蛋白质晶体结晶技术

蛋白质结晶的基本方法 结晶的方法分3种：批量结晶、蒸发扩散结晶、液/液扩散结晶。 ①批量结晶。批量结晶是最古老和最简单的蛋白质结晶方法。它将所要结晶的蛋白质与结晶剂按要求的浓度在实验开始时，就混合起来以达到所要的过饱和度。实验样液的体积在50μL～几个毫升左右。由于批量结晶的样液体积较大，所以此法并不适于对最佳结晶条件的探索实验。一种改进的方法叫微量分批结晶技术。 ②蒸发扩散结晶。摸索蛋白质结晶条件最常用的方法是应用蒸发扩散结晶的悬滴法。因为此法不但可节省样品而且可有效利用储存空间。此法是使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加,达到过饱和状态,最终析出晶体。晶体生长的基本装置是Linbro多孔组织培养板及用二甲基二氯硅烷硅化后的玻片或塑料盖玻片。悬滴法长晶体包括以下四个步骤： 第一步,在作结晶实验之前，最好对蛋白质样品进行离心，以除去不溶解的蛋白和杂质,以减少不必要的成核中心,此外，对蛋白质样品进行超滤，也是值得推荐的。 第二步,采用“吹气法”除去培养晶体用的组织培养板和盖玻片上可能带有的灰尘。 第三步，在组织培养板的孔中加入0.2-0.5ml经过超滤的含沉淀剂及添加剂的缓冲液,作为池液,孔边缘涂上真空脂。 第四步,吸1ul或2ul池液放到硅化后的盖玻片上,加等体积蛋白溶液至此池液上(这个体积比将决定平衡后的蛋白质浓度)，混合均匀，应避免气泡出现。 第五步,翻转盖玻片盖在孔上,检查密封是否良好。 上述方法中步骤2和4目前己可在自动化仪器中进行,但是,绝大部分拥有该仪器的实验室最终还是乐意采用手工方法。起始的条件实验常在感兴趣的区域(通常低于沉淀蛋白所需的浓度)进行，然后再进行实验条件的优化。一般的,蛋白质晶体生长所需的硫酸胺等沉淀剂浓度在理想浓度的1%或2%偏差范围内,但对于不同分子量的聚乙醇胺（PEG）则可宽松一些。晶体在数小时至数月后出现。通常，微晶可用作晶种以长出合用的晶体。 蒸发扩散结晶的另一种形式是坐滴法,坐滴中含池液和蛋白溶液各1－2ul。此方法对于以下情况非常适用：即使用非离子去垢剂作为添加剂面张力较低时；或用聚乙二醇或乙醇作为沉淀剂(由于凝结等问题,悬滴体积趋于增大)时；反向扩散导致液滴增大时；或结晶条件已确定,需要大量晶体时。 ③液/液扩散结晶又叫自由界面结晶。位于毛细管中的样品液约10L和结晶液由于存在浓度梯度，而在界面处发生自由扩散，从而导致蛋白质溶液的过饱和及随后的结晶。蛋白质结晶的影响因素 ①结晶蛋白质的纯度。获得高纯度的蛋白质是对其进行结晶的前提。Lin等通过采用FPLC快速液相色谱系统得到结晶级的蛋白质，同时发现用此法得到的蛋白质进行结晶，结晶的可重复性及获得晶体的衍射清晰度都大大提高。 ②过饱和度。溶液的过饱和度是蛋白质进行结晶的驱动力，其本质就是过饱和溶液的实际溶解度与饱和溶液的溶解度即该蛋白质的溶解度之间的化学势的差值。过饱和度的高低决定了结晶过程中成核及晶体生长的快慢，从而决定了晶体质量的好坏 ③温度。温度的变化会引起蛋白质溶解度的改变。研究表明，大多数的蛋白质的结晶是在4～22℃温度范围内进行。某些蛋白质的盐溶液在低温时的溶解度趋向升高，而在聚乙二醇及甲基丙二醇溶剂中的溶解度随温度降低而降低。 ④pH值。蛋白质为两性物质，结晶体系pH值的变化对其结晶行为有着重要的影响。对于有些蛋白质分子如：E.coli的闭环腺苷酸激酶，如果不考虑所得晶体的晶型，则结晶可在较宽的pH值范围内进行，但是如果涉及特定的晶型，则对pH值的要求非常严格，通常其波动范围不超过1。一般来讲，越靠近最佳pH值，晶型越单一，所得晶体质量越高。结晶剂 对于蛋白质的结晶，结晶剂的作用主要在于对溶剂水的影响而非对蛋白质分子的影响。一般来讲，结晶剂主要分为6类： ①盐类，如：磷酸盐、硫酸铵等； ②高分子直链聚合物，如：聚乙二醇PEG、聚乙烯醇PVA、聚乙烯吡咯烷酮PVP等； ③小分子多元醇MPD类，如：2-甲基2,4-戊二醇； ④有机溶剂类，如：乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、叔丁醇等； ⑤磺酰类染料； ⑥去离子水。在实际工作中，通常使用混合结晶剂以获得更好的实验效果。压力 Sazaki等用双光束干涉仪测定了高压下的溶菌酶蛋白四方结晶及正交结晶的溶解度变化。实验表明，随着压力的增高其正交结晶的溶解度降低，而四方结晶的溶解度增大。可能是由于不同晶型的蛋白质分子的疏水亲水程度不同，随着压力的变化，与水的作用效果不同并反映出溶解度的变化的不同。因此，已有越来越多的研究者开始利用压力作为蛋白质结晶过程中的一个重要的调整参数以得到目的产物。