综述：无缝克隆与基因融合(中文版)

无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能。基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。传统的基因融合技术涉及到typeII限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的方法。然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。这是获得杂交基因的理想情况。以下强调几个例子，以明无缝基因融合的重要性。启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。蛋白质功能研究和蛋白质工程蛋白质由有功能结构域构成。为了阐述一个蛋白某个结构域的功能，需要构建该结构域删除或者被相似结构域替换的突变体。这种结构域删除或者互换实验将在很大程度上得益于相关元件的无缝融合，来消除有操作序列所带来的潜在的负面影响。更加概括地说，不同结构域的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的，包括获得新的杂交分子和抗体改造。对于抗体改造，互补决定区嫁接（CDR-grafting）和定点突变是经常要做的。嵌合体蛋白也可以通过內含肽介导的蛋白拼接和连接获得。只要含有內含肽的前体蛋白没有多余的序列，精确蛋白融合就可以实现。蛋白质表达标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达。它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来的目的蛋白的亲和纯化。在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下，整个融合蛋白可以直接用到接下来的研究中。对于酶学研究和测定，通常是这种情况。然而，在许多情况下，移除融合蛋白是必要的，这可以通过改造的蛋白酶酶切位点来完成。这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间无缝的连接。为了进行功能研究，在一些情况下携带一个短标签（比如his标签）的融合蛋白被成功地结晶，移除这个标签是不必要的。然而，如果带有标签的蛋白无法结晶，就难以估量标签的影响，标签的切除通常是必要的。在表达成熟和有活性蛋白的过程中，常常需要表达蛋白氨基酸序列与原来的一样。例如RANTES（调控激活，正常的T表达和分泌）蛋白，interleukin-18（IL-18），IL-1β和hirudin蛋白的表达。在这些蛋白的N端加上甲硫氨酸残基严重地降低了这些蛋白的活性。对于RANTES，Met-RANTES被发现是天然RANTES的拮抗剂。如果要在大肠杆菌中表达完整N端蛋白，一个实用的方法就是将蛋白与N端标签融合表达并纯化。纯化和重折叠（如果需要）之后，通过专一改造的蛋白酶酶切位点将标签和不需要的序列切除。这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间的无缝拼接。肠激酶，Xa因子和泛素特异性蛋白酶（Ubps）是常用的酶，这些酶可以切开识别序列的C端。烟草蚀刻病毒蛋白酶对于酶切位点下游的氨基酸残基要求比较宽松，也可以用来去除融合标签。ubiquitin/Ubp可能是第一个用来在体内和体外获得完整N端蛋白蛋白的系统。在大肠杆菌中表达成熟的人类ApoA-I蛋白，Mogilevsky和同事发现泛素标签系统是最直接的方法之一。基因组操纵在模式生物中目的基因的敲除和敲入技术是体内分析基因功能的有力工具。这个过程常常包括整个开放阅读框或者一部分编码特殊结构结构域的基因的删除，在一些情况下利用一个等位基因突变体或者同源基因序列的替换。这些研究需要产生敲出和敲入的载体，在其中所有的功能元件包括侧翼序列，需要同源重组精确地连接到一起。无缝基因融合技术将会显著地促进载体构建。Link及其同事利用重叠PCR技术获得基因精确删除的载体，用以在大肠杆菌基因组中进行功能研究。为了进行动物病毒繁荣分子和病理学研究和疫苗载体开发，经常需要合成整个病毒基因组或者改造杂交病毒载体。利用无缝基因融合技术看，Tount和同事用PCR片段成功地拼接了31.5Kb的重组病毒基因。无缝基因融合技术在PCR技术发明之前，DNA片段的无缝融合是通过复杂的程序完成的，涉及到利用细菌的基于噬菌体M113的定点突变，多核苷酸引物，linker和核酸外切酶，质粒在大肠杆菌中扩增。在一些情况下需要利用RecA依赖的同源重组。这些过程需要仔细的设计载体，需要复杂的程序。由于传统方法的局限，仅仅有几例利用这些方法进行无缝基因融合。一个例子就是利用一组突变载体进行基因启动子的link扫描分析，另一个就是酵母中蛋白稳定性分析。随着PCR技术的出现，无缝基因融合有了很大的发展。已经发展了几种无缝基因融合的方法，许多其他方法经过修饰也可以用于此目的。这些方法将在下面讨论并列举在表1中。PCR常常是用来进行精确的DNA操控或者修饰DNA元件的末端用来进行合适的基因融合。利用这些创新的方法，我们操控DNA序列的水平达到了一个前所未有的水平。例如，在研究P1’氨基酸残基对肠激酶酶切融合蛋白的影响中，通过一种PCR和连接不依赖克隆的无缝基因融合技术构建了20个GST–EK–X–calmodulin融合基因（其中X代表20个氨基酸的一种，GST是谷胱甘肽-S转移酶）。重叠PCR在PCR技术发明之后就出现了重叠PCR技术。重叠PCr是一种非常有效的过程，不依赖与任和限制性酶切位点，在片段都可以扩增的前体下，任何两个片段都可以在任何确定的位点自由地结合到一起。利用相同的原则，多个DNA片段可以无缝拼接到一起，并成功地获得了20kB的重组融合基因。重叠PCR已经被用以无缝的方式来进行点突变，插入，删除和替换到一个基因的任何位置。PCR获得的融合基因随后可以克隆到合适的载体以进行下游应用。需要主意的是，重叠PCR的一个特例是基因合成，互相重叠的多核苷酸被用来作为PCR进行基因拼接。如果没有合适的模板DNA进行PCR扩增，或/和杂交基因相对较短（500bp），就可以采用这种方法。定点突变定点突变，包括点突变，插入，删除和替换，是在包含一个目的基因的环形质粒模板上进行。删除，插入或者替换突变通常是通过PCR完成。反相PCR利用两个方向相反的引物去扩增质粒，得到质粒任何位点点突变，删除和插入的突变体。然而，PCR步骤会潜在地在质粒中引入错误序列。这个问可以通过QuickChangeemutagenesistechnology解决。如图2所示，该方法依赖于两条完全互补的突变引物和PfuDNA聚合酶。因为引物彼此是完全互补的而且Pfu没有链替换活性，在热循环过程中，突变的双链是以原始DNA为模板线性扩增的。因此，这种设计避免了DNA合成过程中错误的扩增。QuickChange技术及其改进技术可以用来在模板DNA的任何位点进行DNA插入，删除或者序列替换，甚至可以同时将多个片段插入模板中。IIS型内切酶的应用IIS型限制性内切酶是一类可以从酶切位点外部将DNA切开的酶，例如SapI,BsaIa和FokI。它们被用来得到PCR片段的粘性末端，进行基因和病毒基因组的拼接。对于一些通用的基因，例如用于蛋白表达的纯化标签（例如麦芽糖结合蛋白），这个基因通常先插入表达载体。然后，这个载体可以作为受体，将不同的片段通过无缝克隆插入该载体。Stratagene的pCal.n.EK载体是一个大肠杆菌表达载体，包含T7/lacO–CBP–EK–MCS表达序列（CBP：钙结合肽。MCS：开放阅读框）。利用typeIIS内切酶Eam1104可以将目的基因DRF无缝地融合到CBP-EK的下游。CBP-EK-ORF融合蛋白表达和纯化后，用肠激酶切除CBP-EK多肽，可以得到完整的目的重组蛋白。在IMPACTM载体pTYB和pTWIN中，利用SapI可以使目的蛋白的ORF与內含肽无缝融合，以进行蛋白表达和随后的蛋白拼接。IIS型限制性酶切位点也被用来构建目的载体以进行无缝克隆，使一个DNA片段与载体中已存在的DNA片段无缝融合。这是通过在质粒上的反向PCR实现的，引物包含IIS型限制位点。然后进行限制性酶切，得到带有所需要粘性末端的载体。值得一提的是，基于IIS型限制性内切酶的方法需要同时消化载体和待插入的DNA片段。如果在DNA片段内部含有某种IIS型内切酶的酶切位点，可以将该位点甲基化，来抑制酶将片段从中间切开。或者换一种IIS型内切酶。片段和载体可以如图3a所示拼接在一起。连接非依赖克隆（LIC）为了克服传统构建杂交基因的剪切/粘贴方法的限制，人们开发了LIC克隆，不依赖与限制性内切酶和连接，将PCR片段克隆到载体中。该方法依赖于具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶（T4或者Pfu聚合酶）,在DNA片段5’端产生12个碱基的单链。因为其独特的特征，LIC已经被用来无缝连接编码蛋白结构域的ORF，进行蛋白质的表达。利用含有核糖核苷的嵌合引物进行PCR，用其他试剂比如尿嘧啶DNA糖苷酶或者rare-earthmetalions处理PCR产物，也可以得到粘性末端。Jarrell及其同事采用包含三个连续的核糖核苷或者一个2’-O-甲基化核糖核苷来终止DNA在互补链的合成，在PCR过程中得到单链末端。应为这种方法简单，可以促进高通量克隆实验。In-FusionTMPCR克隆系统可以将末端含有与载体片段末端有15bp同源序列的片段克隆到任何线性化载体。然而，这种酶的成分还没有公开。因为末端对于这种反省是非常重要的，载体片段需要特殊的处理，来实现插入片段与载体中已存在的ORF无缝融合。载体片段可以通过反向PCR制备或者用IIS型限制性内切酶处理，去除不需要的序列。In-FusionTM是迄今为止最为直接的PCR克隆系统，它将会促进PCR克隆的自动化。体内重组同源重组可以使含有同源区域的分子中的遗传序列相互交换。因为同源重组的位点可以自由地选择，利用同源重组可以进行基因的无缝操作。这个过程曾被用于等位基因的替换，研究大肠杆菌和酵母细胞中基因的功能。这通常是一个两步同源重组的过程。首先将带有正选择标记和负选择标记的环形质粒整合到染色体或者附加型载体目的ORF的特异位点上。重组子通过正选择标记筛选。接下来，通过负选择标记反向选择，用另外一个包含修饰ORF的片段替换选择的片段。在这个过程中，基因是以无缝的方式在染色体上操作的。在酵母中，基因的在质粒上的操作是通过一步缺口修复完成，只需要30bp的同源臂。使用PCR技术，用来进行缺口修复实验的杂交载体可以利用删除，插入和序列替换构建。酵母-大肠杆菌-哺乳动物穿梭载体，被用来在酿酒酵母中构建无缝融合基因，然后在大肠杆菌回收质粒。大肠杆菌中的同源重组有三种机制：RecA依赖,RecA非依赖和Red/ET依赖。RecA结合到单链DNA片段，促进单链侵入并在同源序列见交换。RecA-介导的重组需要很长的同源区域（1Kb），引发率较低。它被用来构建腺病毒重组基因组，在两步等位替换实验中修饰细菌人工染色体（BACs）和票P1衍生人工染色体（PACs）上的基因。RecA非依赖通路存在与recA细菌中，需要两个重组片段的末端有>12bp的同源序列。两个片段共转化，得到环形质粒。然而，反应的具体机制还不清楚，而且克隆效率较低。在一个片段中加入复制起点和选择标记可以提高克隆效率。这个策略曾被用来高通量构建一些列的蛋白半胱氨酸突变体。Red/ET系统只需要线性载体和线性片段之间有30-50bp的同源序列，就可以在大肠杆菌中有效地重组。该技术依赖λ噬菌体的于Redα/Redβ蛋白或者Rac噬菌体的RecE/RecT蛋白，其中Redα和RecE是5’-3’核酸外切酶，Redβ和RecT是单链DNA退火蛋白。在recBCsbcA突变菌株中，RecBCD外切酶的活性被抑制而隐蔽的Rac原噬菌体表达的RedE/RedT蛋白由sbcA突变激活，使线性片段之间的同源重组变为可能。在recBC+菌株中，线性片段之间的同源重组可以通过RedE/RedT蛋白和Redγ基因产物的过表达实现。RecA-非依赖系统和Red/ET系统在功能上与酵母细胞的缺口修复系统相仿。带有短臂的DNA片段可以利用PCR扩增，直接用于体内重组。这些大肠杆菌的缺口修复方式被用来构建表达载体，从复杂的来源中克隆基因以及染色体上的等位替换。结束语对于所有应用，无缝克隆和基因融合都是构建杂交DNA分子的理想情况。正如这里所讨论的，在许多情况下，保证构建的载体中没有多余的序列，对于直接的数据解释是至关重要的。在某些情况下，多余的核苷酸或者氨基酸残基的存在不会有影响，不残留操作序列只会保证一个完美的设计。然而，尽管操作序列可能不会影响杂交分子的应用（比如酶学测试），但可能对于其他应用带来麻烦（例如结晶）。因此，构建完整的分子不仅提高数据质量也降低数据解释的模糊性。然而，无缝克隆和基因融合也并不是没有代价的。一些方法需要对插入片段和/或载体进行特殊的改造或者准备。例如，LIC载体的末端必须没有多余的核苷酸残基。所有提到的方法都依赖于PCR得到正确末端的片段和/或载体，实现无缝基因融合或克隆。尽管20世纪80年代后期，PCR的保真性还很差。随着高保真DNA聚合酶（如PfuDNA聚合酶）的使用，这个问题不再那么重要了。尽管如此，融合基因还是需要测序确认。另外，因为融合连接处没有操作序列，融合基因或者它的一部分不能快速地转移到其他载体上，这与“剪切/粘贴”位点特异性重组（GatewayTM系统和CreatorTM系统）的方法有很大差别。如果可能的话，无缝系统和灵活的转移系统应该结合起来。例如，杂交基因可以先通过重叠PCR无缝地拼接在一起，然后亚克隆到Gateway入口载体，促进杂交ORF轻易地转移到其他目的载体中。随着杂交基因的无缝融合精确性的提高和转移系统灵活性的提高，我们操控基因和DNA元件的能力有了很大的提高。这些技术将会在各个水平上促进载体的构建促进基因功能的研究，包括在动物模型或者细胞中进行基因敲除和敲入研究，突变体构建以及等位替换研究，异源蛋白表达和测试研究。Box1无缝基因融合研究例1.突变扫描。突变扫描实验是用来鉴定极影启动子中国的顺式调控元件或者研究蛋白结构与功能的关键氨基酸残基。对于一个基因启动子，需要做linker扫描分析。构建一组DNA载体，用一个具体的linker片段替换启动子的每个片段，来恢复原来的间隔。对于蛋白质，常常需要做丙氨酸扫描，构建一组突变体，每个带电荷的氨基酸突变为丙氨酸。以前，突变扫描载体的构建是一个费力的过程，需要泳道外切酶，linker和连接酶或者基于细菌噬菌体M13定点突变。随着PCR的出现，突变体可以轻松地利用overlapPCR或者体内重组获得。例2.泛素标签系统及其应用。泛素是一个高度保守的真核蛋白，含有76个氨基酸，天然中表达为多聚泛素。然后，在体内多聚泛素的C端泛素部分被泛素处理蛋白酶家族精确地切割。泛素蛋白酶（Ubps）高度的专一性和独特的切割方式使得泛素-Ubps成为一个在真核和原核细胞中基因表达的理想的标签系统。为了研究在酵母中N端氨基酸对蛋白稳定性的影响，Varshavsky及其同事建立了一组ubiquitin-X-βgal无缝融合基因，其中X是二十种氨基酸中的一种。在酵母中，新生的的融合蛋白在体内去泛素化，使带有不同N端残基的X-βgal蛋白暴露出来。在酵母中对这些X-βgal蛋白稳定性的研究，使我们发现了在体内N端对蛋白质稳定性的影响。共翻译处理也可以使蛋白在真核细胞中表达。在原核细胞中，因为缺少泛素蛋白酶，泛素融合蛋白并不是在体内加工的。融合蛋白纯化之后，泛素标签可以用纯化的Ubp进行体外切除。同样，酵母的泛素样修饰物（SUMO），SMT3，被用来作为大肠杆菌中蛋白表达的融合标签。这个标签可以在体外用SUMO水解酶（泛素样蛋白酶1）去除。ubiquitin-Ubp蛋白是一个独特的系统，可以表达带有完整N末端的蛋白，前提是Ubiqitin-ORF是无缝的融合。例3.病毒基因组拼接。为了拼接一个31.5kb的全长的感染cDNA，Yount和同时利用一种无缝基因融合方法，使用了PCR和TypeIIS限制性内切酶。为此，使用末端带有Esp3I酶切位点的引物，病毒基因组通过PCR扩增为7个相邻的片段。Esp3I消化出去了PCR片段末端任何不需要的核苷酸残基，留下了专一的4碱基单链，与相邻片段互补。逐步的连接反应得到全长病毒基因组定向的拼接。表1.无缝基因融合的方法克隆方法应用优点缺点基因合成任意合成杂交基因或者新基因。得到含有任何所需变化的DNA片段设计融合基因的精确性在碱基水平。对任何ORF可以进行密码子优化对于<500bp的杂交基因适用。对于更长的片段效率降低。重叠PCR多个DNA片段的拼接定向DNA拼接，有效，不依赖与酶切位点需要多个PCR反应。杂交产物越长，PCR引入的错误的风险越高。对于<10Kb的杂交体适用。反向PCR制备带有所需末端序列的载体骨架，用于下面所列的应用。也可以用来在环形质粒上引入点突变，删除，插入和序列替换。制备含有所需末端序列载体用来进行无缝克隆的理想的方法。PCR可能在载体骨架引入突变。载体越长，引入错误的风险越高。QuickChangeTM定点突变在质粒的任何位点进行点突变，删除，插入和序列替换最为广泛使用的方法，商业上有一系列的试剂盒。可以在一个反应中实现多个点突变载体超过8Kb效率会降低，然而超过19Kb的模版也使用过IIS型限制性内切酶介导的基因融合多个长的DNA片段拼接可以定向连接多个PCR片段，拼接得到超过15Kb的额融合基因或者病毒基因组需要多个PCR反应和限制酶消化。对于将PCR片段与一个已经存在于载体的片段融合的情况，需要特殊的载体。连接非依赖型克隆将一个PCR片段与一个已经存在于载体的片段融合。定向克隆，不依赖与限制性酶切位点和连接酶需要特殊设计的LIC载体。插入片段和载体DNA片段需要酶处理，得到单链末端。In-FusionTM克隆将PCR片段与存在于载体的片段融合定向克隆，不依赖与限制性酶切位点和连接酶作用机制还没有公开。In-FusionTM酶相对较贵。只有载体片段在融合接合处不包含多余的序列，才能实现无缝克隆。RecA依赖重组大肠杆菌中等位基因的替换。构建大肠杆菌中重组adenoviral基因组。可以实现两个环形分子内的重组。需要recA+型菌株，需要长的（>1Kb）的同源序列。效率较低，通常需要选择和/或反向选择。RecA非依赖的重组大肠杆菌中点突变，删除，插入。Linker扫描突变。点突变，删除，插入。通常使用DH5α和JM109（recA菌株）。只需要>12bp的同源臂。作用机制不清楚。在单独的片段存在复制起点和选择性标记，才最有效。Red/ET重组点突变，删除，插入。从复杂产物中亚克隆基因。大肠杆菌的等位替换。需要30-50bp的同源臂。载体片段可以通过反向PCR制备需要recBCsbcA突变菌株，例如JC8679或者过表达RedE/RedT/Redγ的recBC+突变菌株。酵母中缺口修复酵母中基因融合和亚克隆需要>30bp同源臂，载体片段可以通过反向PCR制备骨架中需要酵母的复制七点和选择性标记图1.重叠PCR。图中所示DNA片段X和Y的无缝融合。两个DNA片段分别由PCR扩增。引物P2和P3的5’端有15pb是彼此互补的。PCR产物作为模版利用P1和P3进行第二次PCR扩增.P2和P3的互补部分可以是片段X或者片段Y的一部分。注意为了促进PCR的扩增效率，所有引物的Tm值应该相近，在55oC-75oC。图2.QuickChangeTM定点突变进行无缝DNA操纵。图表显示构建突变体的步骤。(a)，插入（b）或者删除（c）。在所有情况下，都会泳道两条互补的突变引物（或者长引物，图b），在它们突变位点两端都有>15bp的同源序列。利用Pfu聚合酶扩增之后，不需要的甲基化模板DNA和半甲基化的杂交体被限制性内切酶DpnI切割成片段。转化之后，目的突变环形二聚体在大肠杆菌中恢复。质粒骨架包含复制起点（ori）和一个选择性标记（sm）。图3.基于IIS型限制性内切酶的无缝基因克隆和基因融合。以SapI为例。（a）X，Y和Z片段的无缝拼接。首先，使用含有SapI位点的引物分别扩增片段。片段通过SapI消化得到专一性的粘性末端。消化之后，将片段连接实现X，Y和Z的无缝拼接。X的5’端和Z的3’端含有SapI位点或者其他的限制性位点，用来进行进一步的亚克隆。（b）片段X和载体中的X和Z片段的无缝融合。片段A是由含有SapI位点的引物扩增的。经过SapI消化形成粘性末端。含有片段Y和Z的载体片段经过了特殊的改造和SapI消化处理得到。SapI处理的片段A和载体连接，实现X和Y，Z的无缝融合。质粒骨架包含复制起点（ori）和一个选择性标记（sm）。注意构成粘性末端的核苷酸碱基可以是片段X的一部分或者是融合蛋白的一部分，使片段的连接是定向的。图4.连接非依赖克隆（LIC）。图表显示片段X和载体中的片段Y和Z的无缝融合。片段X经过PCR扩增和纯化。引物末端的12个碱基经过缺少某种特殊的核苷酸（例如，dT）。然后，在存在dATP的条件下，产物用具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶（比如T4DNA聚合酶和Pfu）处理。聚合酶开始从3’端去除核苷酸，直至遇到一个dA碱基并去除，接下来由酶的5’-3’聚合酶加回来。这个反应使片段X产生12个碱基（或更长）的单链末端。含有片段Y和Z的质粒骨架经过改造，同样处理的到12个碱基（或更长）的粘性末端，与插入片段互补。质粒骨架含有一个复制起点（ori）和一个选择标记（sm）。LIC准备的载体片段和插入片段经过退火得到环形二聚体，转化到大肠杆菌中得到恢复。如果含有LIC的核苷酸是X片段或者融合蛋白的一部分，就可以实现X，Y，Z的无缝融合。图5.体内重组介导的无缝克隆。图示表明片段X和载体中的片段Y和/或Z的无缝融合。插入片段和载体片段都是通过PCR扩增。反应中使用的引物经过设计，使扩增片段的末端包含一段同源序列（15-40bp）。质粒骨架含有复制起点和选择性标记。两个DNA片段然后共转化如大肠杆菌，进行体内重组。如果同源序列是片段X或者它的融合蛋白的一部分，就可以实现无缝融合