是将CagA、VacA的菌体抗原利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白按分子量大小不同依次分开，再转印至印迹膜上。　采用酶联免疫反应技术，如果被检者血清有相应抗体则在抗原的相应位置出现显色区带，根据条带显色位置判断被检血清中各种HP抗体。由抗体出现的种类不同推断HP类型，再根据显色带的强弱、消长可观察治疗效果，预测溃疡有无复发的可能性。反应过程实验材料 蒸馏水 1000ul可调加样枪一支10ul加样枪一支吸嘴 500ml带盖瓶 摇床一台操作步骤 在量杯中将浓缩洗涤液用蒸馏水按1：10的比例稀释成洗涤应用液。 每槽加入洗涤液1ml，再加待测血清或全血10ul，放在摇床上摇动30分钟。 取出反应槽，弃去槽中液体，并在平铺的纸巾上将其倒置经磕以拍干剩余液体，每槽加入洗涤液1ml，摇动洗涤1分钟，弃去槽中液体，并在平铺的纸巾上将其倒置经磕以拍干剩余液体，重复洗涤3次； 每槽加入洗涤应用液500ul，再加酶联试剂10ul，放在摇床上摇动30分钟。 同（3）洗涤3次。 加显色剂0.5ml，5分钟后观察结果。 待质控带和阳性带显色清晰，弃去槽内液体，用流水（自来水或蒸馏水）冲洗后取出印迹膜，等干后对比《标准带》判断结果。结果判断判断标准CagA抗体+-VacA抗体+-UreA抗体+-UreB抗体+-1、质控带未出现：表示本次试验无效。2、阴性结果：显色区带仅出现质控带，未见任何一条阳性区带，表示被检者血清中无HP抗体。3、Ⅱ型HP抗体阳性：仅UreA和UreB区带中任意一种或同时出现，未见CagA、VacA区带。4、Ⅰ型HP抗体阳性：CagA、VacA区带中任意一种或两种同时出现。产品适应症 各种胃、十二指肠疾病：包括胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎、胃癌和胃淋巴瘤等； 非溃疡性消化不良； 缺铁性贫血口服铁剂治疗效果不佳者； 儿童消化不良或不明原因的生长发育迟缓者。产品禁忌症 本产品检查无任何禁忌症，不需要空腹可随时进行采血检测。产品安全性 本产品属于体外诊断试剂类产品，不直接使用人体，对人体不造成创伤性损害。 本产品为各种胃、十二指肠疾病的辅助诊断，任何疾病的诊断均需要结合临床病史资料综合判断。注意事项1、室温大于20度小于37度2、试剂盒使用前要平衡室温3、加酶标的时候要换枪头4、严格操作HP分型检测产品特点 国内唯一能检测HP分型的体外诊断试剂 能直接观察HP血清学毒性反应全貌，包括了CagA、VacA、尿素酶A和B可多人份同时检测，整个时间仅需1.5小时仅需10微升被检血清特异性强（97.0%）；敏感性高（98.0%）部分学术论文吴水河，刘家双，张阳德，等。幽门螺杆菌CagA、VacA抗体与胃十二指肠疾病的相关性研究。中国内镜杂志，2003;9(3):11-13.余悠悠，沈霞。现代免疫学杂志，2004,24(6):511-513.张玫汤哲周英智，等。北京地区老年人群幽门螺杆菌感染的血清流行病学研究中华流行病学杂志，2005；26（9）：687-689。张玫，汤哲，汤欣，等.社会因素对老年人群幽门螺杆菌感染的影响.世界华人消化杂志2005,13(14):1779-1780.陈肖肖，尚世强，来庆和，等.具有cagA、vacA基因的幽门螺杆菌及其表达产物的研究.中华儿科杂志2003,41(1):56-57.杨光，林蔚，陈曼彤，等.幽门螺杆菌感染的血清学分型检测以及临床治疗.胃肠病学和肝病学杂志2006,15(1):29-31.陈海英，番敏，张柳，等。免疫印迹技术在临床幽门螺杆菌检测中的应用。中国实验诊断学，2OO6；10（9）：995-996.王韶英，惠萍萍，叶荣菊,等.幽门螺杆菌感染与结肠息肉关系的研究.同济大学学报(医学版),2009;30(3):56-58.………Thanks！革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。*