马铃薯低温糖化的机理及其改良策略

马铃薯低温糖化的机理及其改良策略张迟，柳俊，谢从华’，宋波涛，成善汉，朱青(1．华中农业大学园艺林学学院，湖北武汉430070；2．华中农业大学生命科学技术学院)摘要：低温贮藏引起的糖化是影响马铃薯油炸加工品质的重要因素，其糖化机理涉及到一系列酶调控的淀粉―耪代谢途径，同时亦与细胞渗透调节机制有关。低温耪化的改良目前主要集中在淀粉―糖代谢的生化途径上，包括提高淀粉合成相关酶活性及抑制淀粉和蔗糖降解。关键词：低温糖化；加工品质；品质改良马铃薯作为典型的淀粉作物，不仅是主要的粮食作物，同时亦是重要的工业原料作物。在西方国家，马铃薯淀粉被广泛应用于食品、纺织及造纸等加工业Etl。在马铃薯食品加工业中，油炸食品是其主要的部分，大约占马铃薯加工食品的70％以上。为了实现周年供应，同时为了减少采后病虫害、薯块萌发等带来的损失，用于加工的马铃薯通常需要储藏在4℃左右的低温环境中，从而带来了一个严重的负面影响一块茎还原糖含量的上升，淀粉含量的下降.与块茎萌发时淀粉降解不同，低温贮藏中还原糖累积的区域不只局限于芽眼周围，而是扩大到整个储藏器官，这种现象被称之为低温糖化，其后果是在油炸加工过程中，马铃薯中的还原糖与食用油中的游离氨基酸发生化学反应而产生一种褐色并略带苦味的物质，这即是所谓的Maillard反应。这一反应严重影响了马铃薯油炸制品的外观品质和食用品质，这是长期以来困扰加工业的一大难题。关于低温糖化的机理已有大量的研究，结果显示，淀粉―糖代谢过程中的几个关键酶参与了低温糖化的过程[3，4][2]，为从根本上解决这一难题奠定了基础。然而，常规的育种途径通常在降低还原糖的同时，亦使淀粉含量随之下降，从而很难获得淀粉含量符合加工要求，同时又抗低温糖化的品种。近年来，随着分子生物学技术在育种上的应用，利用分子技术，改良低温特定条件下淀粉代谢途径，有可能获得加工性状优良的品种。低温糖化的生化机理酶调节作用.蔗糖降解为己糖是植物碳源利用的重要途径。研究表明，进入马铃薯块茎的蔗糖可以通过外质体中的转化酶(Invertase)或细胞质中的转化酶直接降解为己糖，或通过细胞质中的蔗糖合成酶(Sucrosesynthase)催化蔗糖与尿苷磷酸(UDP)生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDP―glucose)和果糖。通常，在块茎形成的早期，块茎内转化酶的活性较高，而块茎发育过程中，则蔗糖合成酶的作用占主导地位。转化酶，又称蔗糖转化酶，能水解蔗糖为葡萄糖和果糖，是蔗糖降解的关键酶之一。按其生化特性和亚细胞定位，转化酶大致可分为两种类型：酸性转化酶，其作用的最适pH值为4.5―5.0，主要分布于液泡和细胞壁中；弱碱性转化酶，最适pH为6.8~8.0，主要定位于细胞质中。有研究表明，酸性转化酶的活性与己糖／蔗糖的比值呈较高的相关性，本实验室的研究结果显示，低温储藏中，酸性转化酶与还原糖含量的相关系数R达到0．79(未发表)，并且，只有UGPase和Invertase的活性受到低温的影响。酸性转化酶活性受重金属离子(Ag十、Hg十)以及自身产物的抑制，但能够为机械损伤、糖、病原菌等所激活。在所有分离的酸性转化酶cDNA序列中，均含有ND-PNG(在马铃薯中为NDPNA)和WEPDC两个保守位点。进一步分析证明，马铃薯酸性转化酶基因组包括6个exon，保守位点NDPNA中的DPN刚好组成exon2，能够为低温所诱导而被[9][8][7][6][5]选择性剪切，当温度上升时又可恢复，因而推测该区域可能是酸性转化酶对低温诱导信号应答的位点，从而使得在低温时，块茎中酸性转化酶大量转录[10]加速了蔗糖降解，促使低温糖化。酸性转化酶还存在一个蛋白质调节因子一转化酶抑制子。在从烟草悬浮系中纯化细胞壁转化酶的过程中，分离得到了17KD的pH依赖性的多肽[11]。由于与转化酶共同定位于细胞壁，因而推测该蛋白质可能对转化酶活性起到重要的生理调节作用。利用一个与烟草细胞壁转化酶同源的液泡转化酶抑制子转化马铃薯，在35S组成型启动子的控制下，使其超量表达，结果使转基因马铃薯系的块茎在低温贮藏中己糖积累下降了75％,并且该转基因株系的块茎产量、淀粉质量和数量与原品种没有显著的差异[12]。目前,酸性转化酶抑制子的序列，在烟草、番茄；拟南芥等植物中都已有报道(Y12806、Y12805、AJ010943、Y12807、AF529166)。马铃薯转化酶抑制子早在1967年即有报道[13]，Genebank检索显示，近年来也有一些关于该抑制子的核酸序列的报道(AF459077―AF459083)，但均未做功能鉴定。序列比较的结果显示，转化酶抑制于基因特别是液泡转化酶抑制子基因在不同作物间同源性较低，这给马铃薯直接克隆该基因带来一定困难，因此目前还没有直接从马铃薯中克隆出有抑制功能的该基因的报道。我们采用本实验室建立的改良试验技术，在已报道的该抑制子氨基酸序列基础上克隆，有望在近期内获得马铃薯酸性转化酶抑制子基因用于低温糖化性状的改良.腺苦二磷酸焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成中的一个关键酶[14]。AGPase以l―磷酸葡萄糖(G―l―P)为底物，在ATP的催化下，生成ADP―葡萄糖(ADP。Glc)并释放出焦磷酸(PPi)。马铃薯块茎中的AGPase由大、小两个亚基组成，小亚基分子量50KD，具有G―1―P底物结合位点，起到主要的催化功能，而大亚基则起到调节小亚基催化功能敏感性的作用[15]，存在变构调节，受到Pi的抑制和3PGA的激活[17][16]。利用反RNA技术抑制AGPase的活性，可达到几乎完全抑制淀粉生物合成的效果。但外源转化AGPase基因，其[18]结果在不同研究间却有不同。大肠杆菌AGPase基因glgc~16转化体系中，Stark等30％的再生植株，而Sweetlove等[15]得到了淀粉含量增加却几乎没有检测到块茎中淀粉含量的明显变化。在随后的U―14C同位