【PPT讲义】李金明-分子遗传实验室的规范与管理

分子遗传实验室的与管理李金明国家卫生计生委临床检验中心常见疾病及检测项目单基因遗传病：如Duchenne肌营养不良（DMD/BMD）（X性连锁隐性遗传病，DMD基因部分缺失或重复，以及非缺失型）、α和β地中海贫血（常染色体隐性遗传病，α珠蛋白基因缺失或突变，β珠蛋白基因突变）等线粒体遗传病：Leber遗传性视神经病、线粒体脑肌病、药物性耳聋、线粒体糖尿病等染色体非整倍体无创产前筛查（唐氏、13和18三体）常用的检测PCR-Sanger测序多重连接探针扩增技术（MPLA）实时荧光PCRPCR-焦磷酸测序PCR-基因芯片杂交PCR-时间飞行质谱生物芯片系统新一代高通测序技术荧光原位杂交（FISH）临床分子诊断技术发展历程：几个里程碑1953年:DNA双股螺旋的发现1963年:放射免疫测定技术1972~1977年:重组DNA技术、核酸测序方法1983年:PCR测定技术1991-1993年:实时荧光PCR技术和芯片技术2003年：人类基因组基本完成。后基因组的功能基因组研究，药物基因组学2007年--新一代高通量测序技术？分子遗传检测实验室规范化的5W1H（Why、What、When、Where、Who、How）实验室医学70%或90%以上信息来自实验室诊断监测预后预测个体化医疗（personalizedmedicine)精准医学（precisionmedicine）移动医疗数字医疗精准医学计划（PrecisionMedicineInitiative）新生儿测序计划（BabySeqProject）Why（laboratorymedicine）实验室医学的时代？没有精准检测何来精准医疗？PCR-Sanger测序、PCR-电泳、PCR-杂交（膜上、芯片、乳胶颗粒等）、NIPT等均涉及基因扩增过程，属于临床基因扩增检验实验室NIPT的优越性：对T21、T18和T13阳性预测值（PPV）从筛查方法的3.4%、14.0%和3.4%提高到80.9%、90.0%和50%。NortonMEetal.NEJM2015,372(17)国内回顾1990年：PCR技术在国内开始用于临床检测1990年代中期：假阳性？（假阴性？）国内回顾1999年4月29-30日：《基因扩增技术临床应用专家研讨会》，针对临床开展PCR检验的问题，达成8点意见：（1）PCR技术本身没有问题，技术先进。（2）卫生部暂停临床应用有助于规范管理，应在严格管理的基础上适度开放。（3）限定临床开展PCR检验项目上。（4）加强对PCR实验室管理。（5）人员上岗培训。（6）应有室内质控和参加部中心室间质评。（7）SFDA尽管批准试剂文号。（8）成立专家咨询委员会。1999年8月17-24日：《第一期全国临床基因扩增实验室技术人员培训班》在北京卫生部临床检验中心举办2002年1月14日卫生部下发《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）国内回顾《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》（卫办医政发〔2010〕194号）What（必要条件）检验申请单是合适的：对“Who”在“When”开出“What”申请单标本是正确的和好的：采集、运送和保存实验室环境条件是好的：温湿度、可能的干扰的避免（分区、灰尘、电磁、振动等）仪器设备状态是好的：维护、定期校准试剂是好的：性能验证、质检实验室人员是有能力的：外部和内部培训，能力评估SOP的可操作性及全员遵循得到结果的过程是有监控的：室内质量控制和室间质量评价（或实验室间比对）针对差错、投诉、失控等分析原因采取措施的质量持续改进临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾病的诊断和治疗质量保证检测申请单、标本采集、运送和保存（分析前）室内质控（分析中）室间质评（分析中）结果报告解释及临床应用（分析后）涉及临床医生标本采集环节和实验室涉及实验室涉及实验室涉及实验室人员和临床医生遗传咨询的一般流程检测前咨询：包括可能的结果、准确性和局限性、检测的潜在风险和益处、作出检测决定、患者心理评估等检测流程咨询对“Who”在“When”可做“What”的检测（诊断、症状前、预测、筛查、携带者、治疗┉┉）选择合适的实验室：（资质、技术和精确性、能力、价格、服务等）解释检测流程：包括向检测者明确列出检测过程、知情同意、安排检测流程（正确的检测申请单、正确的标本采集运送和保存）、结果报告时间/告知、费用、保密措施、客观评估患者利益和意愿（性格类型、有刺激事件发生、情绪反应、是否准备好面对检测结果、检测时间、宗教/文化信仰、理解检测等）等告知结果及随访：包括准备及过程、如何告知结果、检测者可能的反应、对结果的讨论和患者随访等分析前检验申请单和标本采集、运送和保存中的关键点对“Who”在“When”开出“What”申请单容器：密闭的、一次性、无菌、无核酸酶及其他扩增抑制物采集方法：人（训练有素）、防污染、处理运送保存时间和温度：尽可能快？低温？合格标本:容器完整、量够、时间符合要求、外观符合要求、处理符合要求用于NIPT的外周血cffDNA特点母体血浆中cffDNA含量占总游离DNA的大约5〜10％，长约150bp，怀孕4周即能检出，其在血液中的半衰期只有16min，出现2小时后即不能测出。cffDNA在母体循环中较稳定，可能与来源于胎盘的微粒能够保护他们免受核酸酶降解相关。CffDNA随着妊娠孕龄增加而增多，在前三个月每周增加21％，在孕中期上升速度较慢，在孕期的后八个星期又急剧上升。cffDNA在-20℃下可稳定超过4年，但血浆样本在-20℃下长时间保存，cffDNA每月以-0.66GE/ml速率降解。Who:正常孕妇(产筛高风险、≥35岁？孕周<12周？双胎？恶性肿瘤？夫妇染色体异常？…)When：>12周(-26+6周？)What:NIPT血浆样本可在-18℃~-25℃短暂储存1周，在-70℃以下储存2年，反复冻融次数应不超过2次。分析中实验室物理分区及空气流向控制产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区标本与文库制备区文库扩增与检测区测序区植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库检测区WGA制备区试剂准备区缓冲间缓冲间空气流向空气流向电泳区扩增一区遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）DNA打断区缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间空气流向标本与文库制备区关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区通风换气？（>10次/小时）试剂方法的可靠性性能验证（verification）？性能确认（validation）?LDTs？性能指标？精密度（重复性）准确性（正确度，方法学比较）可报告范围（线性范围）参考区间分析敏感性（测定下限）分析特异性抗干扰能力临床特异性和临床敏感性？“性能验证”（“verification”）定义“verification”：broadlyas“confirmationthroughtheprovisionofobjectiveevidence,thatspecifiedrequirementshavebeenfulfilled”.（广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足）CLIAusestheterm“verification”：specificallytorelatetoconfirmationthatthelaboratoryusingatestcanreplicatethemanufacturer’sperformanceclaimswhenthetestisusedaccordingtothepackageinsert.（CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。）如果不按商品试剂盒说明书操作或改变商品试剂盒组份是否可以？可以但属于实验室自配试剂或自建方法，亦即Laboratory-developedtests,LDTs)“性能确认”（“validation”）定义TheFDAandISObothdefinetheterm“validation”as“confirmationbyexaminationandprovisionofobjectiveevidencethattheparticularrequirementsforaspecificintendedusecanbeconsistentlyfulfilled”.（通过检查和提供客观证据证明，对一特定预期用途的要求始终能得到满足）TheFDAandISOtermsforverificationandaresimilar,withthedistinctionhavingtodowithintendeduse.（性能验证和性能确认FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”）“intendeduse”预期用途Theterm“intendeduse”inthesedocumentsisestablishedbythemanufacturerordevelopinglaboratoryatthetimeofassaydevelopmentandhastodowiththepurposeandpopulationforwhichthetestwasintended(e.g.,diagnosis,followingtreatment,etc.).Relevantperformancecharacteristicsarethendeterminedbasedontheintendeduseofthetest.Somepeopleinterpret“intendeduse”asreferringtotherelevantclinicallaboratoryinwhichthetestisperformed,ratherthanthemanufacturerordevelopinglaboratory,thuscausingconfusion.TheWorldHealthOrganization(WHO)definesvalidationas“theaction(orprocess)ofprovingthataprocedure,process,systemequipmentormethodusedworksasexpectedandachievestheintendedresult”.（WHO将validation定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过程）“validation”通俗一点的定义theterm“validation”willbeusedtorefertotheanalyticperformancecharacteristicsthatneedtobeinitiallyestablishedatthetimeofassaydevelopment.（指在测定方法研发时，最早建立的分析性能特征）结果报告的内容和格式遗传检测报告至少要包括的信息将报告与特定患者联系在一起的惟一编号咨询人员的姓名和联系方式与检测结果解释有关的特异的信息和检测性能检验项目及所使用的方法（包括检测范围及检测局限性）标本类型标本接收日期检测实验室名称，地点，包括咨询实验室检验结果根据检测特性和其它提供给实验室的信息对结果的解释报告批准人的签字实验室联系方式报告日期适当时，还应包括：建议的有资质的遗传咨询人员；对其他家庭成员的意义；进一步的检测建议MM20-A.(vol.32.No.15)Qualitymanagementformoleculargenetictesting,Approvedguideline供参考的标准报告格式XXXXXX医院临床分子检测报告报告编号：*样本编码：*姓名：*性别：*年龄：*临床诊断：*送检科室：*送检医生：*采样日期：*采样时间：*样本类型：*样本的处理：*检测方法：主要检测仪器：*结果报告：编号*检测项目*检测结果参考值/参考范围*结果解释（结果的总体描述及临床意义）：*检测方法的主要性能指标(至少含检测范围及检测下限)：*检测局限性：进一步检测的建议：建议的咨询人员及其联系方式：参考文献：其它(对其他可能对检测结果产生影响的问题描述)：*收件日期：*检测日期：*报告日期：*检测者：*审核者：备注：实验室地址：XX市XX路X号。邮编XXXXXX联系电话：XXXXXXXX第页，共页BrownsteinGA,etal.GenomeBiology2014,15:R53TheCLARITYBiologyBrownsteinGA,etal.GenomeBiology2014,15:R53TheCLARITYBiology结果解释及与临床沟通基本概念的重要性以染色体非整倍体无创产前检测（NIPT）为例基本概念假阳性率：阳性预测值：假阴性率：阴性预测值：（假阳性）（真阴性）假阳性）(FPTNFP×100%×100%（假阳性）（真阳性）真阳性）(FPTPTP（假阴性）（真阴性）真阴性）(FNTNTN×100%×100%（假阴性）（真阳性）假阴性）(FNTPFN概念不清造成的误解一般的唐氏筛查手段仅能检出50%~95%的异常，且有5%的假阳性率[1,2]。根据2015年对15,841例妇女标准筛查的结果，21三体的阳性预测值仅为3.4%，即1000个筛查阳性结果中只有34个为真阳性[3]。1.NicolaidesKH.PrenatDiagn2011;31:7–15.2.WrightD,etal.FetalDiagnTher2014;35:118–26.3.NortonME,etal.NEnglJMed.2015;372(17):1589-97.NIPT的假阳性CheungSW,LeungTY.NEJM2015,372(17):1675-1676NIPT的假阳性率为0.1%~0.2%NIPT假阳性的原因染色体拷贝数变异（copy-numbervariation）[1]母体嵌合（maternalmosaicism）[2,3]限制性胎盘嵌合（confinedplacentalmosaicism）[2,4,5]双胎消失综合征（thevanishingtwinsyndrome）[5]孕妇患有恶性肿瘤[6]1.SnyderMW,etal.NEnglJMed.2015Apr23;372(17):1639-45.2.LauTK,etal.PrenatDiagn2013;33:602-8.3.WangY,etal.ClinChem2014;60:251-9.4.GratiFR,etal.GenetMed2014;16:620-4.5.LauTK,etal.UltrasoundObstetGynecol2014;43:254-64.6.OsborneCM,etal.PrenatDiagn2013;33:609-11.NIPT假阴性原因胎儿游离DNA浓度（Fetalfraction）☆样本处理：血浆和血细胞要尽快分离，需采用EDTA抗凝管进行样本采集，最好在采集后6个小时内完成血浆分离，最长不能超过24小时。☆孕妇体重指数（maternalbodymassindex，BMI）：体重高的孕妇，胎儿游离DNA浓度更低。☆孕周（Gestationalage）：在10-21孕周，胎儿游离DNA浓度每周约增加0.1%。21周后，每周增加约1%。☆胎儿非整倍体（fetalaneuploidy）类型：21三体的胎儿游离DNA浓度更高，而18和13三体的浓度较低。单胎和多胎妊娠（singletonandmultiplegestations）：如果双胞胎是同种基因型，他们可与单胎同等有效地进行检测，而且Z值与胎儿游离DNA浓度呈线性相关。但是，如果双胞胎的非整倍体情况不一致，那么检测就相对困难一些，因为每个胎儿游离DNA的浓度较单胎更低。有假阴性风险。嵌合体（mosaicism）：10%以下嵌合或低胎儿游离DNA浓度均会导致假阴性结果。染色体：GC含量中等的染色体使用MPS检测结果最好，例如21和18染色体。13染色体GC含量低，因此需要校正GC偏倚，才能提高13三体检测的敏感性。对于常见的染色体非整倍体，所有患者不管其风险状态，均可以选择游离DNA检测作为一个筛查策略，但选择该检测的患者应该了解在所有可选择的筛查和诊断方法中这种筛查方法的益处和局限性。ObstetGynecol.2015Jun29.[Epubaheadofprint]美国妇产科医师学会（ACOG）和美国母胎医学会（SMGM）2015年联合发布专家共识2016年7月28日美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）最新的一份声明表示，只要不是显著肥胖，从9-10周妊娠开始，检测细胞游离DNA（cfDNA）的无创产前筛查（NIPS）适用于所有年龄段孕妇，以及整个妊娠期的检测，能够取代常规的21、18和13三体综合征筛查。ObstetGynecol.2015Jun29.[Epubaheadofprint]ObstetGynecol.2015Jun29.[Epubaheadofprint]NIPT结果应如何报告？结果报告有些实验室用“阳性”或“阴性”，而有些则报告非整倍体的机会，最常用“>99%”表示高风险，“<1/10,000”表示低风险，这些报告方法对于产科医生和患者不如阳性预测值或残留风险那么有用。鉴于这些数据在为患者关于其筛查检测结果提供准确的和可理解的信息中的重要性，美国妇产科医师协会（ACOG）和美国母胎医学会（SMFM）建议所有实验室对每个染色体非整倍体检测结果报告以“阳性预测值”和“残留风险值”来表示ObstetGynecol.2015Jun29.[Epubaheadofprint]When时时刻刻没有最好只有更好！Where?Who高素质的人是最重要的高素质：专业知识技能“强”的职业意识和进取精神“认真”How硬件：实验室（分区、环境条件等）、仪器设备及试剂、人员（持证上岗）软件：质量保证体系（包括标本采集运送和保存及质检、仪器设备维护校准、试剂方法性能验证或确认和批质检、有可操作性SOP编写、人员培训、室内质量控制和室间质量评价、结果报告和解释）“无基因”或“无核酸”概念的重要性！！！尊敬的李教授：您好！来信请教一个问题，具体情况是这样的：我这儿使用的PCR仪是ABI7300，用的是达安公司的HBV-DNA试剂，去年12月中旬的一次试验中发生了爆管事件，事件发生后，已经按照SOP规程进行了消毒处理，到现在已经有半年了，可还是不能消除污染。PCR实验室在三楼，现在即使加样操作放在同一幢楼房的一楼进行，其余如混匀、温育、离心等还放在原来的实验室，扩增也在原来的实验室，阴性对照孔所加对照都未如标本一样处理（因此暴露在空气中的时间很短），可是阴性对照孔仍有扩增，大约在21个循环的时候开始，阴性对照显示的Ct约为26左右。请问这是什么原因，怎么处理才能消除污染。盼指点！刘X20130508刘大夫：PCR实验室一旦出现严重污染，消除将会比较困难，通常可采用下述方法：（1）开窗通风;（2）采用次氯酸钠溶液擦地面及实验台面，甚至墙面;（3）增长紫外照射时间；（4）用75%乙醇空中喷雾，然后用于次氯酸钠溶液擦地面及实验台面。上述措施每天都要进行，直至污染消除。不知你是否按上述方法进行？如没有，你可以这样试，并请将效果告诉我。此外，在实验室出现严重污染后，如还要进行工作，则可临时更换一个厂家试剂，应就可以。20130508李教授：您好！我是上次向您请教PCR实验室污染如何清除的小刘，我们按照您的指点进行处理，现在实验室污染已经完全清除，非常感谢！以后我们会更加注意操作的规范及相关知识的学习！2013.7.18尊敬的李教授：您好！您所说的措施我都实行过，只不过除通风外，其余措施仅实施过很少几次，我将按您所说措施处理一段时间再看看。另外，再请教两个问题：（1）上述措施要在三个区都进行吗？（2）楼房第三层污染，在第一层操作怎么也会受到影响？谢谢您拨冗指教！刘X20130508实验室质量管理的“灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件）和实验室实际工作经验积累。因此高于相关标准文件！！！SOP等于试剂盒说明书吗？标准操作程序（SOP）是实验室的“最高标准”！有可操作性的SOP及全员遵循是质量管理的“灵魂”！看得见的看不见的“文字”加“图片”的SOP能给我们带来什么？有一个SOP很容易有一个可操作性的SOP很难吗？出现问题（失控、差错、投诉等）处理的20字原则查出异因采取措施保证消除不再出现纳入标准预防！防止同样的问题出现第二次是质量管理的“精髓”！PlanDoCheckAction北京及全国性雾霾的原因：工厂废气、汽车尾气、油烟、工地扬尘、烧煤……一个临床PCR实验室对全年室内质控结果的分析举例这次失控反映的是实验室的什么问题？全面质量管理的工作循环:PDCA4个阶段，8个步骤第一阶段（Plan）有4个步骤：分析并找出问题；找出问题产生的原因；确定最主要原因；制定措施计划。第二阶段（Do）有1个步骤：执行计划第三阶段（Check）有1个步骤：检查计划执行情况。第四阶段（Action）有2个步骤：总结、制定标准（修改质量文件），以巩固提高；发现新出现的问题，转入下一PDCA循环。72PDCA的特点小环合成大环不断循环，阶梯式上升“A”是改进的动力之源73PDCAPDCAPlan•问题：质控品结果偏低•原因：PCR仪扩增孔内有灰尘所致，说明仪器设备日常清洁维护不到位•措施：修改原有的仪器设备维护SOP，加大扩增孔维护频度。Do•按照新的室内质控SOP执行Check•是否有同样的失控发生？•是否执行了新SOP？Action•总结，并将更改的扩增仪孔内清洁频度要求写进正式的扩增仪维护SOP。•是否出现新的问题？HBVDNA质控失控发现质控结果超出均值－3SD）PCR实验室最有效的防“污染”措施实验室的“通风”次氯酸钠溶液的使用1mol/LHCl溶液的使用紫外照射70%乙醇溶液的使用谢谢！细节决定成败！