猪链球菌的检测 PPT课件

猪链球菌的检测九江市疾病预防控制中心梁剑锋2011年8月15日一、病原学二、发病机制三、流行病学四、临床表现五、预防与控制六、病原学鉴定七、鉴别诊断人感染猪链球菌病是由猪链球菌（streptococcussuis）感染人而引起的人畜共患性疾病。从事猪的屠宰及加工等人员为高危人群，本病主要通过皮肤的伤口而感染。临床表现为发热、寒战、头痛、食欲下降等一般细菌感染症状，重症患者可合并中毒性休克综合征（toxicshocksyndrome,TSS）和链球菌脑膜炎综合征（streptococcusmeningitissyndrome,SMS）。1968年丹麦学者首次报道了3例人感染猪链球菌导致脑膜炎并发败血症病例，1975年荷兰也出现了散发病例的报道。此后，中国香港、英国、加拿大、德国、法国、美国、澳大利亚、比利时、巴西、西班牙、日本、泰国、瑞典及中国内地陆续有人感染猪链球菌病的报道。截至2000年，全球已报道了200多例人感染猪链球菌病病例，报道病例较多的国家或地区普遍养殖业发达或有食用猪肉的习惯，病例呈高度散发态势。在我国，1998年江苏省报告了人感染猪链球菌病，发病25例，死亡14例；2005年6月至8月，四川省发生的人感染猪链球菌病爆发疫情，为国内外迄今为止见于报道的最大规模人感染猪链球菌病疫情，发病数204例，死亡38例。链球菌分类：1、根据溶血现象分类1）甲型溶血性链球菌：称甲型溶血或溶血，溶血环中的红细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。2）乙型溶血性链球菌：称乙型溶血或溶血，溶血环中的红细胞完全溶解，致病力强。3）丙型链球菌：无溶血环，一般不致病。猪链球菌α溶血(偶而也有弱β溶血或α溶血、β溶血现象均不明显)，某些菌株在马血培养基上β溶血。链球菌分类：根据抗原结构的分类兰氏分类：按多糖类抗原（C抗原）将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群)，近年又增加U、V群，共20群，每个群有1个或多个种。一、病原学猪链球菌属链球菌（streptococcus）科，革兰染色阳性，呈球形或卵圆形。链球菌科有30个以上的菌属，分类有数种方法，根据链球菌兰斯菲尔德（Lancefield）分类法，将猪链球菌分到了R、S、T群。近年根据细菌荚膜多糖抗原的差异，将猪链球菌分为35个血清型，即1～34型和1/2型，其中1/2型为同时含有1型和2型抗原的菌株。2型猪链球菌主要是R群，而1型猪链球菌主要是S群。迄今为止，文献报道感染人的猪链球菌分别是2型、1型和14型，尤以2型为常见，也是最常被分离到的猪链球菌型别，其他两个型别仅有个案报道。1、猪链球菌的理化特性该菌无芽胞，有荚膜，在血平板上生长呈细小菌落，无色，半透明，直径0.5～1mm，边缘整齐，凸起，光滑。根据溶血情况分类，猪链球菌在羊血平皿上表现为α溶血，而在马血平皿上表现为β溶血。适宜的培养基为血培养瓶及血平皿，培养温度36℃、时间18～20小时。新分离的猪链球菌，形态较典型，链长可达20多个菌体；二代培养后细菌形态不典型,甚至变为革兰阴性球杆菌,不成链。因此在诊断、研究时，对刚分离到的细菌形态进行观察十分重要。猪链球菌对环境理化因素的抵抗力差，对常见消毒剂都敏感。2、毒力因子目前认为，较为重要的猪链球菌毒力因子主要有：1）荚膜多糖（CPS）：是目前惟一被确认的，也是最为重要的毒力因子。2）溶菌酶释放相关蛋白（muramidase-releasedprotein,MRP）和细胞外蛋白因子（extracellularfactor,EF）：除荚膜多糖外，这两种蛋白是最常用于评价猪链球菌毒力的指标。3）猪链球菌溶血素（suilysin）：溶血素被认为是几种细菌的主要毒力因子，可能在猪链球菌侵入和裂解细胞的过程中发挥着重要作用。4）44000蛋白、IgG结合蛋白及其他因素：44000蛋白为2型猪链球菌的胞壁蛋白，IgG结合蛋白属热休克蛋白，有报道认为也与毒力相关。菌毛(fimbriae)、黏附因子(adhesions)也是一些细菌常见的毒力因子。3、MLST分析对我国江苏和四川省人感染猪链球菌病爆发期间分离到的菌株，进行多位点序列分型（multilocussequencetyping,MLST），证实均为序列7型（MLST7型）。二、发病机制猪链球菌感染的主要传播途径是经伤口的直接接触感染。猪链球菌经皮肤或黏膜的伤口进入人体，进入血液循环后在血液中迅速生长和繁殖，即败血症，细菌随血液循环进入人体的各器官、组织，致多器官、组织发生病变。细菌并释放毒素，致机体发生严重的中毒反应，即毒血症。重症感染及细菌毒素的作用，致血管内皮损伤，以及血液处于高凝状态，并发弥散性血管内凝血(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)，导致全身性微循环障碍，多器官功能衰竭。人感染猪链球菌临床主要有两种严重表现形式，即SMS和TSS。SMS的主要病理表现是化脓性脑膜炎，脑膜血管充血明显，并有大量中性粒细胞浸润，而其他脏器的病理改变轻微。TSS的特征是败血症休克合并DIC，病理表现为全身多器官、组织实质细胞变性和坏死，以及不等量的中性粒细胞浸润，间质内血管明显充血、漏出性出血，毛细血管内微血栓（透明血栓）形成。主要受累器官的表现为：①皮肤、黏膜（胃肠道、呼吸道及泌尿生殖道）与浆膜出现瘀点和瘀斑；心、肝、肾、肾上腺、食管和肠道等脏器出血，血液不凝固，颜色鲜红；部分器官（肺、肾）毛细血管内有数量不等的微血栓（透明血栓）形成，后者呈PTAH染色阳性，支持为纤维蛋白性血栓。②肺充血、水肿，灶性和片状出血，以及毛细血管内微血栓形成。③急性脾炎。④肝脏轻度肿大，肝细胞点状、灶性或片状坏死。⑤肾脏充血、出血，肾小球毛细血管内数量不等的微血栓形成。⑥心肌纤维变性、点状坏死及炎细胞浸润，间质血管充血伴多灶性出血。⑦浆膜腔积液，如胸腔、心包腔和腹腔积液等。病变以肺、肾脏和心脏为甚，而脑和脑膜的病变不明显。⑧有的病例可见皮肤有伤口，常见于手臂与足等处。重症猪链球菌感染者可合并DIC。病理表现为全身多器官、组织内毛细血管漏出性出血，血液不凝固，继而导致多器官功能衰竭和休克。休克是强烈的致病因子作用于机体引起的全身危重病理过程，多种原因可致休克。重症人感染猪链球菌病患者发生休克应是多种原因所致，包括①某些炎性介质的作用引起静脉和毛细血管扩张，致血管总容积增加；②DIC致广泛性毛细血管漏出性出血使血容量减少；③心肌病变致心输出量减少等。SMS患者，因脑脊髓膜血管高度扩张充血，蛛网膜下腔增宽，大量中性粒细胞、纤维蛋白及液体渗出导致脑脊液量增加，而引起颅内高压，患者可有头痛、喷射状呕吐以及病理征阳性等症状和体征。因颅神经受累，患者可有不同程度的听力障碍，甚至永久性耳聋。三、流行病学1、传染源感染猪链球菌的病（死）猪是人感染猪链球菌病的主要源头。另有文献报道，一些病死的鹿、羊、鸡、鸭、马、猫、狗及反刍动物体内能分离到2型猪链球菌，但这些动物是否为传染源尚待进一步研究。目前尚无证据表明人感染猪链球菌病能在人与人间传播。2、传播途径人感染猪链球菌主要因接触被猪链球菌感染的生猪和未加工的猪肉制品，经皮肤破损的伤口或眼结膜而感染。是否能通过呼吸道，借助气溶胶由病猪而感染人仍有待深入研究。3、人群易感性人群普遍易感。直接接触感染的病（死）猪或猪肉制品的人群为高危人群，有皮肤破损者极易发病。国外多者认为人感染猪链球菌病是人类一种重要的动物源性职业病。免疫功能缺陷的人群感染猪链球菌，往往病症较重。4、流行特征本病的流行特征还不完全清楚，人感染猪链球菌病常伴随猪群中链球菌病的爆发而高度散发，已报道的人感染猪链球菌病例常发生于夏季。猪间猪链球菌感染的扩散可能与高温潮湿的环境密切相关，因此高温潮湿也很可能是间接导致人感染猪链球菌病夏季发病增加的因素。人感染猪链球菌病与性别、年龄没有必然联系，但与职业有很大关系，从事猪的养殖或者是参与猪的屠宰、加工、配送、销售及烹调的人员均属高危人群，尤其是宰杀病（死）猪者危险性更大。四、临床表现潜伏期数小时～7天，一般为2～3天。潜伏期长短与感染病原体的毒力、数量以及机体免疫力等因素有关。一般来说，潜伏期越短，病情越重。1、临床症状和体征急性起病，轻重不一,表现多样。1）感染中毒症状：高热、畏寒、寒战，伴头痛、头晕、全身不适、乏力等。2）消化道症状：食欲下降、恶心、呕吐，少数患者出现腹痛、腹泻。3）皮疹：皮肤出现瘀点、瘀斑，部分病例可出现口唇疱疹。4）休克：血压下降，末梢循环障碍。5）中枢神经系统感染表现：脑膜刺激征阳性，重者可出现昏迷。6）呼吸系统表现：部分严重患者继发急性呼吸窘迫综合征（ARDS），出现呼吸衰竭表现。7）听力、视力改变：听力下降，视力下降，且恢复较慢。8）其他：少数患者可出现关节炎、化脓性咽炎、化脓性淋巴结炎等，严重患者还可出现肝脏、肾脏等重要脏器的功能损害。2、临床分型根据临床表现的不同，可以分为以下类型。1）普通型：起病较急，发热、畏寒、头痛、头晕、全身不适、乏力，部分患者有恶心、呕吐、腹痛、腹泻等表现，无休克、昏迷表现。2）休克型：在全身感染基础上出现血压下降，成人收缩压低于90mmHg（1mmHg＝0.133kPa），脉压小于20mmHg，伴有下列两项或两项以上：①肾功能不全；②凝血功能障碍，或弥散性血管内凝血；③肝功能不全；④急性呼吸窘迫综合征；⑤全身皮肤黏膜瘀点、瘀斑，或眼结膜充血；⑥软组织坏死，筋膜炎，肌炎，坏疽等。3．脑膜炎型：发热、畏寒、全身不适、乏力、头痛、呕吐。重者出现昏迷。脑膜刺激征阳性，脑脊液呈化脓性改变。4．混合型：兼有休克型和脑膜炎型表现。五、预防与控制人感染猪链球菌病的预防控制应以疫情监测、严格控制传染源、切断传播途径等综合性防治措施为主。1、疫情监测各级各类医疗机构，尤其在已经发生动物疫情和曾经发生人感染猪链球菌病疫情的地区及周边地区，要开展对不明原因发热病例的监测。接诊可疑不明原因发热患者必须询问流行病史，如发现有病（死）猪接触史，应在积极治疗的同时，立即向当地疾病预防控制机构报告。2、管理传染源应在当地有关部门的指导下，对病（死）家畜进行消毒、焚烧、深埋等无害化处理。严禁屠宰、加工、贩卖病（死）家畜及其制品。3、切断传播途径1）对直接接触（如宰杀、洗切加工、搬运等）感染的病（死）猪或猪肉制品的人员，开展为期1周的医学观察，主要观察体温变化，一旦出现发热应立即就诊。2）做好疫点的消毒处理。对患者家庭及其畜圈、禽舍等区域和患者发病前接触的病（死）猪所在家庭及其畜圈、禽舍等疫点区域进行消毒处理。患者的排泄物、分泌物、呕吐物等应用消毒液消毒。3）根据实际情况，划定疫点、疫区、受威胁区，必要时采取一定管制措施。4、保护易感人群1）个人防护动物疫情发生地的生猪屠宰、加工、销售等从业人员或其他相关人员应做好个人防护工作，特别是从事动物疫情处理的工作人员应采取严格的个人防护措施。从事人感染猪链球菌病例调查、采样、临床救治、实验室检测和消毒工作的医务卫生人员均应采取严格的个人防护措施，严防发生感染。2）药物预防对直接接触感染的病（死）猪或猪肉制品的人员可用阿莫西林进行预防性服药，每次0.5g，每天3次，连服3天。3）健康教育采取多种形式开展健康宣传教育，向群众宣传传染病和人畜共患病防治知识，告知群众不要宰杀、加工、销售、食用病（死）家畜。5、流行病学调查发现人感染猪链球菌病疫情后，疫情发生地县级疾病预防控制机构要立即组织开展流行病学调查，在最短时间内对所报告病例进行核实，进行个案调查。六、病原学鉴定猪链球菌的实验室检测主要是对细菌培养所获得的菌株分离后进行生化鉴定、血清分型以及特异性基因检测。目前尚无成熟的特异性抗体检测方法。1．标本采集及病原体分离采集患者的血液、脑脊液或尸检标本，直接接种于猪链球菌最佳培养基进行培养分离。如条件所限，不能立即接种，应4℃保存或冷藏送检，争取及时培养。1）样品采集对病猪，最急性和急性病例可无菌采集死亡猪的心、肝、肺、肾、脾脏、淋巴结等组织，慢性病例如关节炎型一般采取关节液及周围组织；对活猪可采取扁桃体拭子、鼻腔拭子。2）分离培养①送检菌株的分离划线接种于普通琼脂绵羊血平板，36℃±1℃培养24h±2h，如茵落生长缓慢，可延长至48h±2h，使之形成单个菌落，以供鉴定用。②病料的分离和触片检查用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于普通琼脂绵羊血平板，于36℃±1℃培养24h±2h，如菌落生长缓慢，可延长至48h±2h后观察。同时取病料做组织触片，姬姆萨染色（按GB/T4789.28的方法进行染色）后镜检，如见球菌则表明病料中可能含有链球菌。③扁桃体和鼻腔拭子的分离扁桃体和鼻腔拭子样品加入到含有SmL灭菌的选择性THB增菌液的试管中，于36℃±1℃培养24h±2h后，划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板。④动物产品的均质、增菌和分离以无菌操作取检样25g，加入装有225mL灭菌选择性THB增菌液的广口瓶内，均质，于36℃±1℃培养24h±2h后，划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板。3）初步鉴定猪链球菌2型在36℃培养24h后，在普通琼脂绵羊血平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3mm-lmm，大多数菌株呈α溶血，部分菌株产生β溶血。将可疑菌落做革兰氏染色和过氧化氢酶试验。本菌为革兰氏阳性球菌，菌体直径约1μm，固体培养物以双球菌为多，少量呈3个-5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢，能形成荚膜（按GB/T4789.28的方法进行染色）。本菌过氧化氢酶试验均为阴性。菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢酶试验符合者，可初步确定为链球菌。革兰染色镜下成对出现，革兰氏阳性链球菌猪链球菌显微镜形态猪链球菌鲜血琼脂培养菌落形态羊血平皿：α溶血2．生化鉴定对分离到的菌株应用API生化鉴定系统的Api20-step手工鉴定条及Vitek-compact2或其他生化鉴定系统进行鉴定，可直接鉴定到种。经初步鉴定后，做5%乳糖、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验。猪链球菌2型发酵5%乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶苷，不发酵甘露醇和山梨醇，不水解马尿酸钠。3．血清分型对经过生化鉴定的菌株用猪链球菌1～34型血清或用单克隆抗体进行分型。实验方法：取1滴链球菌分型血清或单克隆抗体悬滴于载玻片上，与1滴菌悬液充分混合，或用接种环刮取单个菌落直接与血清混合，观察是否出现凝集反应，同时用生理盐水做对照。将可疑菌落接种THB肉汤（见第B．3章），于36℃±1c培养18h±2h，取1.5mL培养物，10000r/min离心3min，弃上清，用100μL生理盐水将沉淀悬浮，取25μL菌体悬浮液分别和等体积的25μL生理盐水、猪链球菌2型阳性血清作玻片凝集试验，其中生理盐水作为稀释液对照并观察待检菌株是否有自凝现象。同时设阳性菌株对照。在生理盐水对照不凝集，阳性菌株凝集的情况下，待检菌株出现凝集为阳性反应。4．PCR基因鉴定挑取分离纯化的菌落或选择平板上湿润的可疑菌落，利用特异引物进行PCR扩增。进行链球菌属特异性引物（tuf）、猪链球菌种特异性、猪链球菌2型荚膜多糖基因（cps2j）、猪链球菌溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段（mrp）及猪链球菌溶血素基因（sly）检测。对已经大量使用抗菌药物治疗的患者，可将采集标本直接进行PCR法检测，确认猪链球菌种特异性基因（16SrRNA），以及特有的毒力基因，若为阳性者则作为确诊病例。基因鉴定，使用PCR技术和对PCR产物进行序列分析检测猪链球菌种特异性16SrRNA。上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa检测猪链球菌荚膜多糖基因（cps2j）上游引物：gttgagtccttatacacctgtt下游引物：cagaaaattcatattgtccacc检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段（mrp）上游引物：ggtataccttgctggtaccgttc下游引物：agtctctacagctgtagctggPCR反应的条件：94℃预变性5分钟;94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，25个循环，最后延伸72℃、5分钟。取5微升扩增产物在1.2℅的琼脂糖凝胶中进行电泳。5、检测过程中防止交叉污染的措施1）抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，121℃、15min-20min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。2)检测过程①PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单方向进行。②实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。③各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。④所有溶液、水、耗材和器具要121℃、15min-20min灭菌，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在20℃-25℃贮存的试剂中，可加0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑤装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。⑥茼PCR区中，最好能在PCR操作箱中加入PCR反应各组分。⑦实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。⑧可使用UDG和dUTP系统控制污染。⑨检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。6、符合以下特性者应判为猪链球菌2型；——猪链球菌2型在36℃培养24h后，在普通琼脂绵羊血平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3mm-lmm，大多数菌株呈a溶血，部分菌株产生p溶血；——革兰氏阳性球菌，单个、成对或成链存在；——过氧化氢酶试验阴性；——发酵5%乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶苷，不发酵甘露醇和山梨醇，不水解马尿酸钠（本试验项目具有不确定性，鉴定时供参考），或法国生物一梅里埃公司AP120Strep生化鉴定系统鉴定为猪链球菌2型者；——与猪链球菌2型阳性血清玻片凝集试验阳性；——猪链球菌2型定型PCR检测阳性。7、符合以下特性者的菌株可判定为致病性猪链球菌2型菌株：——符合6的特性；‘——主要毒力基因(mrp、ef、orf2、sly)全部或之一PCR检测阳性。七、鉴别诊断本病应与其他可致发热、瘀点、瘀斑、休克、多器官功能损害等表现的疾病相鉴别，尤其应注意与下列疾病相鉴别：1.其他链球菌TSS：A组链球菌以及所产生的链球菌致热外毒素（streptococcalpyrogenicexotoxins，SPE），如SPE-A、SPE-C、SPE-F等可导致严重TSS，B组链球菌、C组链球菌、G组链球菌以及草绿色链球菌中的缓症链球菌感染也均可引起TSS。结合患者发病前7天内无病猪或死猪等家畜直接接触史，可与人感染猪链球菌病相鉴别，PCR或免疫学方法检测SPE-A等有助于诊断；感染部位标本或血培养鉴定为A组链球菌或其他链球菌即可鉴别。2.葡萄球菌TSS（StaphyTSS）：是由金黄色葡萄球菌产生的中毒性休克综合征毒素-Ⅰ（TSST-Ⅰ）和肠毒素引起、与人感染猪链球菌病临床表现相似的TSS，分为月经相关性TSS（mTSS）和非月经相关性TSS（nmTSS）两种类型。年轻妇女、有阴道月经塞使用史、月经期突然发病等有助于mTSS诊断；TSS继发于局灶性感染、外伤、侵入性诊疗操作后，应注意nmTSS的可能性。临床标本培养分离出金黄色葡萄球菌，或特异性TSST-I或肠毒素A、B、C、D、G等阳性结果即可鉴别。3.其他疾病：还应注意与其他革兰阳性细菌败血症、感染性休克（septicshock）、爆发型流行性脑脊髓膜炎、肾综合征出血热（HFRS）及全身炎症反应综合征（SIRS）等疾病相鉴别。后期应注意排除其他严重感染所致的多器官功能损害综合征（MODS）或多器官功能衰竭（MOF）。