骨髓检查进展与骨髓细胞形态学检查规范化

作者单位 :350025 　福建福州 　南京军区福州总医院 ·特 　载· 骨髓检查进展与骨髓细胞形态学检查化 朱忠勇 　　骨髓检查是一项古老的技术。据文献记载 ,早在 1868 年 ,Neumann 和 Bizzozero 等就发现骨髓是一种造 血器官 :Neumann 并首先证实白血病与骨髓异常造血 有关[1 ] 。随着时间的推移 ,骨髓检查的内容愈加丰 富 ,技术手段也越来越多、现代的骨髓检查. 已从早期 单纯的形态学发展到涵盖细胞化学、免疫学、细胞遗 传学和分子生物学、超微结构分析等诸多方面 ,常规 的形态学检查也逐步向规范化[2 ] 。本文就骨髓检查 的现状和进展 ,作简要介绍。 　1 　骨髓检查的内容 　1. 1 　一般形态学检查 　包括常规的罗氏染色 (Ro2 manowsky stain ,即瑞氏一姬姆萨染色) ,和有选择的细 胞化学或免疫化学染色检查骨髓涂片。 　1. 2 　细胞免疫表型分析 　即细胞分化抗原簇 (CD)分析。用各种荧光染料标记的抗 CD 单克隆抗 体与流式细胞术结合 ,鉴定包括造血干细胞、各种淋 巴细胞、髓系细胞、单核细胞、巨核细胞等的 CD 表 型。目前在血液细胞学分析 ,特别是白血病分型方面 应用越来越广。 　1. 3 　细胞遗传学分析 　白血病、MDS 等恶性血液 病 ,往往有染色体异常。骨髓直接制片或短期培养 , 即可进行染色体鉴定 ,目前巳逐步发展为白血病分型 的常规。 　1. 4 　分子遗传学分析 　从基因 (DNA 或 RNA) 水 平研究和诊断血液系统疾病 ,是当前的热点 ,例如 ,由 于 9 号和 12 号染色体易位 t (9 :22) 形成的 ,在慢粒白 血病常见的 Ph 染色体 ,以往多用染色体分析法鉴定 , 后来发现这种易位形成了一个新的融合基因 bcr - abl ,从而可用较简单的 PCR 或基因探针技术进行鉴 定。目前类似的报告越来越多[3. 14 ] 。 　1. 5 　直接查找微生物 　如黑热病的利 - 朵体、弓 形虫等。近年来 ,由于临床免疫抑制剂的大量使用和 爱滋病的发生率增高 ,许多以往很少见的微生物如鸟 分枝杆菌、组织胞浆菌 ( Hisloplasma) 等常可在骨髓片 中找到。 　1. 6 　骨髓细胞超微结构的研究、集落形成单位 (colony forming unit)的培养。 　1. 7 　骨髓活检 　用一种环钻 (trephine)切取骨髓作 活组织检查 ,可观察骨髓完整的组织结构 ,真实反映 骨髓局部的增生情况 ,发现局灶性坏死等。而抽吸取 样破坏了骨髓原来的结构并被血液稀释 ,故骨髓活检 被认为是观察骨髓各细胞系列比例和增生情况的金 标准。 　2 　骨髓检查的适应症 骨髓检查是一项创伤性检查 ,会对病人带来一定 的痛苦和风险。同时它又是一项操作复杂、费时、高 技术含量的检查 ,必须由经过专门、有坚实的血 液细胞形态学理论基础和实践经验 ,又具备临床血液 病学理论和经验的专家承担 ,故其收费相应较高。因 此 ,必须严格掌握适应症。根据 Bain 2001 年的建 议[2 ] ,骨髓检查的适应症有 : ⑴无法解释的小红细胞 症和大红细胞症。⑵不明原因的贫血。⑶不明原 因的血小板减少。⑷血片中见到幼稚红、白细胞 ,疑 有骨髓浸润。⑸疑有急、慢性白血病。⑹评价急、 慢性白血病治疗效果 (是否缓解、复发、急变、骨髓抑 制等) 。⑺骨髓增生异常综合征 (MDS) 。⑻其它骨 髓增生性疾病 (真性红细胞增多症、原发性血小板增 多症、骨髓纤维化症等) 。⑼非何杰金氏淋巴瘤。⑽ 毛细胞白血病 (诊断和追踪) 。⑾多发性骨髓瘤。⑿ 脂质积储病。⒀全血细胞减少 (疑有再生障碍性贫 血) 。 以上适应症综合了多数血液学家的意见 ,其中有 一部分是否是适应症仍有争论。需要说明的是 , 上 述适应症只是说“可以”而非都“必须”检查骨髓。当 前 ,外周血细胞的形态学、生化和免疫检查方法发展 迅速 ,有些血液病不经骨髓检查即可诊断。例如 ,小 细胞和大细胞性贫血 ,可以通过全血细胞计数 (CBC , 包括 PCV ,MCV ,MCH ,MCHC ,RDW ,Plt 等) 结合网织 红细胞计数和成热指数检查、仔细的外周血形态学观 察 ,以及必要的辅助检查 ,再结合患者的病史和体征 , 就可以确珍 ,并且更适合于临床疗效监测。 　3 　骨髓形态学检查规范化的程序和方法 骨髓检查分骨髓抽吸检查 (aspiration) 和活检两 种。活检主要用于病理组织学检查 ,不在本文讨论之 内。以下着重介绍当代骨髓抽吸标本形态学检查的 程序和方法。 　3. 1 　骨髓穿刺采样 目前国内外一致认为常规骨 ·79·江西医学检验 2004 年 4 月第 22 卷第 2 期 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 髓检查宜采用髂骨后上嵴或前上嵴部位 ,特殊情况也 可用胸骨穿刺 (具体方法略) 。 　3. 2 　涂片 　制备合格的涂片 ,是骨髓细胞形态学 检查的首要条件。其要点如下 : 　3. 2. 1 　为了避免骨髓被大量血液稀释 ,骨髓吸取 量要尽量少。如果同时要做细胞遗传学、免疫表型或 细菌培养等检验 ,可先吸取 0. 25ml 左右 ,供涂片作形 态学检查之用 ,然后再换一个注射器抽取大量骨髓作 其它检查。如有多余的骨髓 ,应即注入含 EDTA 的抗 凝管中并立即混匀 ,可用于骨髓细胞总数计数 :同时 迅速加于 Wintrobe 红细胞压积管内 ,离心沉淀。沉淀 后分为 4 层 ,自上而下依次为 :脂肪层、血浆层、富含 各类有核细胞 (白细胞和幼红细胞等) 的“淡黄层 (buffy coat)”和红细胞层。从分层情况可以大致判断 骨髓的取材和“增生”情况。例如 ,淡黄层很少 ,表明 骨髓“增生”不好或已被大量血液稀释。反之 ,如淡黄 层很多 ,表示骨髓取材很好或骨髓“增生”明显活跃。 吸取淡黄层并与等量血浆混匀后涂片 ,可以从被血液 稀释的骨髓液中浓集骨髓细胞和发现大型的特殊细 胞 (如肿瘤细胞、巨核细胞、吞噬细胞等) ,方法简单易 行。但目前国内多不太重视 ,亟应推广。 如发现骨髓已被大量血液稀释 ,亦可在玻片上进 行简单的骨髓细胞浓集 ,方法是 :将骨髓液滴于一玻 片上 ,立即用一带针头的注射器吸取血滴中的血液 (被吸入的大都是血液 ,骨髓细胞和颗粒都将留在玻 片上) :或将玻片倾斜 ,将血液流到一纱布块上。根据 美国 CDC 规定 ,病人的一切血液和体液标本 ,均应视 为有传染性 ,上述操作时均须戴手套。 　3. 2. 2 　用 —特制推片 (宽度应略小于载玻片 ,以保 证所推血膜不致达到载玻片边缘) ,沾少量骨髓液 ,从 距离标记处远端向标记端推制涂片。所得涂片 ,应包 含少量未推开的骨髓的头部、涂片主体和羽毛状尾部 三部分。沾血量要少 ,涂片不宜过长。目前国外介绍 一种一端 (约 l/ 5 处)为毛玻璃的载玻片 ,作为骨髓检 查专用玻片 ,以便在涂片完成后用铅笔在毛玻璃处标 记病人的姓名、日期等 (一般平滑玻片难以用笔作标 记或易于洗脱) 。 　3. 2. 3 　在骨髓涂片之前 ,通过皮肤穿刺制备几张 外周血涂片 ,与骨髓片一起送检。注意 ,不要在骨髓 穿刺后制外周血涂片。因骨髓穿刺过程中病人处于 “应激”状态 ,外周血成分会发生变化。一般也不宜用 当天检测 CBC 的 EDTA 抗凝血涂片 ,因为含有抗凝剂 的血液和骨髓 ,特别是已放置一段时间之后 ,有些细 胞形态会发生改变[4 ] 。 　3. 3 　染色 　目前国内外仍用罗氏染色法作为常规 染色。良好的染色是准确鉴定血细胞的必要条件和 基本功 ,但往往被一些单位忽视。染色合格的标准 是 :无染色过深、过浅 ,无沉渣 :在油镜下观察 ,细胞色 彩 (红、蓝、紫、灰)对比鲜艳 ;胞浆中即使很小的颗粒 , 如嗜中性细胞、单核细胞、血小板的颗粒亦明显可见。 细胞化学染色 ,作为一种常规染色的补充 ,曾经 非常盛行。但随着经验的积累和细胞免疫表型、细胞 遗传学等新技术的广泛应用 ,以及细胞化学染色本身 操作繁琐、往往特异性不够强 ,方法难以标准化等弱 点 ,近年来已不再那样受重视。不少细胞化学染色已 逐渐被淘汰 (如 DNA 染色、RNA 染色等) 。当前认为 仍较有价值的 ,首推铁染色法 (普鲁斯蓝反应) ,有的 作者甚至认为应将其作为骨髓检查的常规方法[2 ] 。 其次是髓过氧化物酶 (MPO) ,迄今仍是区分髓系白细 胞、淋巴细胞和幼红细胞的有效方法。由于近年来采 用 MPO 染色法作白细胞分类的血细胞分析仪 (如当 前 Bayer 公司的 120 型血液分析仪)的广泛应用 ,发现 约有 1/ 2000 - 1/ 4000 的正常人有遗传性 MP0 缺乏 (均经细胞化学染色证实) 。家系调查表明 ,该病为常 染色体隐性遗传。目前 MPO 的 DNA 序列和 MPO 缺 乏者的基因突变类型已查明[5. 6. 7 ] 。有趣的是 ,这些 MPO 缺乏者一般都是健康的。但也有报道 ,缺乏 MPO 的中性细胞 ,不能杀灭其所吞噬的白色念珠菌 , 推测易发生真菌感染 ,因此 ,有临床意义。中性细胞 碱性磷酸酶 ,用于区别细菌与病毒感染、类白细胞反 应与慢性髓性白血病仍有一定意义 ;其它如用于鉴别 中性细胞和单核细胞的特异性和非特异性酯酶染色 , 以及用于鉴别毛细胞白血病的酸性磷酸酶染色 ,特异 性都不够强 ,必须与一些辅助性试验 (如抑制试验) 相 结合 ,才有一定价值。糖原染色 ( PAS 反应) 在鉴别红 白血病 (M6 型)的幼红细胞和区别高雪氏细胞和尼曼 - 匹克细胞方面仍有一定价值。而脂类染色 (苏丹黑 反应) ,因其与 MPO 染色反应的临床意义几乎完全相 同 ,因此目前国外学者认为 ,这两项试验中只要开展 一项即可[2 ] 。 　3. 4 　显微镜下细胞形态学检查 　3. 4. 1 　低倍镜浏览全片 　国内外的形态学家 ,都 十分强调骨髓涂片首先必须用低倍镜浏览全片 ,以便 对涂片有个初步、整体的了解 ,并确定下一步仔细的 形态学观察的重点。浏览观察的内容包括 :骨髓取材 如何 ,有否被血液稀释 ;有核细胞多少 (反映骨髓增生 情况) ,细胞在全片分布和染色情况 :巨核细胞数 (可 按增多、正常、减少报告) ,有无成簇或深染的大细胞 , ·89· Jiang Med Sci ,Apirl 2004 ,Vol 22 ,No 2 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 如可疑的肿瘤细胞、破骨细胞、成骨细胞、肥大细胞、 脂质积储细胞等。 　3. 4. 2 　油镜仔细观察各系列细胞 　在低倍镜浏览 观察的基础上 ,选择细胞展开较好、对全片细胞分布 有代表性的一个或数个区域以及涂片的尾部 ,用油镜 仔细观察。关于血细胞形态学 ,一般血液检验教科 书 ,均有详细描述 ,本文不拟重复 ,但有几点必须提 及。 关于中性细胞杆状核与分叶核的分类标准 ,目前 国内比较混乱 ,以至各家报告的血象和骨髓细胞分类 “正常值”相差极大。例如 ,据王凤计等收集 18 个省 市报告的血象分类资料统汁 ,其杆状核细胞的“正常 值”最少为 1. 06 ±1. 66 % ,最多为 16. 35 ±7. 64 % ,相 差达 15 倍 :骨髓最少为 14. 18 ±6. 25 % ,最多为 25. 10 ±4. 29 %[8 ] 。差异大的根本原因 ,在于分类的标准的 掌握不同。我们认为 ,由美国临床病理学会 (CAP) 提 出 ,并经美国临床检验标准委员会 (NCCLS) H20 - A 文件采纳的标准 ,容易掌握。其要点是 :具有弯曲、带 状的核形 ,核叶之间没有线样细丝形成者为杆状核 : 如果连接核叶之间的桥 (bridge) 内含有染色质 ,就不 算细丝 ,也判为杆状核 :如细胞核扭曲、缠绕、造成一 部分核压在另一部分核上 ,以至核叶间难以分辨时 , 一律判为分叶核。按照这一标准 ,外周血的杆状核参 考值为 5 % - 10 %[9 ] 。 众所周知 ,“网状细胞”一词 ,早巳废弃。过去的 所谓“网 状 细 胞”, 目 前 已 改 为“巨 噬 细 胞” (macrophage) ,或“组织细胞”( histocyte) 。有一个时 期 ,国内诊断为恶性网状细胞增生症 (简称恶网 ,后来 改称恶性组织细胞病)者甚多、甚滥。近年来 ,国外学 者通过应用细胞免疫表型分析等手段进行观察和研 究 ,多数认为这些细胞属于病理性 T 淋巴细胞 ,即这 种所谓的“恶网”,实际上是 T 细胞性淋巴瘤[8 ] 。,不 过 ,仍有一部分人认为这些细胞属于吞噬细胞系列 , 此一问尚在争论中。同理 ,过去所谓的“细胞外 铁”,实际上是被吞噬于吞噬细胞浆内的“内铁”,而不 是游离于细胞外的外铁 ,故应称为“吞噬细胞内铁”。 　3. 4. 3 　细胞分类计数 　是否要对每一份骨髓进行 细胞分类 ,一向存在两种观点。一种认为所有骨髓片 都要进行细胞分类计数 ;另一种认为不必进行详细的 细胞分类 ,而是和病理诊断一样 ,在仔细检查骨髓片 和外周血片以及必要的辅助试验后 ,结合临床病史、 体征和其它实验室检查 ,用文字叙述检查所见并提出 诊断意见和建议等即可[10. 11. 12 ] 。不少学者认为 ,抽 吸的骨髓不可避免地都已被血液稀释 ,而且被稀释的 程度不可预知也难以控制。骨髓不是均一的材料 ,其 中包含了骨髓颗粒、血液、脂肪和骨髓基质等 ,涂片又 难以标准化 ;骨髓的细胞量大 ,种类多 ,细胞在涂片中 的分布很不均匀 ,大型细胞如巨核细胞、巨噬细胞等 都位于涂片的尾部和边缘部 ,因此单凭分类计数 ,即 使数 500 个细胞 ,也不能真正反映骨髓细胞的全貌 , 主要还是靠全面浏览骨髓片 ,进行综合评价。例如 , 巨幼细胞性贫血或急慢性白血病的骨髓片 ,红、白血 胞系统都有典型的形态学变化 ,通过仔细的骨髓细胞 和外周血细胞形态学观察 ,结合一些辅助试验 ,一般 无需作细胞分类计数 ,即可发出报告 [10. 11 ] , 目前多数 学者为应两者结合。对于有经验的骨髓检验人员 ,在 多数情况下不需作细胞分类 ;少数情况 ,如血液病在 治疗中动态观察和评价疗效时 ,或少数一般检查难以 提供诊断意见 ,需要今后进一步系统观察的病例 ,需 要进行细胞分类。 　3. 5 　骨髓检查报告 　国内外一些血液学专著发表 过一些骨髓检查报告的内容、格式和范例。[10 ,11 ,12 ,13 ] 其中以我国医学科学院血液病研究所的报告单 最为详尽。根据 Bain 的意见 ,骨髓报告应包含以下 主要内容[2 ] :病人的临床情况和外周血常规检查结 果 ;骨髓穿刺部位及穿刺是否顺利 (有否被血液稀 释) 。有核细胞数量多少 , (国内往往以此作为骨髓增 生程度的评价 ,并将其分为若干等级) ;粒细胞与红细 胞系列之比 (M : E) ;然后对各个细胞系列进行描述 , 尤其是发现异常的细胞系列和特殊细胞 ,要重点描 述。最后写一个简单的摘要或结论 ( summary or con2 clusion) ,包括诊断意见和进一步观察和检查的建议。 对于诊断 ,有的可提肯定性诊断意见 ,有的则提支持 临床初诊或疑似诊断和否定 (不支持) 临床初诊等。 目前国内外盛行用电脑自动打印规格化的骨髓细胞 形态学报告 ,使用便利 ,并有利于报告的统一[13 ] ,但 打印彩色的典型细胞视野图片大可不必。 　3. 6 　骨髓检查资料和标本的存档 骨髓涂片、外周 血片连同骨髓检查报告单和申请单在检验完毕后必 须存档 ,以备在患者下次复查时对照之用 ,同时也是 很好的研究和教学资源。存档片包括已染色、已固定 但未染色和未固定未染色的涂片。都必须有明确标 志 ,并尽可能在干燥、防霉或封闭条件下长期保存 ,有 价值的标本片应加盖片封固。 参 考 文 献 [1 ]Ryan DH ,Cohen HJ . Bone marrow aspiration and morphology. In Hoffman R ,Benz EJ , Shattil SJ . eds. Hematology :Basic principles and practice 3rd ed[M] . Harcour Asia :Churchill Livingstone ,2001. 2460 - 2468. (下转第 127 页) ·99·江西医学检验 2004 年 4 月第 22 卷第 2 期 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 间 ,各位点的核心序列片段长度为 4bp , PCR 扩增效 率高 ,适合于陈旧检材。 STR 位点的扩增既有复合扩增技术 ,也有单个位 点同步扩增技术[3 ] ;就 PCR 产物检测方法而言 ,既有 荧光检测 ,也有简便经济的银染检测。本文采用复合 扩增技术 ,9 个 STR 位点在同一反应管内被同时扩 增 ,反应体系仅 10μl ,扩增所需模板 DNA 量少 ,因此 该方法适合于微量检材 ;扩增产物的检测采用激光诱 导荧光检测法 ,每个泳道内使用四色荧光标记和分子 量内参标准物 ,解决了等位基因重叠分布及谱带漂移 问题 ,比银染检测更为有效 ,提高了基因片段长度测 量的精度 ;使用 GeneScan3. 1 和 Genetyper2. 0 等软件 进行 STR 基因分型 ,分型结果更为准确、可靠 ,减少 了人为误差 ,且便于保存和管理。 HLA 虽然具有高度多态性 ,但 HLA - A、B 位点 是紧密连锁 ,因而计算 HLA - A、B 位点的亲子关系相 对机会是根据单倍体基因频率来计算的。由于 HLA - A、B 位点存在 : ①连锁不平衡 ②空白抗原 ; ③单倍 体基因频率分布不均匀。通过 132 例认定亲子关系 案例的统计 ,血清学方法的 RCP 值较低 (平均 96. 27 %) ,仅有 1 例案例的 RCP 值可以达到 99. 99 % ,大 部分案例还要增加酶型、单个位点 PCR 扩增联合运 用 ,才能达到国际认定标准 ,因而较为繁琐和费时 ;而 9 个 STR 位点的累计 RCP 值较高 (平均 99. 986 %) 。 根据 Odelberg[7 ]公式 ,ABO、Rh、MN、P 及 HLA - A、B 的累计非父排除概率为 0. 95686 ,而 9 个 STR 位 点的非父排除概率高达 0. 99986。我们在一例“弃婴” 上户口的案例中发现 ,根据血清学检查不能排除小孩 与当事人夫妇的亲生关系。(结果详见附表) ;增加 STR 位点基因分型 ,才表明小孩与当事人夫妻双方不 存在亲生关系。因此单独采用血清学方法鉴定亲子 关系会出现偏差。 STR 位点位于人类基因组高变区 ,STR 位点基因 突变问题不容忽视。从 34 例排除亲子关系的案例分 析 ,Profile Plus 试剂盒的 9 个 STR 位点中一般有 3～9 个位点可以排除 (平均 5. 8 个) ,排除位点较多。9 个 STR 位点中只有一个位点不符合遗传规律的案例有 2 例 ,一例为 D7S820 位点 ,另一例为 FGA 位点。增加 血型血清学方法以及其它的 4 个 STR 位点检测 ,结果 均符合遗传学规律 ;累计 RCP 值大于 99. 99 % ,因而 作出了认定亲生关系 ,同时证实上述案例中存在 STR 基因突变。 目前 ,运用 PCR - STR 方法鉴定亲子关系 ,通常 要 3 个以上 STR 位点不符合遗传规律时 ,才能排除亲 生关系。对有 1 或 2 个 STR 位点不符合遗传规律时 , 应慎下结论 ,增加其他的常染色体 STR 位点、Y - STR 位点或血型检测 ,综合分析 ,以保证结论的正确性。 参 考 文 献 [1 ]江斌 ,等. 中国广州汉族人群六个 STR 位点调查报告[J ] . 中华医学 遗传学杂志 ,2000 ,17 (1) :42 - 46. 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