维药材刺山柑中总黄酮的提取分离及治疗类风湿关节炎的药效学研究硕士学位论文

分类号： R96 学校代码： 10758 密 级： 公 开 学 号： 07020012 硕士学位论文 维药材刺山柑中总黄酮的提取分离及治疗类风湿关节炎的药效学研究 Study on Pharmacology of Rheumatoid Arthritis and Situation of Extraction and Separation of Total Flavonoid in Capparis spinosa L., an Uyghur Traditional Herbal 研究生姓名 导师姓名及职称 合作导师姓名及职称 学位门类级别 理学硕士 专业名称 生物化学与分子生物学 研究方向 生化药学 所在学院 农学院 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名：　　 　 　　日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 指导教师签名：　　 　 　　 日　　期：　　 　 　　 使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名：　　 　 　　 日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权　　 　 　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 指导教师评阅书 指导教师： 一、撰写（设计）过程 1、学生在论文（设计）过程中的治学态度、工作精神 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 2、学生掌握专业知识、技能的扎实程度 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 3、学生综合运用所学知识和专业技能分析和解决问的能力 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 4、研究方法的科学性；技术线路的可行性；设计的合理性 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 5、完成毕业论文（设计）期间的出勤情况 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 二、论文（设计）质量 1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 三、论文（设计）水平 1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 建议成绩：□ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 （在所选等级前的□内画“√”） 指导教师： （签名） 单位： （盖章） 年 月 日 评阅教师评阅书 评阅教师评价： 一、论文（设计）质量 1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 二、论文（设计）水平 1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 建议成绩：□ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 （在所选等级前的□内画“√”） 评阅教师： （签名） 单位： （盖章） 年 月 日 教研室（或答辩小组）及教学系意见 教研室（或答辩小组）评价： 一、答辩过程 1、毕业论文（设计）的基本要点和见解的叙述情况 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 2、对答辩问题的反应、理解、表达情况 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 3、学生答辩过程中的精神状态 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 二、论文（设计）质量 1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 三、论文（设计）水平 1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 □ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 评定成绩：□ 优 □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 （在所选等级前的□内画“√”） 教研室主任（或答辩小组组长）： （签名） 年 月 日 教学系意见： 系主任： （签名） 年 月 日 维药材刺山柑中总黄酮的提取分离及治疗类风湿关节炎的药效学研究 摘 要 目的：探讨刺山柑总黄酮的醇溶超声提取、大孔吸附树脂分离的最佳条件，及其抗炎、镇痛、调节免疫以及对大鼠佐剂性关节炎的干预作用。 方法：以新疆吐鲁番野生刺山柑果实为原料，正交设计优化醇溶超声方法提取刺山柑中总黄酮，选择最佳提取条件；利用静、动态吸附-洗脱试验筛选出分离效果较好的大孔吸附树脂对刺山柑中总黄酮成分进行纯化；建立醋酸致小鼠扭体、电热板致痛、二甲苯致小鼠耳廓肿胀以及蛋清致小鼠足趾肿胀四种实验模型，对刺山柑总黄酮抗炎镇痛效果进行初步研究；利用环磷酰胺对小鼠皮下多点注射制造免疫低下模型，与阳性药左旋咪唑对比，考察刺山柑中总黄酮对正常以及免疫低下小鼠的免疫调节作用；通过对大鼠右后足趾皮下注射弗式完全佐剂制造大鼠佐剂性关节炎模型，于给药21天时以大鼠足趾肿胀趋势、关节病变及滑膜病理变化的组织切片观察、局部炎症中炎症因子含量、血清中细胞因子含量、血液常规检测及血液沉降率、类风湿因子等生理生化指标的变化，对刺山柑总黄酮治疗类风湿性关节炎疾病的药效学进行研究。 结果：正交实验筛选出在室温条件下，以浓度为70%的乙醇、超声60min、料液比为1：20时提取刺山柑总黄酮效果最佳；动、静态吸附-洗脱实验筛选出H103型大孔树脂的分离纯化效果最优，通过芦丁品回归方程测得总黄酮含量为63.98%，其供试药总黄酮含量为15.45mg/ml。在小鼠抗炎镇痛试验中，刺山柑中总黄酮能够有效减少醋酸所致小鼠扭体的次数，延长热板致小鼠痛阈反应时间，缓解二甲苯致小鼠耳廓肿胀及蛋清致小鼠足趾肿胀。对于正常小鼠和免疫低下小鼠，刺山柑中总黄酮均能有效增加免疫器官的脏器系数、增强巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力、提高脾细胞增殖活性，达到提高免疫力的作用。在大鼠佐剂性关节炎试验中，其能够有效缓解组织炎症引起的肿胀、保护滑膜组织，降低炎性细胞浸润；在血液生化指标检测中，刺山柑中总黄酮可降低炎症介质和细胞因子IL-6、TNF-α含量，减少白细胞聚集，防止血液沉降速率的加快，达到治疗类风湿性关节炎的目的，其治疗效果随剂量的升高呈现一定的量效关系。 结论：通过对小鼠抗炎镇痛和免疫学实验研究表明，刺山柑中总黄酮能够有效减缓炎症反应，降低疼痛发热症状，增强机体免疫力；对于大鼠佐剂性关节炎实验中，刺山柑中总黄酮能降低局部炎症，保护关节滑膜组织，干预花生四烯酸途径以及淋巴循环，间接导致体内炎症介质和细胞因子降低至正常水平，从而可能起到治疗类风湿性关节炎疾病的作用。 关键词：刺山柑；黄酮；大鼠；佐剂性关节炎 Study on Pharmacology of Rheumatoid Arthritis and Situation of Extraction and Separation of Total Flavonoid in Capparis spinosa L., an Uyghur Traditional Herbal Abstract AIM: This study was conducted to select the best condition on the method of ethanol-ultrasonic extraction and separation with macroporous resin from total flavonoid in Capparis spinosa L. to research changes in anti-inflammatory, analgesic and immunology. The treatment of flavonoid to adjuvant-induced arthris rats as well. METHODS: Taken the wild fruit of Capparis spinosa L. in Turpan as experiment material. Optimizated the extaction and separation of total flavonoid with macroporous resin by orthogonal design. The mocroporous resins was used to separate the flavonoids, which were selected the best by static and dynamic absorption-elution. The experiment of four anti-inflammatory and analgesic models which were acetic acid writhing test in mice, heating plate pain test, xylene induced the ears swelling test and egg white induced the toes swelling test were established in order to study on the first step effects of anti-inflammatory and analgesic on flavonoids in fruit of Capparis spinosa L. Used cyclophosphamide to mouse multi-hyodermic to set low-immunoreaction modles. Compared to levamisole to review enhance immunoreaction of normal mouse and low-immunoreaction mouse.Adjuvant-induced arthris rats were subject to establishing modles using Freund’s complete adjuvant. When the 21st day, study on treatment effect to rheumatoid arthritis on total flavonoid in Capparis spinosa L., include swell trend of rats’ toe, pathological changes of arthrosis synovial membrane tissues, the changes of cytokines in blood serum, routine check-up of blood, detect the erythrocyte sedimentation rate and rheumatoid factor. RESULTS: At the room temperature, ethanol consetration was 70%, ultrasonic time was 60 minutes, solid-liquid ratio was 1:20. The best resin of H103 was screened out to fit. The content of total flavonoids was 63.98% by standard curve, and concentrate was 15.45 mg/ml. The result shows that the drug could reduce analgesic and inflammatory. The immunity of mouses was improved by taken flavonoids in fruit of Capparis spinosa L. In the experiment of adjuvant-induced arthris rats, the swells can be catabatic, synovial membrane tissues can be protected, hyperplasy was marked, IL-6 and TNF-α was decressed in blood serum, leucocyte and erythrocyte sedimentation rate were reduced. In that case, rheumatoid arthritis can be healed by taken flavonoid in Capparis spinosa L. CONCLUSION: The result of anti-inflammatory and analgesic experiment and immunology experiment showed that the flavonoid in Capparis spinosa L. can reduced inflammatory reaction, depressed analgesic symptom, enhanced body’s immunoreaction. The adjuvant-induced arthris rats experiment showed that the flavonoid in Capparis spinosa L. could protected synovial membrane tissues, intervened the way arachidonic acid and lymphoid circle to induce inflammatory and cytokines reduced to the natural level indirectly. The flavonoid in Capparis spinosa L. could cure rheumatoid arthritis finally. Key words: Capparis spinosa L.; flavonoids; Rats; Rheumatoid Arthritis 目 录 第1章 绪论………………………………………………………………1 1.1 类风湿关节炎的发病机制…………………………………………………1 1.2 类风湿关节炎的治疗理念…………………………………………………5 1.3 维吾尔药材刺山柑对类风湿关节炎的治疗作用……………………………9 1.4 本论文研究的目的和内容………………………………………………11 第2章 正交设计优化大孔吸附树脂分离纯化维药材刺山柑中总黄酮的研究…………………………………………………………………13 2.1 实验材料………………………………………………………………13 2.2 试验方法………………………………………………………………13 2.3 结果与分析………………………………………………………………18 2.4 讨论……………………………………………………………………21 第3章 维药材刺山柑中总黄酮对小鼠抗炎镇痛及免疫调节的影响…………………………………………………………………23 3.1 实验材料………………………………………………………………23 3.2 试验方法………………………………………………………………23 3.3 结果与分析………………………………………………………………27 3.4 讨论……………………………………………………………………33 第4章 维药材刺山柑中总黄酮对大鼠佐剂性关节炎的预防和治疗作用的研究…………………………………………………………………35 4.1 实验材料………………………………………………………………35 4.2 试验方法………………………………………………………………35 4.3 结果与分析………………………………………………………………40 4.4 讨论……………………………………………………………………51 第5章 结论………………………………………………………………53 参考文献………………………………………………………………54 致谢………………………………………………………………58 作者…………………………………………………………………59 第1章 绪论 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性、进行性、侵袭性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病，其特征是对称性多关节炎，并伴有皮下结节及淋巴结肿大等关节外表现。随着病情会逐渐发展，最终导致关节畸形、功能丧失，具有很高的致残率。 类风湿关节炎治疗的主要目的在于减轻关节炎的炎症反应，抑制病变发展及不可逆骨质破坏，尽可能保护关节和肌肉的功能及达到病情完全缓解。经过近20年的发展，治疗类风湿关节炎的药物已从单纯的抗炎镇痛的对症治疗，发展到使用病变缓解性药物。相对西药言，中药治疗药物的不良反应小、治疗周期短、适用人群广泛，而被大量适用[1]。本文对类风湿关节炎的发病机制、药物治疗和植物用药方面介绍，以及维药材刺山柑对类风湿关节炎治疗的研究。 1.1 类风湿关节炎的发病机制 类风湿关节炎(RA)是一种系统性慢性炎症性自身免疫性疾病，其基本病理特征是周身关节滑膜炎和血管翳形成。理论上，血管翳中的免疫病理成分可分为免疫和侵蚀两部分[2]。抗原或自身抗原通过HLA递呈激活T细胞，并引起其他免疫细胞的活化，通过这些炎性细胞及其细胞因子、自身抗体和炎性介质导致RA的自身免疫反应发生，而RA发病后体内或外源性抗体抗原的参与使RA的病变过程不断恶化。 在正常生理情况下，机体存在针对自身抗原的多种类、低水平的自身反应性T、B细胞和自身抗体，具有重要的生理功能，可以清除凋亡过程中产生的变性自身抗原，维持内环境稳定。在自身免疫病患者体内，由于内源性或外源性因素，导致针对某些自身抗原的反应性增强，产生寡克隆致病性自身反应性T、B细胞的活化和高滴度的特异性自身抗体，进而导致免疫性病理损伤。自身抗原和抗体的存在，是所有自身免疫病的共同特征[2]。 SHAPE \* MERGEFORMAT 图1-1 类风湿关节炎的病理机制[3] 1.1.1 自身抗原和抗体 自身抗原是指具有免疫原性的自身组织成分。在正常生理情况下，机体存在针对自身抗原的多种类、低水平的自身反应性T、B细胞和自身抗体，具有重要的生理功能，可以清除凋亡过程中产生的变异性自身抗原，维持内环境稳定[4]。在自身免疫患病者体内，由于内源性活外源性因素，导致针对某些自身抗体的反应性增强，产生寡克隆致病性自身反应性T、B细胞的活化和搞滴度的特异性自身抗体，进而导致免疫病理损伤。 1.1.2 T淋巴细胞[5] 抗原依赖性T淋巴细胞的活化可能是最早发生改变的，之后参与炎症反应的其他机制得以启动，包括滑膜衬里层细胞和内皮细胞的活化和增殖、骨髓和外周血中其他炎性细胞的参与和活化、自身抗体的产生、巨噬细胞和成纤维细胞样滑膜细胞活化并分泌细胞因子和蛋白酶等。 事实证明，T淋巴细胞，尤其是CD4+T淋巴细胞在RA发病中起着非常重要的作用，这一理论已经从一下多方面研究得到了证实：浸润滑膜的细胞中40%为T淋巴细胞；滑模组织或滑液中存在T细胞来源的细胞因子；T细胞依赖性关节炎模型的建立；主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ类基因与RA发病和疾病严重性之间存在的密切相关性；靶定T细胞治疗使RA症状和体征得到改善等。导致RA发病的最可能原因使T淋巴细胞收到抗原刺激后发生了的活化，而随后的整个病理过程中，T细胞与参与免疫反应和组织破坏的其他细胞相互作用，从而使炎症持续、骨质发生破坏。 表1-1 T淋巴细胞在RA发病中的主要作用 1. 滑膜内T淋巴细胞处于慢性活化状态 2. 滑模内T淋巴细胞呈低反应性 3. 记忆效应T淋巴细胞在关节内聚集 4. 外周血及滑膜内CD4+ CD25+调节T淋巴细胞对免疫反应具有中药的调节作用 5. Th17细胞在RA关节炎症和骨质破坏中气作用 6. T淋巴细胞与其他多种效应细胞之间相互作用，导致炎症加重和骨质破坏 总之，T淋巴细胞在RA的启动、炎症持续和复发阶段均起中药作用，深刻了解T淋巴细胞在RA发病机制中的作用是进一步探索新的治疗方法的基础，通过具有免疫调节作用的分子抑制T细胞受体、针对特异性辅刺激因子、靶定T细胞活化等方法在RA未来的治疗中又一定的前景。 1.1.3 B淋巴细胞[6] B细胞作为抗原递呈细胞处理抗原肽供T细胞识别，参与T细胞的活化，分泌包括TNF-α在内的促炎症细胞因子，产生类风湿因子(rheumatoid factor, RF)等自身抗体。RF的存在对于维持B细胞的活化及参与免疫复合物激活补体而使炎症反应持续存在具有重要作用。已发现高滴度的RF与关节炎病变的侵袭性、关节外器官受累的发生率以及死亡和致残相关联。 表1-2 B淋巴细胞在RA的致病作用 1. 将免疫复合物中的抗原递呈给自身反应性T细胞 2. 表达黏附分子和其他协同刺激分子促进T细胞活化 3. 合成趋化因子诱导炎细胞浸润 4. 产生促血管新生和肉芽组织形成的物质 5. 产生自身抗体直接或间接(形成免疫复合物)参与组织破坏 6. 维持对自身抗原的免疫记忆 B细胞不仅是分泌抗体的前体细胞，RA中活化的B细胞还通过分泌细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6等，提供膜辅助分子参与毗邻T细胞的活化。已有试验证据强烈支持B细胞是RA发病机制的中心环节，并证实T细胞的活化是依赖于B细胞的，B细胞的清除可导致局部T细胞应答缺损。 1.1.4 巨噬细胞[1] 巨噬细胞是类风湿关节炎(RA)发病机制中的重要参与者，在RA炎症滑膜和血管翳处存在大量活化的巨噬细胞，其与RA疾病严重程度密切相关。活化的巨噬细胞高表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHC-Ⅱ)，能分泌多种促炎因子、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶(MMPs)，参与炎症的启动和维持、白细胞的黏附和迁移、基质的降解和血管新生，具有广泛的促炎作用和组织破坏能力。选择性抑制巨噬细胞活化可能是治疗局部和全身炎症，防止不可逆性关节破坏的有效措施。 巨噬细胞招募和活化炎症细胞、通过细胞间接触和细胞因子介导邻近细胞的活化和分化、分泌基质降解酶、促进血管新生、扩大局部和全身炎症、参与组织破坏，是RA发病基质中的重要环节。针对活化巨噬细胞的靶向治疗可能会有效逆转软骨破坏、选择性诱导凋亡、抑制活化信号和特异性受体、选择性作用于巨噬细胞致炎产物将成为有希望的优化治疗手段。 1.1.5 滑膜成纤维细胞[7] 滑膜成纤维细胞(synovial fibroblast, SF)在正常的胚胎发生、关节功能成熟和维护中起着关键的作用。而在RA病变关节中，SF构成了一种独特的细胞型。许多研究证实，类风湿滑膜成纤维细胞(RASF)在形态学及生物活性上发生了转变，包括信号级联和凋亡反应分子的变化以及黏附分子和基质降解酶表达的变化等，使之在不需要外界不断刺激条件下就处于稳定活化状态，其不仅直接和间接参与骨和软骨的侵蚀，而且参与调节RA关节中的炎症的散播、血管翳结构的维持等病理过程，在RA的发生发展及病情迁延均具有重要的作用。 1.1.6 细胞因子及细胞黏附因子[8] 细胞因子及细胞黏附因子是参与RA免疫炎症反应的重要分子，其变化与病情密切相关。细胞因子是指主要由免疫细胞分泌的、能调节细胞功能的小分子多肽。它对于细胞间相互作用、细胞的生长和分化又重要的调节作用。细胞因子的分类缺乏统一体系，依据众多：有的按其发现的先后(IL-1~29),有的按其特定的功能(如TNF、G-CSF)、有的按其在炎症反应的动力学或功能(如早发或迟发、促炎或抗炎)、有的按其细胞来源(如单核细胞来源的单核因子、淋巴细胞来源的淋巴因子、脂肪细胞来源的脂肪因子)。 1.2 类风湿关节炎的治疗理念 对人类风湿关节炎的治疗经历了一个漫长的探索和发展过程。由最初对缓解病变的抗风湿药(DMARDs)的尝试，到近十几年对该药物的认识和广泛应用，已使RA的缓解率明显提高。大量研究证明，积极地规范治疗可使多数RA患者的病情完全缓解、预后改善，而关键的问题在于及时和正确的治疗。因此，在临床上，遵循RA的治疗原则、了解新的治疗理念及模式对改善患者的病情、提高缓解率具有重要意义。近些年来，人们对RA的发病基质以及治疗策略和方法已有很深入的研究，对于不同NSAIDs、DMARDs、生物制剂以及激素等已有了更全面的了解[2]。 SHAPE \* MERGEFORMAT 图1-2 类风湿关节炎的治疗理念 1.2.1 中华医学会风湿病学分会的《RA诊治指南》[9] 本指南对指导国内RA的规范化治疗发挥了重要作用。首先，指南中关于NSAIDs的用法、剂量及疗程均已国际共识及临床研究为依据。同时，该指南强调了DMARDs在RA治疗中的作用以及联合应用的意义。对于不同DMARDs的使用建议亦与国际上其他指南基本相同，包括甲氨蝶呤(MTX)、来氟米特(Lef)、羟氯喹(HCQ)及柳氮磺吡啶(SSZ)等DMARDs的用法和用量等。此外，该指南还以大量的临床研究结果为依据，介绍了糖皮质激素的应用原则、植物药的使用、手术适应症的选择、康复及心理治疗等，这些专家共识应成为国内RA治疗的指导性意见。 1.2.2 非甾体类抗炎药 非甾体类抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)是指一类不同化学结构的具有抗炎、止痛、解热等功能的非类固醇药物。其主要的作用机制是抑制炎症部位的环氧化酶活性，减少炎性因子前列腺素的合成，从而减轻或控制由于炎症反应引起的症状和体征，在临床上应用十分广泛[10]。在RA的治疗中，非甾体类抗炎药可以缓解疼痛，减轻症状，消除关节局部的炎症反应，但不能控制疾病的活动及进展，不能改变疾病的基本过程，因而将非甾体类抗炎药的治疗称为症状性治疗[11]。 非甾体类抗炎药是一组包括不同化学结构的多种类型的药物，但有相似的药物作用机制，其主要是通过影响花生四烯酸的代谢而引起作用，尤其是对环氧化酶的抑制，现在被公认的作用机制是：非甾体类抗炎药通过抑制环氧化酶，阻断花生四烯酸向炎性介质前列腺素的转化而达到抗炎的作用。此外，也包括与花生四烯酸代谢无关的作用，通过抑制脂氧酶，抑制中性粒细胞的聚集。粘连和酶的释放，抑制淋巴细胞转化及抑制细胞因子产生等多种途径发挥抗炎、镇痛和解热的作用[12]。 1.2.3 糖皮质激素 糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)治疗类风湿关节炎(RA)虽然已有50多年的历史，但由于其作用广泛而复杂，不良反应明显，在众多治疗RA的药物中，仍然是最具有争议性的药物。 GCs具有两大药理作用：一是抗炎作用。在炎症早期可减轻渗出、水肿、毛细血管扩张、白细胞浸润及吞噬反应，从而改善红、肿、热、痛等症状；在后期可抑制毛细血管和成纤维细胞的增生，延缓肉芽组织生成，防止粘连及瘢痕形成，减轻后遗症。GCs发挥抗炎作用的机制只要通过一下途径：①抑制膜磷脂类释放花生四烯酸，由此减少前列腺素和白三烯的形成；②增加毛细血管对儿茶酚胺的敏感性；③稳定肥大细胞和溶酶体膜，减少脱颗粒和溶酶体酶的释放；④干扰补体激活，减少炎症介质的产生。二是免疫抑制作用，GCs对细胞免疫和体液免疫都有抑制作用。GCs对细胞免疫影响是多个环节的，包括抗原识别、免疫活化、细胞增殖、免疫效应等过程，而对体液免疫的确切机制并不十分清除[13]。 一般认为，GCs通过经典的基因组机制发挥作用，即脂溶性的GCs可以自由地或经转运蛋白的帮助通过各种组织的细胞膜，与存在的细胞浆内非活性形式的GCs受体结合，导致GCs受体构象发生改变，与其分子伴侣蛋白(如HSP90)解离后手提上的核定位序列得以爆楼，这使得配基结合的受体能够进行核转位核二聚体化，随后与靶基因启动子附近的特异序列反应元件或负性GCs反应元件相结合，进而调节基因的转录，抑制或增强基因的表达，从而发挥其生理核药理作用。GCs通过基因组机制发挥作用时，需要一定的时间进行基因的转录和蛋白质的合成，因此发挥效应所需的时间较长(至少需要1个小时)。而且可以被转录或翻译抑制剂所阻断。但是GCs介导的某些效应可在极短的时间内发生(几秒钟至数分钟)，并且转录抑制剂或蛋白质抑制剂均不能阻断GCs的这种快速效应[14]。 1.2.4 缓解病变的抗风湿药及免疫抑制剂[15] 类风湿关节炎的治疗目的除了抗炎止痛、缓解症状和改善功能外，还能抑制关节组织的进行性损伤，延缓或阻止病情的发展，并持久地改善关节功能。风湿学界将具有能防止关节的影像学损害的一类药物称为缓解病变的抗风湿药(disease modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs)。纵观目前文献所报道的DMARDs，如金制剂(gold compounds)、D-青霉胺(D-penicillamine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)及抗疟药等；免疫抑制剂(immunosuppressive agents)，如甲氨蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢素等；生物DMARDs，如IL-1、IL-6和TNF-α拮抗药等。金制剂、D-青霉胺、柳氮磺吡啶及抗疟药等传统DMARDs，虽然种类不同，作用机制各异，对关节疼痛、肿胀无直接的治疗作用，但均对关节炎病变发展有一定延缓作用。根据这些药物起效均较慢这一特点，有人将此类药称为慢作用抗风湿药物(slow acting anti-rheumatic drugs, SAARDs)。 1.2.5 免疫及生物治疗 生物制剂(biologics)是20世纪90年代末开始在风湿病中使用的具有明确靶点的新型药物，其主要应用在类风湿关节炎等疾病的治疗领域。目前研究的药物靶点主要由细胞因子，T、B免疫细胞等[16]。 研究证明，外源或内源性抗原经HLA分子递呈给T细胞受体(TCR)，并由此激活T细胞，而T细胞分泌的细胞因子则诱导其他T细胞或促进B细胞产生抗体。由于这些细胞因子、抗体以及与之相关的免疫复合物和补体等的共同作用，导致关节炎滑膜及关节破坏。通过阻止这些免疫或炎症分子的表达及其功能，则可能抑制关节炎的发生和发展，从而达到治疗的目的[17]。 1.2.6 其他新型治疗及进展[18] 近20多年来，类风湿关节炎(RA)的治疗方法不断增多，治疗策略已逐步发展到针对性强、不良反应更少的靶向治疗。细胞因子和致病性T、B细胞等分子级细胞水平靶点称为RA治疗领域研究的热点，其中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1、IL-6等炎性因子的抗体或可溶性受体抑制剂、B细胞表面标志CD20单抗等生物制剂已用汉语临床治疗。 1.2.7 中药对类风湿关节炎的治疗作用[19] 植物药在国内类风湿关节炎治疗中的应用比较广泛，无论内服或外治均收到很好的疗效，特别在缓解患者疼痛、提高其生存质量方面有其独特的作用。但是由于尚缺乏大样本的随机对照研究，有些植物药是否有DMARDs样作用难以科学地评价。因此，用疗效佳、副反应低的中药单成分以及中成药治疗该病具有重要意义。现用于临床的青藤碱、白芍总苷、雷公藤多苷都是从中药中提取的。此外，昆明山海棠片及雷公藤片等中成药治疗RA具有肯定的疗效。 1.3 维吾尔药材刺山柑对类风湿关节炎的治疗作用 刺山柑(Capparis Spinosa L.CS)为白花菜科山柑属植物，常绿藤本蔓生小半灌木，我国新疆、甘肃、西藏境内广有分布。在当地是一种常用的民族药物和优良的固沙植物。据《新疆药用植物志》记载，刺山柑叶、果和根皮均能入药，主要功能有祛风除湿、止痛、消肿，外敷患处治风湿性关节炎和疮毒[20]。 1.3.1 分布及植物特性 刺山柑为藤本状小灌木，根粗壮，枝条平卧，呈辐射状，长2～3m，无毛或具绒毛；极耐干旱，生于荒漠地带的戈壁、沙地，石质低山和山麓地带，荒地也有生长；主要产于新疆(哈密、吐鲁番、克拉玛依、伊宁、托克逊、库尔勒和喀什)，甘肃西部、西藏也有分布[21]。经研究发现刺山柑具有发达的根系和木质部，能够高效利用地下的水资源，同时其叶片气孔整天开放，能够很快的散热。正是由于这些特殊结构使得它能够适应高温、干旱的恶劣环境。它在我国一些多风和植物覆盖不发达的地区，人们则更看中其在降低风速、防止土地风蚀及保护生态环境方面的重要作用[22]。 1.3.2 化学成分[23] 刺山柑的化学研究表明其中含有挥发油类、生物碱类、脂类、聚戊烯醇类、黄酮类及吲哚类和脂肪族类芥子油苷。其茎、叶、花中含有大量的粗蛋白、粗纤维、脂类、淀粉、糖类以及类胡萝卜素、维生素C等营养成分，同时还含有Na、K、P、Ca、Mn、Mg、Cu、Zn等矿物质元素。 1.3.3 药理研究 1.3.3.1 抗炎及抗过敏 CS的水提物能明显减轻角叉菜胶诱发的小鼠足趾肿胀反应。其乙醇提取物经HPLC分离的一种所得物对角叉菜胶诱发的大鼠足趾肿胀抑制率达44%(用羟基保泰松做阳性对照为67% )[24]。CS的甲醇提取物对组胺诱导的豚鼠支气管痉挛有明显缓解作用，对组胺诱导的皮肤红斑具有明显抑制功效。其作用机理可能与抑制肥大细胞和花生四烯酸代谢物的释放以及直接对抗组胺等过敏和致炎介质有关[25]。 1.3.3.2 抗氧化[26] 用刺山柑花蕾的甲醇冷冻干燥提取物进行坏血酸盐和Fe2+介导的大鼠肝微粒体脂质过氧化的体外抗氧化实验发现：CS的抗氧化活性很强，并且其作用与培养液中的硫代葡萄糖酸盐无关。实验说明CS具有明显的抗氧化或清除自由基作用。其主要化学成分为类黄酮类，如山奈酚、栎精衍生物和羟基苯乙烯酸类，如咖啡酸、阿魏酸、对一香豆素酸和苯乙烯酸。 1.3.3.3 保护软骨细胞 骨关节炎是以关节软骨组织进行性破坏为特征的氧化-炎症反应，期间软骨组织和细胞的代谢调节起着重要作用。采用在软骨细胞培养液中加入致炎剂L-1β，观察软骨细胞受损的病理过程和CS的保护作用的实验方法较为直观[27]。CS的抗氧化效应也与抗炎作用有关，如在骨关节炎时，CS中的某些化学物质控制某些变态反应细胞如肥大细胞、嗜碱粒细胞的脱颗粒作用，抑制炎症细胞因子的分泌。与此同时， LECS还可以直接抑制MMPS和软骨细胞中前-MMP和PGE2的产生，起到减轻炎症防止蛋白分解和保护骨关节炎中的骨关节作用。提示CS中的蛋白质可能参与了调节与抗炎作用有关的糖皮质激素受体的基因表达[28]。 1.3.3.4 局部抗风湿作用 维吾尔医用刺山柑，主要是外敷治疗痛风、风湿性关节炎取得较好临床疗效。认为该植物在刺激皮肤形成水泡的同时，清除多余黏液质(拜勒艾木)，行气，散气而发挥治疗作用[29]。芥子油—异硫氰酸盐不仅是起疱剂还是皮肤刺激剂，它可以加速皮肤的血液循环，而发挥局部抗风湿作用。天然产异硫氰酸盐有饱和与不饱和之分。β、γ不饱和异硫氰酸盐中的氮，如烯丙基和苯基异硫氰酸盐是一个免疫化学物质，其中苯基异硫氰酸盐有强的变态反应性，而α、β不饱和异硫氰酸盐就不引起变态反应。所以用CS根的浸出物可能发挥局部抗风湿作用较好，因为根中主要含甲基异硫代氰酸酯和异丙基异硫代氰酸酯，不至于引起过强的皮肤变态反应[30]。 1.4 本论文研究的目的和内容 1.4.1 研究目的 通过醇提超声法提取维吾尔药材刺山柑中总黄酮成分，再利用大孔吸附树脂对其进行纯化，鉴别分离后得到的黄酮，测定其含量。建立小鼠疼痛炎症以及免疫学模型，考察刺山柑中总黄酮的抗炎镇痛、增强免疫能力的效果。最后建立大鼠佐剂性关节炎模型，通过测定组织局部炎症和血液中各个生理生化指标，探讨刺山柑中总黄酮对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用，为人类风湿性关节炎奠定研究基础。 1.4.2 研究内容 1.4.2.1 维药材刺山柑中总黄酮的分离纯化 以新疆吐鲁番野生刺山柑果实为原料，分别利用不同乙醇浓度、料液比、超声时间对刺山柑总黄酮的提取率的影响，以正交试验进行筛选分析，选择最佳的提取条件作为刺山柑总黄酮粗体物的提取方法。利用静态及动态吸附-洗脱试验筛选出提取效果较好的大孔树脂对刺山柑总黄酮供试药进行分离。 1.4.2.2 维药材刺山柑对小鼠抗炎镇痛及免疫学方面的影响 建立小鼠醋酸致扭体反应、电热板致痛两种疼痛模型，以及二甲苯致小鼠耳廓肿胀、蛋清导致小鼠足趾肿胀两种炎症模型，考察刺山柑中总黄酮能够减少疼痛、抑制炎症反应的效果。通过皮下注射环磷酰胺建立小鼠免疫低下模型，与阳性药左旋咪唑对比，探讨刺山柑对正常小鼠和免疫低下小鼠两种模型的免疫增强作用。 1.4.2.3 大鼠佐剂性关节炎模型的建立 建立Wistar大鼠的Freund’s完全佐剂致关节炎模型，正常组作对照，刺山柑黄酮组按计量ig给药，正常组与模型组ig生理盐水，末次给药1h后刺山柑黄酮组与模型组共同将每只大鼠右后足趾sc注射Freund’s完全佐剂0.1ml致炎，正常组每只大鼠右后足趾sc注射生理盐水。 1.4.2.4 刺山柑总黄酮治疗大鼠佐剂性关节炎 在致炎后一周内检测刺山柑总黄酮对原发病的抗炎作用；第21天后对大鼠心脏采血和分离足趾滑膜组织，进行继发病的检测，其中包括滑膜组织病理切片、炎症组织中PGE2含量、血清中细胞因子含量以及血液常规、血液沉降率和类风湿因子的检测等生理生化变化。 第2章 正交设计优化大孔吸附树脂分离纯化维药材刺山柑中总黄酮的研究 2.1 实验材料 2.1.1主要材料 维药材刺山柑为新疆吐鲁番野生果实；大孔吸附树脂D101、D1300、X-5、AB-8、H103、D204和CAD-40均购自安徽三星科技有限公司；芦丁、槲皮素标准品购自中国药品生物制品检定所；试剂均为国产分析纯。 2.1.2 仪器 φ30×400mm玻璃层析柱；UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司)；AL204-IC电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；YHG-500BS远红外快速恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；RE-52B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；TH2-82A气浴恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；KQ5200-超声波提取仪(昆山市超声仪器有限公司)。 2.2 实验方法 2.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品3.42mg，置于10ml容量瓶中，以60%乙醇溶解稀释至刻度，摇匀。再精密吸取2ml于10ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得(每ml含芦丁0.0684mg)。精密吸取对照品0.25、0.5、1.0、1.5与2ml分别置于10ml试管中，各加入0.1ml/L三氯化铝溶液1ml，1mol/L的醋酸钾(或1mol/L的氢氧化钠溶液)1ml，再加60%乙醇至5ml，摇匀，放置30min。以试剂作空白，在波长420nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标[31]，得回归方程y=0.2121x-0.0187，R2=0.9994，结果表明回归方程线性良好。 图2-1 芦丁标准曲线 2.2.2 刺山柑中黄酮提取的正交试验 准确称取10.00g刺山柑粉末9份，然后用体积分数分别为60%、70%、80%的乙醇；料液比各为1:20、1:30、1:40；室温下超声提取，超声时间各为40min、60min、80min，抽滤后在旋转蒸发仪上浓缩，干燥，计算黄酮的含量。根据单因素实验的结果以及文献报道，以刺山柑中黄酮含量为评价指标，考察乙醇浓度、超声时间和料液比对指标的影响，采用L9(34)正交试验设计表进行试验[32]。正交试验设计因素水平见表2-1、2-2，方差分析结果见表2-3。 表2-1 因素水平表 水平 A 乙醇浓度(%) B 超声时间(min) C 料液比(g/ml) 1 60 40 1:20 2 70 60 1:30 3 80 80 1:40 表2-2 初筛条件的正交试验结果 试验 水平 总黄酮含量(%) A B C 1 A1 B1 C2 0.95 2 A1 B2 C1 1.70 3 A1 B3 C3 1.13 4 A2 B1 C1 1.24 5 A2 B2 C3 2.21 6 A2 B3 C2 1.12 7 A3 B1 C3 1.89 8 A3 B2 C2 1.46 9 A3 B3 C1 0.87 k1 1.261 1.359 1.270 k2 1.521 1.789 1.176 k3 1.408 1.041 1.743 R 0.260 0.748 0.567 表2-3 正交实验结果方差分析 方差来源 自由度 平方和 均方 F值 显著性 A 2 0.102 0.051 0.703 0.487 B 2 0.846 0.423 5.823 0.047 C 2 0.553 0.277 3.809 0.108 误差 2 0.145 0.073 方差分析可以看出，超声时间(B)的显著值为0.047(P<0.05)，具有极显著统计学意义；乙醇浓度(A)和料液比(C)的显著值分别为0.487和0.108(P>0.05)，说明超声时间(B)对刺山柑中黄酮的提取有显著影响，而乙醇的浓度和料液比对其的提取率无显著影响。 综合直观分析和方差分析结果可知，因素水平中，乙醇浓度A1、A2、A3优选出A2；超声时间B1、B2、B3优选出B2；料液比C1、C2、C3优选出C3，即最佳组合为A2 B2 C3，刺山柑中总黄酮提取的最佳条件为体积比70%乙醇，超声60min，料液比为1：40。 2.2.3 大孔吸附树脂的预处理和筛选 2.2.3.1 大孔吸附树脂的筛选 为了有效分离纯化刺山柑中黄酮，选择了7种大孔树脂进行筛选实验，树脂的各项物理指标如表2-4所示。以筛选树脂的刺山柑总黄酮的静态吸附量、静态吸附率和解吸率为指标，筛选出提取效果最好的树脂[33]。 表2-4 各种大孔树脂的化学及物理性质 树脂 外观 树脂类型 粒径范围(mm) 比表面积 (㎡/g) 平均孔径(A) 孔容 (ml/g) D101 白色颗粒 非极性 0.25-0.84 500-550 90-100 D1300 淡黄色颗粒 非极性 0.315-1.25 550以上 1.35-1.65 X-5 白色颗粒 非极性 0.315-1.25 500-600 1.20-1.24 AB-8 白色颗粒 弱极性 0.315-1.25 480-520 130-140 0.73-0.77 H103 棕褐色颗粒 非极性 0.315-1.25 D204 淡黄色透明 碱性阴离子 0.315-1.25 CAD-40 白色颗粒 非极性 0.315-1.25 450-500 50-60 2.2.3.2 大孔吸附树脂的预处理 树脂用10-15%乙醇浸泡24h，使之充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇匀速通过树脂层，洗至流出液加等量水不变白色浑浊为止；以同样流速洗尽乙醇，用5%盐酸溶液流洗树脂并浸泡2-4h，用水洗至中性；以2%氢氧化钠流洗树脂并浸泡2-4h，水洗至中性，备用。 2.2.4 大孔吸附树脂的静态吸附与洗脱实验 大孔吸附树脂的静态吸附与洗脱附验的目的是初步筛选树脂，通过静止状态下，大孔吸附树脂对刺山柑中黄酮的吸附作用，并用洗脱剂洗脱黄酮的脱附能力，初步对大孔树脂进行筛选，以选择吸附洗脱效果较好的树脂分离纯化黄酮。 2.2.4.1 静态吸附试验 准确量取经处理的7种树脂各2.00ml于具塞三角瓶中，精密加入黄酮浓度为414.6mg/l(黄酮含量为4.3%，浓度为9641.86mg/l)的上柱液50ml，室温下振荡24h，至吸附平衡，按下列公式计算吸附量和吸附率，考察树脂对提取液中黄酮的吸附效果[34]。 吸附量Q(mg/ml)=(C0-Ce)VA/V 吸附率A(%)=(C0-Ce)/C0×100% 注：式中C0起始浓度；Ce平衡浓度；VA吸附液体积；V湿树脂体积 2.2.4.2 洗脱实验 将已处理好的湿树脂2.00ml，经静态饱和吸附黄酮后滤出，吸干表面水分，加入20ml 70%乙醇，室温下振荡洗脱24h，测定洗脱液中黄酮的浓度，按下列公式计算洗脱量和洗脱率。 洗脱量QD(mg/ml)=(CDVD)/V 洗脱率D(%)=(CDVD)/(QV)×100% 注：式中CD洗脱浓度；VD洗脱液体积，V湿树脂体积 2.2.5 刺山柑中总黄酮的鉴别实验 2.2.5.1 颜色反应[35] 样品液的显色反应：取2ml样品液置于试管中，在波长254nm紫外灯下观察，记录颜色。再用玻璃棒蘸取少量样品液于滤纸上，进一步确定颜色并记录。氨水反应、氢氧化钠反应和三氯化铝反应的步骤同上。 2.2.5.2 紫外光谱扫描[36] 精确量取刺山柑黄酮提取液0.5ml，用甲醇定容至50ml，为测试液。取2-3ml测试液以及2mg/ml芦丁和0.5mg/ml槲皮素对照品液，分别在200-500nm范围扫描，保存图谱。 加显色剂的供试液光谱图：取2-3ml测试液，加6滴三氯化铝溶液，混匀后立即在波长200-500nm范围内进行扫描，保存图谱。 2.3 结果与分析 2.3.1 静态吸附与洗脱 相同静态吸附实验条件下，测得各个大孔吸附树脂对刺山柑提取液中总黄酮的静态吸附结果见表2-5。 表2-5 各种吸附剂对黄酮的吸附率和脱附率 树脂型号 起始浓度 C0(mg/l) 平衡浓度 Ce(mg/l) 饱和吸附量 (mg/ml) 洗脱率 (%) 洗脱浓度 CD(mg/l) 洗脱量QD(mg/ml) 洗脱率 (%) D101 414.6 152.3 6.56 63.27 117.6 1.18 17.93 D1300 414.6 136.7 6.95 67.03 84.6 0.85 12.17 X-5 414.6 107.0 7.69 74.19 381.0 3.81 59.54 AB-8 414.6 126.8 7.20 69.42 366.4 3.66 50.89 H103 414.6 71.1 8.59 82.85 411.5 4.12 67.90 D204 414.6 111.8 7.57 73.03 39.5 0.40 5.22 CAD-40 414.6 141.5 6.83 65.87 214.9 2.15 31.46 结果表明，无论静态吸附或脱附实验，H103均明显优于其他各吸附树脂，其次X-5和AB-8的吸附与脱附性能也较好。从表中因素考虑，动态吸附-洗脱实验选择H103、X-5和AB-8作为实验吸附树脂。 2.3.2 大孔吸附树脂的动态吸附和脱附实验 2.3.2.1样品液的制备 根据正交试验优选提取工艺制备样品溶液。 2.3.2.2动态吸附-洗脱实验 室温下，将约5ml刺山柑提取液以一定的流速通过装有200ml左右树脂的φ30×400mm的玻璃层析柱，首先水洗去除多糖，直至流出液无molish反应后，用15%乙醇洗脱黄酮，收集有盐酸-镁粉反应的所有溶液，测定总黄酮的浓度，做动态吸附-脱附曲线。 2.3.2.3 动态吸附-洗脱曲线 通过观察动态吸附-洗脱曲线，见图2-2，在80min之前，实验进行水洗取出多糖的过程，无黄酮成分。除净黄酮后，用洗脱剂洗脱黄酮，刺山柑中总黄酮在100min左右分离得率较高，含量较多。对于三种树脂比较看来，H103型大孔吸附树脂的吸附洗脱效果最佳，黄酮回收率最高，其总黄酮含量为63.98%。 图2-2 大孔吸附树脂树脂动态吸附-洗脱曲线 2.3.3刺山柑中总黄酮的鉴别实验 2.3.3.1 显色反应结果 表2-6 刺山柑黄酮类化合物的颜色反应 试剂 颜色 结论 黄酮样品 黄绿色荧光 有黄酮类化合物 黄酮样品+氨水 淡黄绿色 有黄酮类化合物 黄酮样品+氢氧化钠 深黄绿色 有黄酮类化合物 黄酮样品+三氯化铝 黄色荧光 有黄酮、异黄酮化合物 2.3.3.2刺山柑黄酮提取物的紫外光谱特征 以甲醇和乙醇为溶剂，紫外光谱在240-400nm间一般有两个吸收带，处于290-380nm区的为带Ⅰ；处于240-280nm区的为带Ⅱ。黄酮分子可看作为有两个生色团A环苯甲酰和B环肉桂酰组成。分子中取代基的性质、位置和数目决定吸收带的波长、强度和波谱形状[31]。 图2-3 芦丁和刺山柑黄酮的紫外吸收光谱 由图2-3可见，刺山柑中提取的总黄酮甲醇溶液基本符合黄酮紫外光谱特征，标准品黄酮溶液在261nm和365nm处各有一个吸收峰，而刺山柑黄酮溶液在波长为292nm处有一最大吸收峰为带Ⅱ，较黄酮标准品吸收峰带Ⅱ有一定的迁移，说明刺山柑中黄酮含有不同的取代基团较多，在波长为343nm处有一最大吸收峰为带Ⅰ，与芦丁标准品比较基本符合黄酮在甲醇溶液中的吸收峰特征。 图2-4 刺山柑黄酮在三氯化铝溶液中的紫外吸收光谱 由图2-4可见，刺山柑总黄酮提取物甲醇溶液加入三氯化铝之后，带Ⅰ、带Ⅱ的吸收峰分别在波长284nm、360nm处。三氯化铝试剂在甲醇中与黄酮分子中羟基的反应有两种方式：一是与3-羟基或5-羟基以及4-羰基鳌合，而且鳌合形式较稳定，不易发生酸水解；另一种是与相邻双羟基反应形成不稳定的铝化物[37]。所以加入显色剂的黄酮紫外光谱图相对较好，符合黄酮光谱特征。 2.4 讨论 2.4.1 刺山柑总黄酮的提取分离 刺山柑果实中含有大量的化学成分，其中黄酮、鞣质等黄酮类化合物因分子具有酚羟基，故显酸性。一般黄酮苷元难溶于水，易于溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂中，因此可以选择乙醇作为溶剂提取黄酮。本实验采用超声提取方法，它根据超声的空化作用对细胞膜的破坏帮助黄酮类化合物的释放溶出，超声波使提取液不断振荡，有助于溶质的扩散，同时超声的热效应使水温基本保持在57℃，对原料有水浴的作用。因此超声提取不仅缩短了提取时间，又提高了有效成分的提取率[38]。 2.4.2 大孔树脂分离纯化刺山柑总黄酮 大孔树脂是20世纪60年代发展起来的一类新型高分子材料，具有良好的吸附性能，进入90年代后，大孔吸附树脂的应用日趋广泛，尤其再分离纯化中草药活性成分方面显示出极大的优越性[34]。本研究在大孔树脂分离黄酮的过程中，可见H103、X-5、AB-8 三种树脂的吸附-洗脱效果明显高于其他树脂，这与树脂的性质密切相关。黄酮类物质具有2个苯环通过3个碳原子相互连接而成的系列化合物，其体积较大。对于树脂AB-8，平均孔径高，具有较大的表面积，但其为弱极性，与溶质分子的极性不相似，限制了黄酮分子的吸附。树脂X-5为非极性，表面积高于AB-8，吸附效果相对较好。H103与这两种树脂相比较，外观有较大的差别，其为褐色不透明颗粒，粒径相对均匀，预处理沉降效果好；实验中，吸附脱附效果高于其他树脂吸附率和脱附率，但是价格超出其他大孔树脂若干倍，平衡诸多因素而选择X-5作为刺山柑总黄酮的纯化树脂。 2.4.3 黄酮的生物学特性 黄酮(flavonoid)及其苷类化合物又称维生素P、花青素，是人体必需的营养元素之一，是一种植物天然代谢产物。黄酮类化合物在植物界分布广泛，20%以上的植物药中含有黄酮类化合物成分[39]。 黄酮类化合物多为黄色结晶固体，具有旋光性；因黄酮化合物分子中含有酚羟基，故显酸性；一般难溶于水，可溶于碱性水溶液和有机溶剂中；颜色反应强烈。黄酮类化合物最显著的特征之一是具有清除自由基的作用，常用来治疗和预防感染、炎症、烧伤和辐射引起的伤害[39]。黄酮类化合物还参与生物体内的氧化-还原过程，是电子转移的有效催化剂。其具有抑制酶活性、诱变潜能和激素行为，对高血压、水肿、结缔组织炎症、过敏反应、癌症、心血管疾病、胃肠溃疡、老年痴呆、外伤恢复、免疫系统的调节、预防和治疗后天免疫缺陷综合症等方面均有作用[40]。 综上所述，基于黄酮类化合物的诸多生物学特性，刺山柑中总黄酮对类风湿关节炎疾病的研究有重大意义，为类风湿关节炎的研究提供理论依据，加速维药资源的开发利用，以及生产出更多预防和治疗类风湿关节炎的天然药品。 第3章 维药材刺山柑中总黄酮对小鼠抗炎镇痛及免疫调节的影响 3.1 实验材料 3.1.1 材料和试剂 维药材刺山柑为新疆吐鲁番野生果实；清洁级KM小鼠购自自治区疾病控制中心动物房；树脂X-5(安徽三星科技有限公司)；芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)；阿司匹林为药厂原料药；盐酸左旋咪唑(山东仁和堂药业有限公司)；注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。 3.1.2 主要仪器 Φ90×1200mm玻璃层析柱；UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司)； 透视电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)(日本岛津)；BI-2000医学图像分析系统、BR-200智能热板仪、PV-200足趾容积测量仪(成都泰盟科技有限公司)；ST-360BT酶标仪(北京桑翌科技发展有限公司);Hfsafe-1200生物工作台(上海力申科学仪器有限公司)。 3.2 实验方法 3.2.1 刺山柑中总黄酮液的制备 3.2.2.1 样品的制备和树脂的预处理 准确称量200.00g刺山柑粉末，用70%的乙醇3000ml，在室温下(25℃)，超声提取40min，抽滤后在旋转蒸发仪上浓缩，置于水浴干燥至浸膏状，即得树脂用的刺山柑提取物。 树脂先用10%-15%乙醇浸泡24h，使之充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇匀速通过树脂层，洗至流出液加等量水不变白色浑浊为止。用以同样流速的蒸馏水洗尽乙醇，然后用5%盐酸溶液润洗树脂并浸泡2h-4h后用水洗至中性。再用2%氢氧化钠流洗树脂并浸泡2-4h，最后用水洗至中性，即处理完毕。 总黄酮含量的测定方法：精确称量供试品5mg定容于10ml容量瓶中，测定吸光值，然后通过回归方程计算出总黄酮的含量。 3.2.2.2 大孔吸附树脂分离刺山柑中总黄酮 室温下，将上述刺山柑提取物(每次分离大约5ml左右)以一定的流速通过装有200ml左右X-5型大孔吸附树脂的φ90×1200mm的玻璃层析柱，首先水洗去除多糖，直至流出液无molish反应后，再用15%、30%、60%乙醇依次洗脱总黄酮，收集有盐酸-镁粉反应的全部溶液，测定流出液中总黄酮的浓度，计算总黄酮含量。 3.2.2 刺山柑中总黄酮抗炎镇痛的药效学研究 3.2.2.1 刺山柑总黄酮对醋酸所致小鼠扭体反应的影响[41] 取体重为20±2g的小鼠50只，随机分成5组，雌雄各半。生理盐水组、1%阿司匹林组和刺山柑总黄酮液组分别按剂量灌胃给药一周，末次给药1h后，每只小鼠腹腔注射0.8%冰醋酸0.1ml/10g，记录注射10min内各小鼠的扭体次数，计算镇痛百分率[4]： 镇痛百分率% = ×100% 注：应用SPSS 11.0统计学软件处理，采用单因素方差分析，结果以(x±s表示，以下皆同。 3.2.2.2 刺山柑总黄酮对电热板致痛的影响[41] 取体重为20±2g的小鼠50只，随机分成5组，均为雌性。生理盐水组、1%阿司匹林组和刺山柑总黄酮组分别按剂量灌胃给药一周，末次给药1h后，将小鼠置于55±0.5℃的智能热板仪上，记录小鼠足底接触热板至出现舔后足的时间(s，热板反应潜伏期)作为痛阈指标，并计算痛阈提高百分率。 痛阈提高百分率% = ×100% 3.2.2.3 刺山柑总黄酮对二甲苯所致鼠耳肿胀的影响[41] 取体重为20±2g的小鼠50只，随机分成5组，雌雄各半。生理盐水组、1%阿司匹林组和刺山柑总黄酮组分别按剂量ig给药一周，末次给药1h后，于小鼠右耳两面均匀涂抹二甲苯致炎，不涂左耳为正常耳。30min后将小鼠颈椎脱臼处死，剪下双耳用10mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，分析天平称重，小鼠右耳片重量减去左耳片重即为肿胀度，并计算肿胀抑制率： 肿胀抑制率% = ×100% 3.2.2.4 刺山柑总黄酮对蛋清致小鼠足趾肿胀的影响[41] 取体重为20±2g的小鼠50只，随机分成5组，雌雄各半。生理盐水组、1%阿司匹林组和刺山柑总黄酮组分别按剂量ig给药一周，第七天时在小鼠右后肢关节处用记号笔划线标记，然后在足趾肿胀仪中，将每只小鼠右后肢放入水中刚好没到划线标记，记录给药前足趾体积(ml)。末次给药1h后，于每只小鼠右后肢足趾处皮下注射20%蛋清 (0.0.5ml/只)，以造成急性足趾肿胀模型。分别在足趾肿胀仪测定注射蛋清后1h、2h、3h小鼠的足趾体积，并计算肿胀抑制率： 肿胀度 = 致炎后足趾体积-致炎前足趾体积 肿胀抑制率% = ×100% 3.2.3刺山柑总黄酮对小鼠免疫调节的研究 3.2.3.1 刺山柑中总黄酮对正常小鼠的免疫增强作用 取体重为20±2g的小鼠40只，随机分成4组，雌雄各半。生理盐水组、0.02%左旋咪唑组和刺山柑总黄酮高、低剂量组分别按剂量ig给药一周后，进行脏器系数计算、巨噬细胞吞噬鸡红细胞和淋巴细胞增殖反应实验。 (1)刺山柑中总黄酮对脏器系数的影响 末次给药后断颈处死，解剖摘取主要脏器，称重，计算脏器系数。 脏器系数= ×100% (2)巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验[42] 实验前3-4天时将每只小鼠腹腔注射0.5%淀粉生理盐水溶液，每只小鼠0.5ml用以诱导Mφ。四天后，腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水悬液0.5ml，间隔8-12h，脱臼处死小鼠，腹腔注射Hanks液2ml，轻揉腹部1min后吸出腹腔洗液1ml，分别滴于两片载玻片上，放入垫有纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。以生理盐水漂洗，晾干。1：1(V：V)丙酮-甲醇溶液固定5min，Giemsa染色5-10min。油镜下计数Mφ，每片200个Mφ中含有吞噬鸡红细胞的Mφ数量。 吞噬百分率= ×100% 吞噬指数= ×100% (3)淋巴细胞增殖反应的四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)[42] 原理：Mosmann等(1983)根据细胞内能量代谢水平与DNA合成水平相平行首创了四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法。MTT进入细胞后作为反应底物被氧化形成蓝色的甲臜(formazan)积存于细胞内或周围，用酶标仪直接测定各孔的A值，即可反应甲臜的量，由此判断细胞内线粒体氧化酶活性，亦可间接反应细胞的增殖水平。 常规制备小鼠脾细胞悬液，将小鼠脱臼处死置于5%新洁尔灭中消毒，在无菌操作台上解剖取脾脏，放入盛有冷的5-10ml/PBS平皿中的尼龙网(100目)上，剔除脂肪组织和结缔组织。将脾组织剪成两段，用结核菌注射器的针芯轻轻捻碎脾组织，使单个细胞经网进入溶液中，再经尼龙网过滤至离心管中，离心500r/min，5min后弃上清。经低渗处理除去红细胞，用冷PBS或内含0.5%明胶的Hanks液洗涤细胞2-4次，最后加入10%NBS-RPMI-1640培养液1-2ml悬浮脾细胞，作细胞计数。 MTT实验：将制备好的小鼠脾细胞悬液(1×107/ml)加入96孔细胞培养板，每孔100µl(1×106/孔细胞)，再加入含不同浓度致分裂原的RPMI-1640培养液100µl，置5%CO2，37℃培养48h，轻轻吸弃上清100µl。加入MTT溶液(MTT浓度为5mg/ml)10µl(50µg/孔)，于振荡器上振荡1min。放入5%CO2，37℃培养箱反应2h。取出反应物，离心2000r/min，5min后弃上清，每孔加入酸化异丙醇120µl，于振荡器上振荡30s，酶标仪570nm读出A值。 3.2.3.2刺山柑中总黄酮对免疫低下小鼠的免疫调节作用 取体重为20±2g的小鼠40只，随机分成4组，雌雄各半。生理盐水组、0.005g/ml环磷酰胺组和刺山柑总黄酮高、低剂量组。对30只小鼠每日进行皮下多点注射0.005g/ml环磷酰胺一周，制造成免疫低下模型，其中刺山柑组的20只小鼠进行灌胃总黄酮溶液1w后，进行脏器系数计算、巨噬细胞吞噬鸡红细胞和淋巴细胞增殖反应实验。(实验同3.2.3.1) 3.3 结果与分析 3.3.1 供试药总黄酮的含量 200.00g刺山柑经过超声提取、大孔树脂分离得到咖啡色晶体状粗制总黄酮4.83g，通过芦丁标准品回归方程计算测得总黄酮含量为63.98%，将分离得到总黄酮定容于200ml容量瓶中，配制成1g生药/ml供试药，其总黄酮含量为15.45mg/ml。 3.3.2 刺山柑中总黄酮抗炎镇痛作用实验结果和分析 3.3.2.1刺山柑总黄酮液对醋酸致小鼠扭体反应的影响 实验结果见表3-1，从实验数据可以看出，刺山柑总黄酮液各剂量组均能有效抑制醋酸刺激腹腔粘膜引起的疼痛反应，明显减少扭体次数。当最大剂量达到0.3ml/10g时，10min内的扭体次数仅在23次左右，镇痛百分率达到68.49%，高于阿司匹林阳性对照组，对于生理盐水组和阿司匹林阳性对照组均有极显著差异性，有良好的镇痛效果。 表3-1 刺山柑总黄酮对醋酸致小鼠扭体反应的影响((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) 扭体反应次数(平均值) 镇痛百分率(%) 生理盐水组 0.1 73±6 0 1%阿司匹林组 0.1 35±4** 52.05 刺山柑黄酮组 0.1 56±5** 23.29 0.2 44±4**▲ 39.73 0.3 23±2**▲▲ 68.49 注：与对照组比较，* P<0.05，** P<0.01，与阳性药比较，▲ P<0.05，▲▲ P<0.01，下表皆同。 3.3.2.2 刺山柑醇提液对小鼠电热板痛阈的影响 实验结果见表3-2，结果显示，刺山柑总黄酮液中剂量和高剂量能够明显提高小鼠热刺激体表的痛阈，并能延长小鼠抵抗疼痛的时间。刺山柑总黄酮液组给药15min后中剂量和高剂量均明显提高小鼠的痛阈值，由给药前的14.77s提高到25.22s，但是中剂量没有高剂量的作用时间长，30min以后，高剂量的作用持续到1h，痛阈值为30.38s，痛阈提高百分率达105.69%，给药后15min和1h，对于生理盐水组和阿司匹林组均具有极显著差异性。 表3-2 刺山柑总黄酮对小鼠电热板痛阈的影响((x±S,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) 给药前 痛阈(s) 给药后不同时间痛阈(s) /痛阈提高百分率(%) 15min 30min 1h 生理盐水组 0.1 14.86 14.81 14.64 13.49 1%阿司匹林组 0.1 14.46 23.34*/61.41 27.92**/93.08 21.55**/49.03 刺山柑黄酮组 0.1 14.61 22.43/53.52 26.80*/83.44 24.76/69.47 0.2 14.85 24.58**▲/65.52 26.94**/81.41 26.44**▲/78.05 0.3 14.77 25.22**▲/70.75 27.99**▲/89.51 30.38**▲▲/105.69 3.3.2.3 刺山柑醇提液对二甲苯致耳廓肿胀度的影响 实验结果见表3-3，刺山柑总黄酮各个剂量组均能够明显降低二甲苯所致的小鼠耳片肿胀，肿胀抑制率最高可达到34.55%，优于阿司匹林阳性对照药。而且刺山柑总黄酮液的抑制效果随着给药剂量的增加，呈现一定的量效关系。 表3-3 刺山柑总黄酮对二甲苯致耳廓肿胀度的影响((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) 肿胀度(g) 肿胀抑制率(%) 生理盐水组 0.1 0.023875±0.015 0 1%阿司匹林组 0.1 0.018125±0.037* 24.08 刺山柑黄酮组 0.1 0.022625±0.013** 5.24 0.2 0.019625±0.064**▲ 17.80 0.3 0.015625±0.008**▲▲ 34.55 3.3.2.4刺山柑醇提液对蛋清致小鼠足趾肿胀的影响 实验结果见3-4，采用SPSS统计软件进行分析，结果显示阿司匹林阳性对照药各个时间均无显著性差异，刺山柑总黄酮液各个剂量对于蛋清导致的小鼠足趾肿胀均有抑制效果，且远远大于阳性对照组。但是各个剂量的抑制时间不同，服用低剂量和中剂量，在给药后2h抑制效果最明显。高剂量给药时，用药1h的效果相对最明显，但是抑制程度没有中剂量的效果好。综上所述，阿司匹林持续时间短，最高抑制率仅为17.52%，刺山柑总黄酮液的剂量为0.2ml/10g时，抑制效果最明显，效果持续时间最长，抑制程度也最强，最高的抑制率可达到26.28%。 表3-4 刺山柑总黄酮对蛋清致小鼠足趾肿胀的影响((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) 蛋清致炎后不同时间足趾肿胀度(ml) 抑制率(%) 给药前 1h 2h 3h 生理盐水组 0.1 0.1925±0.03 0.2688±0.03 0.3000±0.04 0.3425±0.04 1%阿司匹林组 0.1 0.2079±0.16 0.2550±0.04 5.13 0.2725±0.11 9.17 0.2825±0.04 17.52 刺山柑黄酮组 0.1 0.2075±0.09 0.2450±0.19 8.85 0.2525±0.04**▲ 15.83 0.2688±0.02 21.52 0.2 0.2025±0.04 0.2263±0.03*▲ 15.81 0.2413±0.05**▲▲ 19.57 0.2525±0.09 26.28 0.3 0.1963±0.09 0.2313±0.03**▲▲ 13.95 0.2575±0.04*▲▲ 14.17 0.2675±0.06*▲▲ 21.90 3.3.3 刺山柑中总黄酮对小鼠免疫调节作用的结果和分析 3.3.3.1 刺山柑中总黄酮对正常小鼠的免疫增强作用 (1)刺山柑中总黄酮对脏器系数的影响 小鼠主要器官脏器系数见表3-5，左旋咪唑和刺山柑黄酮液均对小鼠的心脏系数、肝脏系数和肾脏系数没有任何影响，各组间无差异显著性(P>0.05)。但是对于小鼠脾脏系数和胸腺系数表现出显著性差异，通过与生理盐水组的比较，刺山柑低剂量组的脾脏、胸腺系数增大(P<0.05)，左旋咪唑和刺山柑高剂量组的脾脏胸腺明显增大(P<0.01)。与左旋咪唑组的比较，刺山柑高、低剂量组的胸腺系数增大(P<0.05)，刺山柑高剂量组的脾脏系数增大(P<0.05)。结果表明：小鼠服用刺山柑总黄酮溶液后，脾脏和胸腺等免疫器官的脏器系数有所增加，对动物体免疫调节有升高作用，从而增强免疫力。 表3-5小鼠主要器官的脏器系数((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) 心脏系数 肝脏系数 脾脏系数 肾脏系数 胸腺系数 生理盐水组 0.1 0.245±0.034 1.794±0.021 0.468±0.021▲▲ 0.692±0.024 0.067±0.021▲▲ 0.02%左旋咪唑组 0.1 0.247±0.052 1.856±0.047 0.693±0.085** 0.714±0.079 0.096±0.049** 刺山柑黄酮组 0.1 0.248±0.039 1.804±0.019 0.527±0.028** 0.728±0.048 0.069±0.028*▲ 0.2 0.251±0.026 1.821±0.026 0.684±0.068**▲ 0.710±0.062 0.088±0.052**▲ (2)巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 实验结果见表3-6，与生理盐水组比较，左旋咪唑和刺山柑总黄酮液高剂量组的吞噬百分率和吞噬指数均有极显著提高(P<0.01)，而刺山柑低剂量组对二者没有显著性升高。与左旋咪唑组相比，只有刺山柑总黄酮高剂量组的吞噬百分率有提高(P<0.05)，其他均无显著性差异。结果表明，小鼠服用刺山柑黄酮溶液后，巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数均有所增加，说明刺山柑黄酮液对小鼠免疫调节系统有提高和增强免疫力的作用。 表3-6巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) 吞噬百分率 吞噬指数 生理盐水组 0.1 0.6895±0.1164▲▲ 0.5980±0.0785▲▲ 0.02%左旋咪唑组 0.1 0.7625±0.1100** 0.7559±0.1394** 刺山柑黄酮组 0.1 0.7229±0.0852 0.6814±0.4650 0.2 0.7733±0.0659**▲ 0.7487±0.0451** (3)淋巴细胞增殖反应的四甲基偶氮唑盐比色法(MTT) 实验结果见表3-7，与阴性对照生理盐水组作比较，左旋咪唑和刺山柑总黄酮高、低剂量组的OD值均有显著升高(P<0.05)；与阳性对照0.02%左旋咪唑组作比较，刺山柑总黄酮高剂量组的OD值相对升高(P<0.05)。利用小鼠脾脏培养T淋巴细胞，其增殖率的增加或降低直接表现为动物机体免疫调节作用的增强或减弱，通过MTT结合淋巴细胞内形成甲臜，在酶标仪上检测出数据结果，从而可知供试药对动物免疫机能的影响。实验结果表明，通过对小鼠脾细胞进行细胞增殖反应，其与MTT结合后在570nm测定的OD值显示出，服用刺山柑黄酮溶液后对小鼠免疫系统起到增强作用，提高动物机体免疫力。 表3-7 刺山柑中黄酮对淋巴细胞增殖反应的影响((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) OD值 生理盐水组 0.1 0.274±0.034▲▲ 0.02%左旋咪唑组 0.1 0.354±0.082* 刺山柑黄酮组 0.1 0.327±0.049* 0.2 0.368±0.102*▲ 3.3.3.2 刺山柑中总黄酮对免疫低下小鼠的免疫调节作用 (1)刺山柑中总黄酮对脏器系数的影响 小鼠主要器官脏器系数见表3-8，环磷酰胺对正常小鼠的脾脏和胸腺两个免疫器官都具有使其萎缩的作用(P<0.05)。造模后，利用免疫低下小鼠ig服用刺山柑黄酮溶液，低剂量时能够遏制脾脏器官脏器系数的降低(p<0.05)；高剂量时不仅对脾脏器官有作用，对胸腺的脏器悉数也有防止其萎缩的效果(P<0.05)。结果表明，小鼠通过皮下多点注射5mg/ml环磷酰胺，对小鼠的免疫器官的脏器悉数导致降低，而刺山柑黄酮溶液能够遏制这种情况的发生，并可以将免疫低下小鼠的脏器系数增加至正常以上水平。刺山柑中黄酮成分可以改善动物的免疫力，对免疫低下的动物具有免疫提高作用。 表3-8 小鼠主要器官的脏器系数((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) 心脏系数 肝脏系数 脾脏系数 肾脏系数 胸腺系数 生理盐水组 0.1 0.245±0.034 1.794±0.021 0.468±0.021** 0.692±0.024 0.067±0.021* 环磷酰胺组 0.1 0.263±0.081 1.723±0.129 0.278±0.169 0.628±0.147 0.053±0.138 刺山柑黄酮组 0.1 0.252±0.142 1.767±0.083 0.387±0.275* 0.703±0.093 0.062±0.094 0.2 0.248±0.169 1.784±0.142 0.429±0.232** 0.689±0.267 0.077±0.125* (2)巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果 巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果见表3-9，与模型组环磷酰胺组作比较，无论是吞噬百分率或是吞噬指数均有显著性升高。结果表明，刺山柑对环磷酰胺导致的免疫低下具有升高其免疫调节的作用，增加体内免疫细胞的活性，改善免疫低下动物的免疫力。 表3-9巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) 吞噬百分率 吞噬指数 生理盐水组 0.1 0.6895±0.1164* 0.5980±0.0785* 环磷酰胺组 0.1 0.5340±0.1415 0.4925±0.0741 刺山柑黄酮组 0.1 0.6732±0.1264* 0.5847±0.1278* 0.2 0.7290±0.1984* 0.6302±0.2647* (3)淋巴细胞增殖反应的四甲基偶氮唑盐比色法(MTT) 淋巴细胞增殖反应的四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)实验结果见表3-10，与模型组环磷酰胺组作比较，刺山柑总黄酮高、低剂量组的OD值均有显著升高(P<0.01)；与生理盐水组作比较，模型组的OD值明显降低(P<0.0)，说明环磷酰胺对小鼠的脾脏细胞具有抑制其增殖的作用。MTT可以间接反应出动物免疫机能的升高或降低。实验结果表明，通过对小鼠脾细胞进行细胞增殖反应，其与MTT结合后在570nm测定的OD值显示出，服用刺山柑黄酮溶液后对环磷酰胺导致小鼠免疫系统降低起到增强作用，提高动物机体免疫力。 表3-10 刺山柑总黄酮对淋巴细胞增殖反应的影响((x±s,n=10) 组别 灌胃量(ml/10g) OD值 生理盐水组 0.1 0.274±0.034** 环磷酰胺组 0.1 0.167±0.097 刺山柑黄酮组 0.1 0.288±0.158** 0.2 0.316±0.098** 3.4 讨论 3.4.1 刺山柑总黄酮对动物抗炎镇痛的影响 人类风湿关节炎疾病的主要表现在关节局部炎症反应和疼痛的发生，类风湿关节炎用药对疼痛和炎症的抑制作用是药物最根本的基础作用。本实验药效学实验建立醋酸致小鼠扭体反应、小鼠电热板致痛、二甲苯致小鼠耳廓肿胀和蛋清致小鼠足趾肿胀四种药理学试验模型对刺山柑中总黄酮进行整体药效学实验[43]。实验结果表明，刺山柑醇提物能够减少醋酸所致的小鼠扭体的次数；明显提高小鼠热刺激体表的痛阈，延长热板痛反应时间；有效减轻二甲苯和蛋清引起的小鼠局部肿胀。热板法和醋酸扭体实验室两种用于镇痛药初筛的常用方法，结果表明刺山柑中总黄酮成分具有一定得中枢镇痛和外周镇痛活性。 炎症是具有血管系统的活体组织反应，其基本病理变化为局部组织、细胞的变质、渗出和增生三种病理变化。在一般的炎症过程中，早起以变质和渗出为主，局部炎症有红、肿、热、痛和功能障碍[44]。本研究表明刺山柑醇提物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和蛋清所致小鼠足趾肿胀均具有显著的抑制作用，而且其抑制效果随剂量呈现一定的量效关系，从而说明刺山柑中总黄酮成分能够有效缓解炎症发生过程中的早期症状[45]。 3.4.2 炎症反应和免疫学的关系 一些病原体在侵袭的组织内可致炎症反应。这是一种非特异性防御：它不特定地消灭某种病原体，但以同样的方式攻击所有入侵的病原体。炎症反应使局部血流量增加，并将中性粒细胞带至感染区，吞噬并破坏病原体。如果病原体通过皮肤或未被表面化学物质杀死，则在体内激发炎症反应和免疫反应。由于多种类型的白细胞试图阻止感染扩散，其反应的症状表现为疼痛、肿胀和发热。入侵的病原体损害局部组织，引起前列腺素和组胺的释放，这些物质不仅能引起疼痛和肿胀，同时吸引中性粒细胞聚集[46]。 快速的非特异性炎症反应可防止感染扩散。如果感染持续存在或扩散，则两种特异性的防御，即抗体和细胞免疫将被激活。这些防御称作免疫反应。他们依赖于白细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的作用，防止进一步感染。建立对正常和免疫低下小鼠的免疫学研究，通过考察免疫器官脏器悉数、巨噬细胞吞噬鸡红细胞和脾细胞增殖培养三个免疫学实验的探讨可知，维药材刺山柑中总黄酮物质能有效提高动物免疫调节情况，改善小鼠免疫力。通过对免疫反应的增强来遏制炎症反应的发生，对刺山柑总黄酮治疗类风湿关节样的药用机理提供帮助。 第4章 维药材刺山柑中总黄酮对大鼠佐剂性关节炎的预防和治疗作用的研究 4.1 实验材料 4.1.1 仪器 UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司)；PV-200足趾容积测量仪(成都泰盟科技有限公司)；ST-360BT酶标仪(北京桑翌科技发展有限公司)；血细胞全自动分析仪、自动血液沉降仪、全自动生化分析仪(兰州军区乌鲁木齐总医院)；YD-202A切片机(浙江金华益迪医疗设备厂)。 4.1.2 材料与试剂 维药材刺山柑为新疆吐鲁番野生果实；Wistar大鼠购自自治区疾病控制中心动物房；Freund’s完全佐剂为sigma公司；大鼠细胞因子IL-6、TNF-α定量酶联检测试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)；树脂X-5购自安徽三星科技有限公司；芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所；一次性使用负压储血管(湖南浏阳医用仪器厂)；试剂均为国产分析纯。 4.2 实验方法 4.2.1 维吾尔药材刺山柑中总黄酮药液的制备 实验同3.2.1 4.2.2 大鼠佐剂性关节炎模型的建立[42] 取体重160±20g的Wistar大鼠40只，动物购回后自然饲养一周以适应环境后，随即分成4组即阴性对照组、模型组和刺山柑黄酮高、低剂量组，每组各10只。正常组作对照，刺山柑黄酮组按计量ig给药5天，正常组与模型组ig生理盐水，末次给药1h后刺山柑黄酮组与模型组一起将每只大鼠右后足趾sc注射Freund’s完全佐剂0.1ml致炎，正常组每只大鼠右后足趾sc注射生理盐水。在致炎后一周内检测刺山柑黄酮对原发病的抗炎作用；致炎一周后开始ig给药，连续7天，停药后一周继续用药7天，致炎后第10天开始进行继发病的药效学指标评定，第26天后进行血清学评价和组织切片观察。 4.2.3 刺山柑中总黄酮免疫器官脏器系数的影响[47] 末次给药1h后断颈处死，解剖摘取主要脏器，称重，计算脏器系数。 脏器系数= ×100% 4.2.4 足趾肿胀度的检测 致炎后利用足趾容积测量仪按时间测定大鼠右后足趾的容积，记录一周内测定的足趾容积，通过计算足趾肿胀度和肿胀抑制率来考察刺山柑黄酮对于大鼠佐剂性关节炎原发性病变的影响[48-49]。 足趾肿胀度=注射后的足趾容积-注射前的足趾容积 肿胀抑制率= ×100% 数据分析应用SPSS 11.0软件处理，采用单因素方差分析，结果以(x ±s表示。 4.2.5 关节炎指数评分标准[42] 在致炎后21-28天，用下列评分标准来评价继发性病变的严重性： 病变部位 病变症状 评分 耳 无结节和发红症状 0 有结节和发红症状 1 鼻 无结缔组织的肿胀 0 强烈的结缔组织肿胀 1 尾 无结节 0 有结节 1 前爪 无炎症 0 至少有一个关节炎症 1 有一个以上关节炎症 2 后爪 无炎症 0 轻度炎症 1 中度炎症 2 显著炎症 3 4.2.6 大鼠滑膜组织评分标准[50] 按大鼠滑膜病理5级评分法对炎细胞浸润、滑膜细胞增生和滑膜纤维组织增生进行病理评分。 病理改变 分级 表现 炎细胞浸润 0 无炎性细胞浸润 1 1-5个/高倍视野 2 6-10个/高倍视野 3 11-15个/高倍视野 4 形成小脓肿 滑膜细胞增生程度 0 无浸润 1 肿胀增生(多) 2 增多相连 3 增多双层 4 3层以上 滑膜纤维组织增生程度 0 无增生 1 增生占1/3高倍视野 2 增生占1/2高倍视野 3 增生占1高倍视野 4 增生占>1高倍视野光镜下观察组织形态学的改变 4.2.7 滑膜组织病理切片的观察[51-53] 4.2.7.1 固定 末次给药后各组大鼠禁食24h，心脏采血，脱臼处死大鼠，取下右足小腿关节，10% 的福尔马林关节腔灌注固定6-8h，分离滑膜组织置于10% 的福尔马林固定28h[54]。 4.2.7.2 水洗、脱水和脱色 正常流水冲洗12h后，将滑膜组织依次放入50﹪乙醇2h，70﹪乙醇2h，80%乙醇2h，90﹪乙醇2h，95%乙醇2h，100%乙醇1.5h，100%乙醇1.5h(如需过夜必须在70%乙醇里浸泡)。将脱水好的滑膜组织放在在1：1的100%乙醇-二甲苯中浸泡1-1.5 h，再分别两次在二甲苯分中各浸泡30-60min。 4.2.7.3 浸蜡和包埋 将滑膜组织从二甲苯中取出，放入已经在58-60℃温箱中融化石蜡中3 h，取出再次浸入新融化的石蜡中3h。在已折好的纸船中倒入融化的石蜡，将材料按所需切片的方位要求放于其中，待表面形成膜后放入冷水中使其迅速冷却。 4.2.7.4 修块、切片、贴片和展片 修块、切片可按常规方法进行，贴片可以不用粘片剂，直接在温水中稍浸一下，然后将蜡带平展在载玻片上。切片在45℃温箱中烤4 h。 4.2.7.5 脱蜡、HE染色与镜检 将烘干后的切片分别两次放入二甲苯中各15分钟，然后依次放入1：1的二甲苯-100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、90﹪乙醇、80%乙醇、70﹪乙醇、50﹪乙醇、蒸馏水各3-5 min，苏木精染液10min，蒸馏水、1﹪氨水、蒸馏水、50﹪乙醇、70﹪乙醇、80%乙醇、90﹪乙醇、95%乙醇各放入3-5 min，依红染液5 min、95%乙醇、100%乙醇、1：1的二甲苯-100%乙醇、二甲苯各3-5min后开始镜检。 4.2.8 大鼠局部炎症组织PGE2含量和血清中细胞因子TNF-α、IL-6含量的检测 4.2.8.1 局部炎症组织PGE2含量的检测[55-56] 末次给药1h脱臼处死小鼠后，将致炎足自踝关节以上1cm处剪下，用手术剪刀剪碎皮肤放入2ml生理盐水浸泡48h，离心取上清液0.3ml加入0.5mol/L的KOH-甲醇溶液，50℃水浴使其异构化20min，用甲醇稀释至20 ml，置于波长278 nm处进行测定光密度值(OD)。以每克组织相当的吸收光密度值表示PGE2的含量。 4.2.8.2 血清中TNF-α、IL-6含量的检测[57-58] 大鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-6含量的检测方法，采用ELISA双抗体夹心法，操作步骤按试剂盒说明书进行测定。 4.2.9 大鼠血液常规检测、红细胞沉降率和类风湿因子的检测[59] 末次给药1h后，在手术台上将大鼠用乙醚麻醉，使用0.55×19规格的一次性真空采血器对大鼠进行心脏采血，使用3.2%的枸橼酸钠作抗凝血剂，采至约2ml左右。将大鼠血液置于血细胞自动分析仪上进行血液常规检测，在全自动血沉仪上对大鼠血液进行红细胞沉降率的检测。同样心脏采血方式，收集大鼠血液于含有分离胶和促凝剂的真空采血器中，离心(500r/min，10min)收集血清，对类风湿因子进行检测。 4.3 结果与分析 4.3.1 刺山柑中总黄酮免疫器官脏器系数的影响 大鼠免疫器官的脏器系数结果见表4-1，与模型组相比较，刺山柑高、低剂量组的脾脏系数均有增大，有极显著性差异(P<0.01)；刺山柑低剂量组的胸腺系数有所增加(P<0.05)，刺山柑高剂量组的胸腺系数有显著增加(P<0.01)。正常组相对模型组的脏器系数也有显著差异(P<0.05)。结果表明：弗氏完全佐剂进入大鼠皮下致炎后，通过淋巴系统引起全身关节炎症，致使免疫器官萎缩，大鼠灌服刺山柑黄酮提取液后，可显著抑制免疫器官脏器系数的降低，说明刺山柑黄酮有增强机体免疫力的作用。 表4-1 各组大鼠免疫器官的脏器系数((x±s，n=10) 组别 剂量(ml/100g) 脾脏系数 胸腺系数 正常组 1 0.171±0.028* 0.046±0.012* 模型组 1 0.167±0.051 0.033±0.008 刺山柑黄酮组 1 0.208±0.082** 0.054±0.013* 2 0.211±0.067** 0.061±0.028** 4.3.2 刺山柑黄酮液对大鼠足趾肿胀的影响 大鼠佐剂性关节炎模型中，原发病主要表现为早期致炎局部的炎症反应致炎后18h右脚的肿胀度达峰值，持续3天左右后逐渐减轻，8d后再度肿胀。实验对大鼠造模后18h及5天内的足趾肿胀度进行考察，结果如下列图表所示： 表4-2 造模后20小时内刺山柑黄酮对大鼠足趾肿胀的影响((x±s, n=10) 组别 剂量 (ml/100g) Freund’s完全佐剂致炎后不同时间足趾肿胀度(ml) 0.5h 1h 2h 4h 6h 8h 18h 20h 正常组 1 0.022±0.011** 0.013±0.008** 0.023±0.007** 0.016±0.012** 0.018±0.009** 0.014±0.005** 0.016±0.013** 0.018±006** 模型组 1 0.090±0.052 0.238±0.098 0.041±0.135 0.914±0.214 1.040±0.283 1.268±0.382 1.551±0.324 1.519±0.343 刺山柑 黄酮组 1 0.88±0.063 0.157±0.072 0.369±0.046 0.798±0.221 0.923±0.246 1.058±0.154* 1.216±0.322* 1.297±0.292** 2 0.083±0.032 0.205±0.072 0.345±0.089 0.727±0.265 0.886±0.271* 0.982±0.312* 1.085±0.319** 1.017±0.348** 图4.1 造模后18小时内大鼠足趾肿胀趋势 表4.3 造模后5天内刺山柑黄酮对大鼠足趾肿胀的影响((x±s,n=10) 组别 剂量 (ml/100g) Freund’s完全佐剂致炎后不同时间足趾肿胀度(ml) 1d 2d 3d 4d 5d 正常组 1 0.016±0.012** 0.015±0.007** 0.021±0.011** 0.018±0.012** 0.022±0.012** 模型组 1 1.515±0.308 1.494±0.351 1.384±0.325 1.289±0.307 1.189±0.273 刺山柑黄酮组 1 1.215±0.347* 1.264±0.261** 1.210±0.248* 1.134±0.369 1.017±0.278 2 1.050±0.353** 0.972±0.318** 1.024±0.251** 1.009±0.275* 0.939±0.284* 图4.2 造模后5天内大鼠足趾肿胀趋势 造模后18h内大鼠足趾肿胀实验结果如表4.2及图4.1所示，与模型组相比刺山柑黄酮组的肿胀程度较低，在6h左右时，有显著性差异(P<0.05)；18h后达到极显著差异(P<0.01)，对于弗式完全佐剂引起的初期肿胀有明显的抑制作用。造模后5d内得实验结果如表4.3及图4.2所示，每隔24h测量大鼠足趾肿胀程度，与模型组相比前3d均有极显著性差异，后两天为显著性差异。说明刺山柑中黄酮成分有明显的抗炎作用，可抑制弗式完全佐剂导致的大鼠组织肿胀，对佐剂性关节炎的原发病症有良好的治疗作用。 4.3.3 关节炎指数评分结果 大鼠佐剂性关节炎造模10天后，激发病症表现为对侧(左后肢)和前肢脚的肿胀，耳和尾部出现“关节炎”小结，变应性角膜翳以及体重下降等。对于多发性关节炎指数评分结果见表4-4所示： 表4-4 关节炎指数评分((x±s,n=10) 组别 剂量(ml/100g) 耳 鼻 尾 前爪 后爪 正常组 1 0 0 0 0 0 模型组 1 0.833±0.4216 0.667±0.516 0.750±0.483 1.833±0.422 2.917±0.316 刺山柑黄酮组 1 0.467±0.510 0.435±0.497 0.127±0.382 1.153±0.694 2.767±1.275 2 0.333±0.492* 0.417±0.515 0.083±0.289** 1.083±0.793** 2.586±1.515** 从表中可以看出，刺山柑黄酮组的关节炎指数均低于模型组，其中大鼠尾巴、前爪和后爪与模型组比较有极显著差异性(P<0.01)，刺山柑黄酮对于大鼠佐剂性关节炎激发病症有良好的预防作用。 4.3.4 大鼠滑膜组织病理评分结果 大鼠滑膜病理评分结果见表4-5，模型组大鼠关节滑膜炎细胞浸润、滑膜细胞和滑膜纤维组织增生与正常组比较显著增多(P<0.01)，刺山柑黄酮高剂量组的比低剂量组的治疗作用较显著(P<0.01)。实验结果表明，通过显微镜观察大鼠滑膜组织病理改变情况，考察大鼠关节滑膜炎细胞浸润、滑膜细胞和滑膜纤维组织增生情况，刺山柑对大鼠滑膜组织有显著的保护作用，减少炎细胞浸润，抑制滑膜细胞和滑膜纤维组织的增生，从而治疗类风湿性关节炎。 表4-5 各组大鼠滑膜病理评分结果((x±s,n=10) 组别 剂量(ml/100g) 炎细胞浸润 滑膜细胞增生程度 滑膜纤维组织增生程度 正常组 1 0.18±0.41** 0.02±0.44** 0.04±0.10** 模型组 1 3.25±0.83 2.75±0.58 2.74±0.45 刺山柑黄酮组 1 2.80±0.29* 1.25±0.95* 1.55±0.95* 2 1.72±0.78* 0.84±0.88** 1.12±0.84** 4.3.5 刺山柑总黄酮对大鼠滑膜组织病理作用的影响 各组大鼠大鼠关节滑膜组织病理形态学改变见图4-3 正常组： 大鼠关节滑膜组织多为单层，排列规则，纤维细胞分布均匀，滑膜组织较为疏松，无炎性细胞浸润以及纤维组织增生。 模型组： 大鼠滑膜衬里细胞层明显增多，纤维细胞分布不均匀，滑膜组织呈现断裂并有肉芽生成；滑膜内可见淋巴细胞、浆细胞、以及巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润，并趋化形成淋巴样小结或淋巴滤泡，滑膜血管增多。 刺山柑总黄酮低剂量组： 大鼠滑膜细胞有局部增生，程度较低，无肉芽和炎性细胞浸润，但是对局部滑膜组织仍有较严重的破坏，部分纤维细胞分布不均匀，与模型组作对比，有良好的滑膜保护作用。 刺山柑总黄酮高剂量组： 大鼠滑膜组织比较完整，多数排列整齐，无炎性细胞浸润，血管和纤维细胞无增生现象。 a 正常组 b 模型组 c 刺山柑黄酮低剂量组 d 刺山柑黄酮高剂量组 图4-3 各组大鼠滑膜组织形态学病理改变 4.3.6 刺山柑总黄酮对大鼠足趾炎症组织PGE2含量的影响 刺山柑总黄酮对大鼠足趾PGE2含量见表4-6，与模型组相比较，刺山柑黄酮溶液高、低剂量组中大鼠足趾炎症组织中的PGE2含量均有极显著降低(P<0.01)，模型组中的PGE2含量有大幅升高(P<0.01)。炎症介质是一组参与炎症反应的具有生物活性的化学物质，在炎症发展过程中，其浓度和活性的变化与炎症的轻重相平行。PGE2是其中一种重要炎症介质，能够引起血管扩张，血管壁通透性升高，引起发热、致痛，以及趋化作用[44]。炎症组织PGE2的含量，不仅是反应药物抗炎作用的一个指标而且可揭示药物的抗炎机制。实验结果表明，通过比较供试药刺山柑对局部炎症组织PGE2含量的影响，发现刺山柑能够显著降低大鼠足趾炎症组织中的PGE2含量，从而揭示抑制炎症组织PGE2的合成或释放可能是其发挥抗炎作用的重要途径。 表4-6 刺山柑总黄酮对大鼠足趾炎症组织PGE2含量的影响((x±s,n=10) 组别 剂量(ml/100g) PGE2的OD值 正常组 1 0.253±0.058** 模型组 1 0.327±0.044 刺山柑黄酮组 1 0.273±0.029** 2 0.265±0.093** 4.3.7 刺山柑中总黄酮对大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的影响 按试剂盒说明，先将大鼠IL-6、TNF-α标准品按比例稀释，获得标准曲线见图4-4、图4-5： 图4-4 IL-6标准曲线 图4-5 TNF-α标准曲线 大鼠血清按1：2比例用ddH2O稀释，在酶标仪上450nm处检测OD值通过IL-6、TNF-α标准曲线计算出大鼠血清中IL-6、TNF-α的含量。结果见表4-7，刺山柑黄酮高、低剂量组中IL-6含量极度降低(P<0.01)，刺山柑黄酮高剂量组中TNF-α的含量有所下降(P<0.05)。类风湿关节炎是以小关节病变为主的自身免疫性疾病，患者关节滑膜炎细胞浸润，释放大量的细胞因子，通过对细胞因子的检测，可以大致了解供试药对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用[42]。实验结果表明，刺山柑总黄酮可以有效降低由于弗式完全佐剂引起的关节炎症反应，降低血液中细胞因子的含量，对类风湿关节炎疾病具有治疗作用。 表4-7 刺山柑中总黄酮对大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的影响((x±s,n=10) 组别 剂量(ml/100g) IL-6(pg/ml) TNF-α(pg/ml) 正常组 1 374.100±41.990** 172.450±42.601** 模型组 1 718.150±61.623 225.650±74.488 刺山柑黄酮组 1 448.350±25.353** 216.150±65.635 2 390.850±17.052** 184.400±24.472* 4.3.8 大鼠血液常规检测、红细胞沉降率和类风湿因子的检测 4.3.8.1 刺山柑中总黄酮对大鼠血液常规检测的影响 实验结果见表4-8，一般人类血液常规检查结果包括血红蛋白、白细胞数目、血小板数目以及淋巴细胞等19项检测，但是大鼠的淋巴细胞在仪器中不能做出分类测定，所以实验数据只包括血红蛋白、白细胞数目和血小板数目等13项检测。 与模型组比较，其中刺山柑黄酮组中WBC、HCT、MCH、RDW-CV、RDW-SD和PLT均有不同程度的变化。白细胞数目(WBC)的病理性增加，临床表现在由细菌引起的炎症反应、传染性单核细胞增多、急性出血以及组织损伤；红细胞压积(HCT)在临床上可看作红细胞沉降率的简单测量，反映出炎症的剧烈程度；平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的临床学意义为各类贫血如急性贫血、慢性炎症、维生素缺乏和白血病的检测指标；血小板数目的增加直接表现为感染，失血或溶血等病症，但骨髓增生时血小板也会表现为数量增多(>800×109/L)[59]。 实验结果表明：刺山柑中总黄酮可以有效抑制炎症反应引起的白细胞增加，减少红细胞压积，可以控制血小板数量的恒定，对大鼠佐剂性关节炎的治疗起到预防和治疗的作用。 表4-8 大鼠血液常规检测数据((x±s,n=10) 组别 剂量(ml/100g) WBC HGB RBC HCT MCV MCH MCHC 正常组 1 6.425± 0.971** 136.50± 5.066 6.480± 0.170 40.825± 1.746* 57.975± 1.034 20.150± 0.580* 351.50± 7.681 模型组 1 8.175± 0.585 130.25± 4.193 6.448± 0.116 37.175± 0.995 57.275± 1.135 19.025± 0.750 346.75± 6.344 刺山柑黄酮组 1 6.450± 0.465** 129.75± 2.630 6.950± 0.332 41.250± 0.947* 60.425± 1.468 19.900± 1.134** 347.75± 12.971 2 6.075± 1.307** 136.25± 12.816 7.010± 0.555 42.775± 1.620** 60.450± 1.698 20.225± 0.763** 335.25± 6.702 组别 剂量(ml/100g) RDW-CV RDW-SD PLT MPV PDW PCT 正常组 1 14.175± 0.506** 29.375± 0.299* 672.75± 18.025** 7.975± 0.525* 15.03± 0.789 0.515±0.069 模型组 1 15.275± 0.332 31.350± 0.310 824.75± 55.187 8.650± 0.387 15.70± 0.216 0.605±0.022 刺山柑黄酮组 1 15.250± 1.033 31.300± 0.730 750.00± 20.166* 8.750± 0.265 15.70± 0.392 0.551±0.122 2 13.575± 1.417** 29.825± 0.236* 661.00± 54.851** 9.075± 0.171 16.05± 0.507 0.601±0.042 注： WBC：白细胞数目(×109/L) HGB：血红蛋白(g/L) RBC：红细胞数目(×1012/L) HCT：红细胞压积(%) MCV：平均红细胞体积(fL) MCH：平均红细胞血红蛋白含量(pg) MCHC：平均红细胞血红蛋白浓度(g/L) RDW-CV：红细胞分布宽度变异系数(%) RDW-SD：红细胞分布宽度标准差(fL) PLT：血小板数目(×109/L) MPV：平均血细胞体积(fL) PDW：血小板分布宽度 PCT：血小板压积(%) 4.3.8.2 刺山柑中总黄酮对大鼠血液沉降率的影响 医学上对于类风湿病检测包括血液沉降率和类风湿因子两项内容。动物血液沉降率的病理性加快见于急性炎症反应、结缔组织病变、风湿热活动期、组织严重破坏、贫血、恶性肿瘤和异常球蛋白血症等。所以，对血液沉降率检测可以定量分析类风湿病症人群与正常人群的差别，具体的定性分析需要进一步做类风湿因子的检测[60]。 实验结果见表4-9，与模型组做比较，刺山柑黄酮高剂量组的血沉速率明显降低(P<0.05)，有显著差异性。大鼠佐剂性关节炎会使血液沉降速率升高，相对于正常的大鼠有极显著差异性(P<0.01)，大鼠处于风湿热活动期，足趾关节急性炎症反应强烈，结缔组织病变，组织严重破坏。实验结果表明，刺山柑能有效缓解大鼠的局部炎症反应，对大鼠血液沉降速率有抑制升高的作用，通过淋巴循环进入血液中，可以对类风湿关节炎疾病有效的治疗。 表4-9 刺山柑中总黄酮对大鼠血液沉降率的影响((x±s,n=10) 组别 剂量(ml/100g) 血沉ESR(mm/h) 正常参考值范围 正常组 1 4.354±1.876** ♂：0-15 ♀：0-20 模型组 1 6.237±2.089 刺山柑黄酮组 1 5.648±2.168 2 5.194±3.249* 4.3.8.3 刺山柑中总黄酮对大鼠血清中类风湿因子的影响 类风湿因子( rheumatoid factor，RF) 是临床诊断类风湿性关节炎的重要依据之一。RF是一类自身抗体，包括所有类型的免疫球蛋白。它们是抗变性或聚合IgG分子Fc片段的抗体。诊断所检测的RF主要是IgM类RF，用来检出各种类风湿疾病，是炎症的起源。大约70-80%的类风湿性关节炎患者RF为阳性，但是并不特异，因为RF浓度的升高还出现在非类风湿疾病中。在无RA 临床症状的高龄人群中，阳性率达到大约10%，检测RF为鉴别诊断风湿疾病提供了重要的信息[61-63]。 刺山柑黄酮对大鼠血清中类风湿因子的影响结果见表4-10，对于类风湿因子的检测可以定性检查出动物是否患有类风湿关节炎疾病。正常组10只大鼠均没有检测出细胞因子，而模型组的各大鼠均有RF检测出，刺山柑低、高计量组有9和6只大鼠检测出含有类风湿因子。实验结果表明，大鼠足趾皮下注射弗式完全佐剂后21天，会检测出大鼠血清中含有类风湿因子，说明该大鼠已经患有类风湿性疾病，刺山柑黄酮溶液可以减低RF的含量，达到治疗类风湿关节炎疾病的功能。 表4-10 刺山柑中总黄酮对大鼠血清中类风湿因子的影响 组别 剂量(ml/100g) 类风湿因子RF 正常组 1 0/10 模型组 1 10/10 刺山柑黄酮组 1 9/10 2 6/10 4.4 讨论 4.4.1 类风湿疾病与关节组织中炎症介质的关系 炎症的病理过程与花生四烯酸(AA)代谢、炎性细胞功能和自身免疫过程有关，这些过程相互关联相互影响。通常认为花生四稀酸代谢在这些过程中起重要作用。AA有两条代谢途径：环氧酶(COX)途径和5-脂氧酶(5-LOX)途径。无论是经环氧酶途径产生的前列腺素(PGs)，还是还是脂氧酶途径生成的白三烯(LTs)，都是体内重要的炎症介质。COX和5-LOX代谢产物间存在着一定的平衡制约关系。因次，单纯抑制其中一条代谢途径将引起大量的花生四烯酸进入其他代谢途径，从而造成炎症进一步发展。肾上腺素E2有增加发炎的效应，与炎症如局部充血、水肿及疼痛等症状密切相关，并在免疫调节中起重要作用[64]。 测定炎症组织PGE2的含量，观察药物对其含量的影响，不仅可作为药物抗炎作用的一个指标，而且可以揭示药物的抗炎机制[65]。刺山柑总黄酮提取物通过抑制花生四烯酸代谢途径中的环氧酶途径产生的PGE2，可以有效降低佐剂性关节炎中的PGE2含量，抗炎作用显著，对类风湿关节炎有治疗作用。 4.4.2 类风湿关节炎病症与细胞因子之间的关系 细胞因子具有广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细菌杀伤效应，促进或抑制其他细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。 白细胞介素、肿瘤坏死因子在类风湿关节炎中激活血管内皮细胞，增强内皮细胞粘附分子相互作用而汇集到关节腔内，从而加强炎症的细胞反应，同时激活结缔组织细胞和多型核细胞产生小分子炎症递质加重炎症反应，并减小破骨细胞糖蛋白的合成导致骨和软骨的破坏。本论文检测的IL-6有诸多生物学效应，主要表现在B胞分化为抗体产生细胞、影响巨核细胞分化、使T细胞和骨髓瘤细胞增殖；TNF-α能够杀伤肿瘤细胞、抑制集落形成单位、刺激纤维母细胞，抑制软骨合成和吸收、活化中性粒细胞以及使血管内皮细胞产生凝血因子[66]。 白细胞介素、肿瘤坏死因子在类风湿性关节炎疾病人群中起到至关重要的作用，普遍类风湿疾病患者血液中细胞因子数量会有所升高，从供试药治病机理上考察，能够从根本上治疗疾病而不是单纯抗炎镇痛，刺山柑总黄酮能够有效降低血液中细胞因子含量，抑制其在淋巴循环中引起多处软骨组织损伤，环节关节炎症并达到质量的目的。 第5章 结论 实验以新疆吐鲁番野生刺山柑果实为原料，正交设计优化醇溶超声方法提取刺山柑中总黄酮，以条件浓度为70%的乙醇、超声60min、料液比为1：20时提取刺山柑总黄酮效果最佳。利用静、动态吸附-洗脱试验筛选出分离效果较好的H103型大孔吸附树脂作为对刺山柑中总黄酮进行纯化的树脂。通过芦丁标准品回归方程测得刺山柑中总黄酮含量为63.98%，各颜色反应强烈，其甲醇溶液基本符合黄酮紫外光谱特征。 利用化学试剂及物理条件建立醋酸致小鼠扭体、电热板致痛、二甲苯致小鼠耳廓肿胀以及蛋清致小鼠足趾肿胀四种疼痛、炎症模型，对供试药总黄酮含量为15.45mg/ml的刺山柑果实进行抗炎、镇痛初步研究，效果较好。皮下多点注射环磷酰胺所致小鼠免疫低下模型，与阳性药左旋咪唑对比，刺山柑中总黄酮均能有效增加免疫器官的脏器系数、增强巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力、提高脾细胞增殖活性，达到提高免疫力的作用。 通过对大鼠右后足趾皮下注射弗式完全佐剂制造大鼠佐剂性关节炎模型，于给药21天时以大鼠足趾肿胀趋势、关节病变及滑膜病理变化的组织切片观察、局部炎症中炎症因子含量、血清中细胞因子含量、血液常规检测及血液沉降率、类风湿因子等生理生化指标的变化进行药效学研究。刺山柑中总黄酮能够有效缓解组织炎症引起的肿胀、保护滑膜组织，降低炎性细胞浸润；在血液生化指标检测中，刺山柑中总黄酮可降低炎症介质和细胞因子IL-6、TNF-α含量(P<0.01)，减少白细胞聚集，防止血液沉降速率的加快，达到治疗类风湿性关节炎的目的，其治疗效果随剂量的升高呈现一定的量效关系。 作为维吾尔民间药材，刺山柑在传统意义上可治疗类风湿关节炎疾病。本实验通过分离纯化刺山柑果实中的总黄酮成分，主要研究其对类风湿关节炎疾病的治疗作用。结果表明，刺山柑中总黄酮能够有效减缓炎症反应；降低疼痛发热症状；增强机体免疫力；降低局部炎症；保护关节滑膜组织；干预花生四烯酸途径以及淋巴循环，间接导致体内炎症介质和细胞因子降低至正常水平。其结果显示刺山柑中总黄酮对于类风湿关节炎的治疗作用显著，为开发传统药物资源、扩大医药领域奠定实验基础。 参考文献 [1] 施桂英主编．关节炎概要(第二版)[M] ．北京：中国医药科技出版社，2005：300-384． [2] 栗占国，张奉春，鲍春德．类风湿关节炎(第一版)[M]．北京：人民卫生出版社，2009：29-71． [3] Abeles AM，Pillinger MH．The role of the synovial fibroblast in theumatoid arthritis：cartilage destruction and the regulation of matrix metalloproteinases[J]．Bull NYU Hosp Jt Dis，2006，64：20-24． [4] 何伟主编．医学免疫学[M]，北京：北京人民出版社，2005：273-284． [5] Zhang Zhuoli，Zhang Guozhu，Dongyi．T cell receptor Vβ gene bias in rheumatoid arthritis[J]．Chinese Medical Journal，2002，115(6)：856-859． [6] Zhao Y，Tian 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首先要感谢我的导师王颖教授，学业的顺利完成得益于王老师孜孜不倦的教诲和严谨的治学态度。从论文的选题到实验操作，从实验设计到论文的完成都凝集着王老师的心血和期望。王老师博大胸襟、渊博知识和严谨的态度为我树立了榜样；诲人不倦的师德、乐于奉献的精神和乐观的生活态度使我终身受益；严于利己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。王老师不仅在学业上给予我无私的帮助和指导，而且在生活上给予我巨大的关怀和照顾，不仅“授业解惑”还“教人育人”，硕士三年使我明白了很多为人处世的道理。我还要感谢的是吕巡鲜贤副教授，吕老师是为我提供了精心的指导和大力支持，在生活上并给予了我大量帮助。我将终身牢记恩师的教诲，在此表示最衷心的谢意和敬意！ 本实验主要是在药学院实验室完成，包晓玮老师、阿依古丽副教授、朱金芳老师、杨晓君老师、韩海霞老师、马生军老师、李笑洁老师在实验期间提供了大量的帮助，在此表示感谢！感谢农学院生化教研室石庆华副教授和化工学院遆晓南副教授在我做毕业课题期间所给予的建议和指导。 同时，我还要感谢我的师兄周旋，在我入学的两年里，在实验和生活上给予我的帮助，还要感谢我的师妹张华，在我论文的撰写过程中，不辞辛苦的编辑校对。正是有师兄师妹的大量帮助，我的论文才得以完善，在此表示感谢！感谢我的同窗好友杨大伟、袁芳、吕萌、陈芯等生化点07级同学，在实验和生活中给我我支持和帮助。 最后，我还要感谢我的家人和朋友，三年来他们的理解、关怀和鼓励一直激励着我，他们默默地付出和支持是我最大的精神支柱，也是我能顺利完成学业的最大动力。 姓名： 性别： 出生年月： 民族： 汉族 籍贯： 黑龙江省宁安县 专业： 生物化学与分子生物学 教育经历： 2003.9~2007.7 就读于东北农业大学资源与环境学院生物技术(微生物)专业 2007.6至今 攻读新疆农业大学生物化学与分子生物学专业生化药学方向硕士研究生 发表论文： 1.曹锐，马生军，周旋，等.维药材刺山柑外植体筛选与组培快繁的初步研究[J].北方园艺，2009，8：251~254 2.曹锐，包晓玮，韩海霞，等.正交设计优化大孔吸附树脂提取分离刺山柑中总黄酮的研究[J].新疆农业大学学报2009，32(6)：38~41 会议论文： Cao Rui，Wang Ying. Study on Effects of Anti-inflammatory and Analgesic on Total Flavonoid in Capparis spinosa L., an Uyghur Traditional Herbal.The First World Conference on the Pharmacology of Natural and Traditional Medicines,2009.9 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容和致谢的地方外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者（本人签名）： 年 月 日 学位论文出版授权书 本人及导师完全同意《中国博士学位论文全文数据库出版章程》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库出版章程》(以下简称“章程”)，愿意将本人的学位论文提交“中国学术期刊（光盘版）电子杂志社”在《中国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库》中全文发表和以电子、网络形式公开出版，并同意编入CNKI《中国知识资源总库》，在《中国博硕士学位论文评价数据库》中使用和在互联网上传播，同意按“章程”规定享受相关权益。 论文密级： □公开 □保密（___年__月至__年__月）(保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 作者签名：_______ 导师签名：_______ _______年_____月_____日 _______年_____月_____日 独 创 声 明 本人郑重声明：所呈交的毕业设计(论文)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本设计（论文）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律后果由本人承担。   作者签名: 二〇一〇年九月二十日   毕业设计（论文）使用授权声明 本人完全了解滨州学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定。 本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存设计（论文）；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布设计（论文）的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。 （保密论文在解密后遵守此规定）   作者签名: 二〇一〇年九月二十日 致 谢 时间飞逝，大学的学习生活很快就要过去，在这四年的学习生活中，收获了很多，而这些成绩的取得是和一直关心帮助我的人分不开的。 首先非常感谢学校开设这个课题，为本人日后从事计算机方面的工作提供了经验，奠定了基础。本次毕业设计大概持续了半年，现在终于到结尾了。本次毕业设计是对我大学四年学习下来最好的检验。经过这次毕业设计，我的能力有了很大的提高，比如操作能力、分析问题的能力、合作精神、严谨的工作作风等方方面面都有很大的进步。这期间凝聚了很多人的心血，在此我表示由衷的感谢。没有他们的帮助，我将无法顺利完成这次设计。 首先，我要特别感谢我的知道郭谦功老师对我的悉心指导，在我的论文书写及设计过程中给了我大量的帮助和指导，为我理清了设计思路和操作方法，并对我所做的课题提出了有效的改进方案。郭谦功老师渊博的知识、严谨的作风和诲人不倦的态度给我留下了深刻的印象。从他身上，我学到了许多能受益终生的东西。再次对周巍老师表示衷心的感谢。 其次，我要感谢大学四年中所有的任课老师和辅导员在学习期间对我的严格要求，感谢他们对我学习上和生活上的帮助，使我了解了许多专业知识和为人的道理，能够在今后的生活道路上有继续奋斗的力量。 另外，我还要感谢大学四年和我一起走过的同学朋友对我的关心与支持，与他们一起学习、生活，让我在大学期间生活的很充实，给我留下了很多难忘的回忆。 最后，我要感谢我的父母对我的关系和理解，如果没有他们在我的学习生涯中的无私奉献和默默支持，我将无法顺利完成今天的学业。 四年的大学生活就快走入尾声，我们的校园生活就要划上句号，心中是无尽的难舍与眷恋。从这里走出，对我的人生来说，将是踏上一个新的征程，要把所学的知识应用到实际工作中去。 回首四年，取得了些许成绩，生活中有快乐也有艰辛。感谢老师四年来对我孜孜不倦的教诲，对我成长的关心和爱护。 学友情深，情同兄妹。四年的风风雨雨，我们一同走过，充满着关爱，给我留下了值得珍藏的最美好的记忆。 在我的十几年求学历程里，离不开父母的鼓励和支持，是他们辛勤的劳作，无私的付出，为我创造良好的学习条件，我才能顺利完成完成学业，感激他们一直以来对我的抚养与培育。 最后，我要特别感谢我的导师赵达睿老师、和研究生助教熊伟丽老师。是他们在我毕业的最后关头给了我们巨大的帮助与鼓励，给了我很多解决问题的思路，在此表示衷心的感激。老师们认真负责的工作态度，严谨的治学精神和深厚的理论水平都使我收益匪浅。他无论在理论上还是在实践中，都给与我很大的帮助，使我得到不少的提高这对于我以后的工作和学习都有一种巨大的帮助，感谢他耐心的辅导。在论文的撰写过程中老师们给予我很大的帮助，帮助解决了不少的难点，使得论文能够及时完成，这里一并表示真诚的感谢。 作者简介 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名：　　 　 　　日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 指导教师签名：　　 　 　　 日　　期：　　 　 　　 使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名：　　 　 　　 日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权　　 　 　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 独 创 声 明 本人郑重声明：所呈交的毕业设计(论文)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本设计（论文）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律后果由本人承担。   作者签名: 二〇一〇年九月二十日   毕业设计（论文）使用授权声明 本人完全了解**学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定。 本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存设计（论文）；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布设计（论文）的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。 （保密论文在解密后遵守此规定）   作者签名: 二〇一〇年九月二十日 基本要求：写毕业论文主要目的是培养学生综合运用所学知识和技能，理论联系实际，独立分析，解决实际问题的能力，使学生得到从事本专业工作和进行相关的基本训练。毕业论文应反映出作者能够准确地掌握所学的专业基础知识，基本学会综合运用所学知识进行科学研究的方法，对所研究的题目有一定的心得体会，论文题目的范围不宜过宽，一般选择本学科某一重要问题的一个侧面。 毕业论文的基本教学要求是： 1、培养学生综合运用、巩固与扩展所学的基础理论和专业知识，培养学生独立分析、解决实际问题能力、培养学生处理数据和信息的能力。2、培养学生正确的理论联系实际的工作作风，严肃认真的科学态度。3、培养学生进行社会调查研究；文献资料收集、阅读和整理、使用；提出论点、综合论证、总结写作等基本技能。 毕业论文是毕业生总结性的独立作业，是学生运用在校学习的基本知识和基础理论，去分析、解决一两个实际问题的实践锻炼过程，也是学生在校学习期间学习成果的综合性总结，是整个教学活动中不可缺少的重要环节。撰写毕业论文对于培养学生初步的科学研究能力，提高其综合运用所学知识分析问题、解决问题能力有着重要意义。 毕业论文在进行编写的过程中，需要经过开题报告、论文编写、论文上交评定、论文答辩以及论文评分五个过程，其中开题报告是论文进行的最重要的一个过程，也是论文能否进行的一个重要指标。 撰写意义：1.撰写毕业论文是检验学生在校学习成果的重要措施，也是提高教学质量的重要环节。大学生在毕业前都必须完成毕业论文的撰写任务。申请学位必须提交相应的学位论文，经答辩通过后，方可取得学位。可以这么说，毕业论文是结束大学学习生活走向社会的一个中介和桥梁。毕业论文是大学生才华的第一次显露，是向祖国和人民所交的一份有份量的答卷，是投身社会主义现代化建设事业的报到书。一篇毕业论文虽然不能全面地反映出一个人的才华，也不一定能对社会直接带来巨大的效益，对专业产生开拓性的影响。但是，实践证明，撰写毕业论文是提高教学质量的重要环节，是保证出好人才的重要措施。 2.通过撰写毕业论文，提高写作水平是干部队伍“四化”建设的需要。党中央要求，为了适应现代化建设的需要，领导班子成员应当逐步实现“革命化、年轻化、知识化、专业化”。这个“四化”的要求，也包含了对干部写作能力和写作水平的要求。 3.提高大学生的写作水平是社会主义物质文明和精神文明建设的需要。在新的历史时期，无论是提高全族的科学文化水平，掌握现代科技知识和科学管理方法，还是培养社会主义新人，都要求我们的干部具有较高的写作能力。在经济建设中，作为领导人员和机关的办事人员，要写指示、通知、总结、调查报告等应用文；要写说明书、广告、解说词等说明文；还要写科学论文、经济评论等议论文。在当今信息社会中，信息对于加快经济发展速度，取得良好的经济效益发挥着愈来愈大的作用。写作是以语言文字为信号，是传达信息的方式。信息的来源、信息的收集、信息的储存、整理、传播等等都离不开写作。 论文种类：毕业论文是学术论文的一种形式，为了进一步探讨和掌握毕业论文的写作规律和特点，需要对毕业论文进行分类。由于毕业论文本身的内容和性质不同，研究领域、对象、方法、表现方式不同，因此，毕业论文就有不同的分类方法。 按内容性质和研究方法的不同可以把毕业论文分为理论性论文、实验性论文、描述性论文和设计性论文。后三种论文主要是理工科大学生可以选择的论文形式，这里不作介绍。文科大学生一般写的是理论性论文。理论性论文具体又可分成两种：一种是以纯粹的抽象理论为研究对象，研究方法是严密的理论推导和数学运算，有的也涉及实验与观测，用以验证论点的正确性。另一种是以对客观事物和现象的调查、考察所得观测资料以及有关文献资料数据为研究对象，研究方法是对有关资料进行分析、综合、概括、抽象，通过归纳、演绎、类比，提出某种新的理论和新的见解。 按议论的性质不同可以把毕业论文分为立论文和驳论文。立论性的毕业论文是指从正面阐述论证自己的观点和主张。一篇论文侧重于以立论为主，就属于立论性论文。立论文要求论点鲜明，论据充分，论证严密，以理和事实服人。驳论性毕业论文是指通过反驳别人的论点来树立自己的论点和主张。如果毕业论文侧重于以驳论为主，批驳某些错误的观点、见解、理论，就属于驳论性毕业论文。驳论文除按立论文对论点、论据、论证的要求以外，还要求针锋相对，据理力争。 按研究问题的大小不同可以把毕业论文分为宏观论文和微观论文。凡届国家全局性、带有普遍性并对局部工作有一定指导意义的论文，称为宏观论文。它研究的面比较宽广，具有较大范围的影响。反之，研究局部性、具体问题的论文，是微观论文。它对具体工作有指导意义，影响的面窄一些。 另外还有一种综合型的分类方法，即把毕业论文分为专题型、论辩型、综述型和综合型四大类： 1．专题型论文。这是分析前人研究成果的基础上，以直接论述的形式发表见解，从正面提出某学科中某一学术问题的一种论文。如本书第十二章例文中的《浅析领导者突出工作重点的方法与艺术》一文，从正面论述了突出重点的工作方法的意义、方法和原则，它表明了作者对突出工作重点方法的肯定和理解。2．论辩型论文。这是针对他人在某学科中某一学术问题的见解，凭借充分的论据，着重揭露其不足或错误之处，通过论辩形式来发表见解的一种论文。3．综述型论文。这是在归纳、总结前人或今人对某学科中某一学术问题已有研究成果的基础上，加以介绍或评论，从而发表自己见解的一种论文。4．综合型论文。这是一种将综述型和论辩型两种形式有机结合起来写成的一种论文。如《关于中国民族关系史上的几个问题》一文既介绍了研究民族关系史的现状，又提出了几个值得研究的问题。因此，它是一篇综合型的论文。 写作步骤：毕业论文是高等教育自学考试本科专业应考者完成本科阶段学业的最后一个环节，它是应考者的 总结 性独立作业，目的在于总结学习专业的成果，培养综合运用所学知识解决实际 问题 的能力。从文体而言，它也是对某一专业领域的现实问题或 理论 问题进行 科学 研究 探索的具有一定意义的论说文。完成毕业论文的撰写可以分两个步骤，即选择课题和研究课题。 首先是选择课题。选题是论文撰写成败的关键。因为，选题是毕业论文撰写的第一步，它实际上就是确定“写什么”的问题，亦即确定科学研究的方向。如果“写什么”不明确，“怎么写”就无从谈起。 教育部自学考试办公室有关对毕业论文选题的途径和要求是“为鼓励理论与工作实践结合，应考者可结合本单位或本人从事的工作提出论文题目，报主考学校审查同意后确立。也可由主考学校公布论文题目，由应考者选择。毕业论文的总体要求应与普通全日制高等学校相一致，做到通过论文写作和答辩考核，检验应考者综合运用专业知识的能力”。但不管考生是自己任意选择课题，还是在主考院校公布的指定课题中选择课题，都要坚持选择有科学价值和现实意义的、切实可行的课题。选好课题是毕业论文成功的一半。 第一、要坚持选择有科学价值和现实意义的课题。科学研究的目的是为了更好地认识世界、改造世界，以推动社会的不断进步和发展 。因此，毕业论文的选题，必须紧密结合社会主义物质文明和精神文明建设的需要，以促进科学事业发展和解决现实存在问题作为出发点和落脚点。选题要符合科学研究的正确方向，要具有新颖性，有创新、有理论价值和现实的指导意义或推动作用，一项毫无意义的研究，即使花很大的精力，表达再完善，也将没有丝毫价值。具体地说，考生可从以下三个方面来选题。首先，要从现实的弊端中选题，学习了专业知识，不能仅停留在书本上和理论上，还要下一番功夫，理论联系实际，用已掌握的专业知识，去寻找和解决工作实践中急待解决的问题。其次，要从寻找科学研究的空白处和边缘领域中选题，科学研究。还有许多没有被开垦的处女地，还有许多缺陷和空白，这些都需要填补。应考者应有独特的眼光和超前的意识去思索，去发现，去研究。最后，要从寻找前人研究的不足处和错误处选题，在前人已提出来的研究课题中，许多虽已有初步的研究成果，但随着社会的不断发展，还有待于丰富、完整和发展，这种补充性或纠正性的研究课题，也是有科学价值和现实指导意义的。 第二、要根据自己的能力选择切实可行的课题。毕业论文的写作是一种创造性劳动，不但要有考生个人的见解和主张，同时还需要具备一定的客观条件。由于考生个人的主观、客观条件都是各不相同的，因此在选题时，还应结合自己的特长、兴趣及所具备的客观条件来选题。具体地说，考生可从以下三个方面来综合考虑。首先，要有充足的资料来源。“巧妇难为无米之炊”，在缺少资料的情况下，是很难写出高质量的论文的。选择一个具有丰富资料来源的课题，对课题深入研究与开展很有帮助。其次，要有浓厚的研究兴趣，选择自己感兴趣的课题，可以激发自己研究的热情，调动自己的主动性和积极性，能够以专心、细心、恒心和耐心的积极心态去完成。最后，要能结合发挥自己的业务专长，每个考生无论能力水平高低，工作岗位如何，都有自己的业务专长，选择那些能结合自己工作、发挥自己业务专长的课题，对顺利完成课题的研究大有益处。 致 谢 这次论文的完成，不止是我自己的努力，同时也有老师的指导，同学的帮助，以及那些无私奉献的前辈，正所谓你知道的越多的时候你才发现你知道的越少，通过这次论文，我想我成长了很多，不只是磨练了我的知识厚度，也使我更加确定了我今后的目标：为今后的计算机事业奋斗。在此我要感谢我的指导老师——***老师，感谢您的指导，才让我有了今天这篇论文，您不仅是我的论文导师，也是我人生的导师，谢谢您！我还要感谢我的同学，四年的相处，虽然我未必记得住每分每秒，但是我记得每一个有你们的精彩瞬间，我相信通过大学的历练，我们都已经长大，变成一个有担当，有能力的新时代青年，感谢你们的陪伴，感谢有你们，这篇论文也有你们的功劳，我想毕业不是我们的相处的结束，它是我们更好相处的开头，祝福你们！我也要感谢父母，这是他们给我的，所有的一切；感谢母校，尽管您不以我为荣，但我一直会以我是一名农大人为荣。 通过这次毕业设计，我学习了很多新知识，也对很多以前的东西有了更深的记忆与理解。漫漫求学路，过程很快乐。我要感谢信息与管理科学学院的老师，我从他们那里学到了许多珍贵的知识和做人处事的道理，以及科学严谨的学术态度，令我受益良多。同时还要感谢学院给了我一个可以认真学习，天天向上的学习环境和机会。 即将结束*大学习生活，我感谢****大学提供了一次在**大接受教育的机会，感谢院校老师的无私教导。感谢各位老师审阅我的论文。 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名：　　 　 　　日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 指导教师签名：　　 　 　　 日　　期：　　 　 　　 使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名：　　 　 　　 日　 期：　　 　 　　 ​​​​​​​​​​​​ 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权　　 　 　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 独 创 声 明 本人郑重声明：所呈交的毕业设计(论文)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本设计（论文）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律后果由本人承担。   作者签名: 年 月 日   毕业设计（论文）使用授权声明 本人完全了解**学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定。 本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存设计（论文）；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布设计（论文）的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。 （保密论文在解密后遵守此规定）   作者签名: 年 月 日 基本要求：写毕业论文主要目的是培养学生综合运用所学知识和技能，理论联系实际，独立分析，解决实际问题的能力，使学生得到从事本专业工作和进行相关的基本训练。毕业论文应反映出作者能够准确地掌握所学的专业基础知识，基本学会综合运用所学知识进行科学研究的方法，对所研究的题目有一定的心得体会，论文题目的范围不宜过宽，一般选择本学科某一重要问题的一个侧面。 毕业论文的基本教学要求是： 1、培养学生综合运用、巩固与扩展所学的基础理论和专业知识，培养学生独立分析、解决实际问题能力、培养学生处理数据和信息的能力。2、培养学生正确的理论联系实际的工作作风，严肃认真的科学态度。3、培养学生进行社会调查研究；文献资料收集、阅读和整理、使用；提出论点、综合论证、总结写作等基本技能。 毕业论文是毕业生总结性的独立作业，是学生运用在校学习的基本知识和基础理论，去分析、解决一两个实际问题的实践锻炼过程，也是学生在校学习期间学习成果的综合性总结，是整个教学活动中不可缺少的重要环节。撰写毕业论文对于培养学生初步的科学研究能力，提高其综合运用所学知识分析问题、解决问题能力有着重要意义。 毕业论文在进行编写的过程中，需要经过开题报告、论文编写、论文上交评定、论文答辩以及论文评分五个过程，其中开题报告是论文进行的最重要的一个过程，也是论文能否进行的一个重要指标。 撰写意义：1.撰写毕业论文是检验学生在校学习成果的重要措施，也是提高教学质量的重要环节。大学生在毕业前都必须完成毕业论文的撰写任务。申请学位必须提交相应的学位论文，经答辩通过后，方可取得学位。可以这么说，毕业论文是结束大学学习生活走向社会的一个中介和桥梁。毕业论文是大学生才华的第一次显露，是向祖国和人民所交的一份有份量的答卷，是投身社会主义现代化建设事业的报到书。一篇毕业论文虽然不能全面地反映出一个人的才华，也不一定能对社会直接带来巨大的效益，对专业产生开拓性的影响。但是，实践证明，撰写毕业论文是提高教学质量的重要环节，是保证出好人才的重要措施。 2.通过撰写毕业论文，提高写作水平是干部队伍“四化”建设的需要。党中央要求，为了适应现代化建设的需要，领导班子成员应当逐步实现“革命化、年轻化、知识化、专业化”。这个“四化”的要求，也包含了对干部写作能力和写作水平的要求。 3.提高大学生的写作水平是社会主义物质文明和精神文明建设的需要。在新的历史时期，无论是提高全族的科学文化水平，掌握现代科技知识和科学管理方法，还是培养社会主义新人，都要求我们的干部具有较高的写作能力。在经济建设中，作为领导人员和机关的办事人员，要写指示、通知、总结、调查报告等应用文；要写说明书、广告、解说词等说明文；还要写科学论文、经济评论等议论文。在当今信息社会中，信息对于加快经济发展速度，取得良好的经济效益发挥着愈来愈大的作用。写作是以语言文字为信号，是传达信息的方式。信息的来源、信息的收集、信息的储存、整理、传播等等都离不开写作。 论文种类：毕业论文是学术论文的一种形式，为了进一步探讨和掌握毕业论文的写作规律和特点，需要对毕业论文进行分类。由于毕业论文本身的内容和性质不同，研究领域、对象、方法、表现方式不同，因此，毕业论文就有不同的分类方法。 按内容性质和研究方法的不同可以把毕业论文分为理论性论文、实验性论文、描述性论文和设计性论文。后三种论文主要是理工科大学生可以选择的论文形式，这里不作介绍。文科大学生一般写的是理论性论文。理论性论文具体又可分成两种：一种是以纯粹的抽象理论为研究对象，研究方法是严密的理论推导和数学运算，有的也涉及实验与观测，用以验证论点的正确性。另一种是以对客观事物和现象的调查、考察所得观测资料以及有关文献资料数据为研究对象，研究方法是对有关资料进行分析、综合、概括、抽象，通过归纳、演绎、类比，提出某种新的理论和新的见解。 按议论的性质不同可以把毕业论文分为立论文和驳论文。立论性的毕业论文是指从正面阐述论证自己的观点和主张。一篇论文侧重于以立论为主，就属于立论性论文。立论文要求论点鲜明，论据充分，论证严密，以理和事实服人。驳论性毕业论文是指通过反驳别人的论点来树立自己的论点和主张。如果毕业论文侧重于以驳论为主，批驳某些错误的观点、见解、理论，就属于驳论性毕业论文。驳论文除按立论文对论点、论据、论证的要求以外，还要求针锋相对，据理力争。 按研究问题的大小不同可以把毕业论文分为宏观论文和微观论文。凡届国家全局性、带有普遍性并对局部工作有一定指导意义的论文，称为宏观论文。它研究的面比较宽广，具有较大范围的影响。反之，研究局部性、具体问题的论文，是微观论文。它对具体工作有指导意义，影响的面窄一些。 另外还有一种综合型的分类方法，即把毕业论文分为专题型、论辩型、综述型和综合型四大类： 1．专题型论文。这是分析前人研究成果的基础上，以直接论述的形式发表见解，从正面提出某学科中某一学术问题的一种论文。如本书第十二章例文中的《浅析领导者突出工作重点的方法与艺术》一文，从正面论述了突出重点的工作方法的意义、方法和原则，它表明了作者对突出工作重点方法的肯定和理解。2．论辩型论文。这是针对他人在某学科中某一学术问题的见解，凭借充分的论据，着重揭露其不足或错误之处，通过论辩形式来发表见解的一种论文。3．综述型论文。这是在归纳、总结前人或今人对某学科中某一学术问题已有研究成果的基础上，加以介绍或评论，从而发表自己见解的一种论文。4．综合型论文。这是一种将综述型和论辩型两种形式有机结合起来写成的一种论文。如《关于中国民族关系史上的几个问题》一文既介绍了研究民族关系史的现状，又提出了几个值得研究的问题。因此，它是一篇综合型的论文。 写作步骤：毕业论文是高等教育自学考试本科专业应考者完成本科阶段学业的最后一个环节，它是应考者的 总结 性独立作业，目的在于总结学习专业的成果，培养综合运用所学知识解决实际 问题 的能力。从文体而言，它也是对某一专业领域的现实问题或 理论 问题进行 科学 研究 探索的具有一定意义的论说文。完成毕业论文的撰写可以分两个步骤，即选择课题和研究课题。 首先是选择课题。选题是论文撰写成败的关键。因为，选题是毕业论文撰写的第一步，它实际上就是确定“写什么”的问题，亦即确定科学研究的方向。如果“写什么”不明确，“怎么写”就无从谈起。 教育部自学考试办公室有关对毕业论文选题的途径和要求是“为鼓励理论与工作实践结合，应考者可结合本单位或本人从事的工作提出论文题目，报主考学校审查同意后确立。也可由主考学校公布论文题目，由应考者选择。毕业论文的总体要求应与普通全日制高等学校相一致，做到通过论文写作和答辩考核，检验应考者综合运用专业知识的能力”。但不管考生是自己任意选择课题，还是在主考院校公布的指定课题中选择课题，都要坚持选择有科学价值和现实意义的、切实可行的课题。选好课题是毕业论文成功的一半。 第一、要坚持选择有科学价值和现实意义的课题。科学研究的目的是为了更好地认识世界、改造世界，以推动社会的不断进步和发展 。因此，毕业论文的选题，必须紧密结合社会主义物质文明和精神文明建设的需要，以促进科学事业发展和解决现实存在问题作为出发点和落脚点。选题要符合科学研究的正确方向，要具有新颖性，有创新、有理论价值和现实的指导意义或推动作用，一项毫无意义的研究，即使花很大的精力，表达再完善，也将没有丝毫价值。具体地说，考生可从以下三个方面来选题。首先，要从现实的弊端中选题，学习了专业知识，不能仅停留在书本上和理论上，还要下一番功夫，理论联系实际，用已掌握的专业知识，去寻找和解决工作实践中急待解决的问题。其次，要从寻找科学研究的空白处和边缘领域中选题，科学研究。还有许多没有被开垦的处女地，还有许多缺陷和空白，这些都需要填补。应考者应有独特的眼光和超前的意识去思索，去发现，去研究。最后，要从寻找前人研究的不足处和错误处选题，在前人已提出来的研究课题中，许多虽已有初步的研究成果，但随着社会的不断发展，还有待于丰富、完整和发展，这种补充性或纠正性的研究课题，也是有科学价值和现实指导意义的。 第二、要根据自己的能力选择切实可行的课题。毕业论文的写作是一种创造性劳动，不但要有考生个人的见解和主张，同时还需要具备一定的客观条件。由于考生个人的主观、客观条件都是各不相同的，因此在选题时，还应结合自己的特长、兴趣及所具备的客观条件来选题。具体地说，考生可从以下三个方面来综合考虑。首先，要有充足的资料来源。“巧妇难为无米之炊”，在缺少资料的情况下，是很难写出高质量的论文的。选择一个具有丰富资料来源的课题，对课题深入研究与开展很有帮助。其次，要有浓厚的研究兴趣，选择自己感兴趣的课题，可以激发自己研究的热情，调动自己的主动性和积极性，能够以专心、细心、恒心和耐心的积极心态去完成。最后，要能结合发挥自己的业务专长，每个考生无论能力水平高低，工作岗位如何，都有自己的业务专长，选择那些能结合自己工作、发挥自己业务专长的课题，对顺利完成课题的研究大有益处。 致 谢 这次论文的完成，不止是我自己的努力，同时也有老师的指导，同学的帮助，以及那些无私奉献的前辈，正所谓你知道的越多的时候你才发现你知道的越少，通过这次论文，我想我成长了很多，不只是磨练了我的知识厚度，也使我更加确定了我今后的目标：为今后的计算机事业奋斗。在此我要感谢我的指导老师——***老师，感谢您的指导，才让我有了今天这篇论文，您不仅是我的论文导师，也是我人生的导师，谢谢您！我还要感谢我的同学，四年的相处，虽然我未必记得住每分每秒，但是我记得每一个有你们的精彩瞬间，我相信通过大学的历练，我们都已经长大，变成一个有担当，有能力的新时代青年，感谢你们的陪伴，感谢有你们，这篇论文也有你们的功劳，我想毕业不是我们的相处的结束，它是我们更好相处的开头，祝福你们！我也要感谢父母，这是他们给我的，所有的一切；感谢母校，尽管您不以我为荣，但我一直会以我是一名农大人为荣。 通过这次毕业设计，我学习了很多新知识，也对很多以前的东西有了更深的记忆与理解。漫漫求学路，过程很快乐。我要感谢信息与管理科学学院的老师，我从他们那里学到了许多珍贵的知识和做人处事的道理，以及科学严谨的学术态度，令我受益良多。同时还要感谢学院给了我一个可以认真学习，天天向上的学习环境和机会。 即将结束*大学习生活，我感谢****大学提供了一次在**大接受教育的机会，感谢院校老师的无私教导。感谢各位老师审阅我的论文。 骨 软骨 软骨细胞 中性粒细胞 破骨细胞 基质金属 蛋白酶 白细胞介素-1 肿瘤坏死因子-α 基质金属蛋白酶 IL-1 TNF-α 巨噬细胞 树突状细胞 Rank-配体 B细胞 免疫球蛋白(类风湿因子) 免疫复合物 血管内皮 肥大 细胞 IL-2 干扰素 T细胞 血管内皮生长因子 白细胞介素-1 肿瘤坏死因子-α 侵蚀部分 免疫部分 白细胞三烯B4 前列腺素E2 白细胞介素-8 蛋白酶 缓解 类风湿关节炎 药物和方法 理念和策略 ·控制病情完全缓解 ·生活质量改变 ·多种传统DMARDs ·生物制剂 ·其他治疗：NSARDs 激素 植物药 免疫净化 ·早期治疗联合用药 ·共识及指南 刺山柑黄酮 芦丁 生理盐水组小鼠扭体次数-给药组小鼠扭体次数 生理盐水组小鼠扭体反应次数 给药后痛阈-给药前痛阈 给药前痛阈 生理盐水组肿胀度-用药组肿胀度 生理盐水组平均肿胀度 生理盐水组肿胀度-给药组肿胀度 生理盐水组肿胀度 脏器重量 小鼠重量 吞噬红细胞的巨噬细胞数数 200个巨噬细胞 被吞噬的鸡红细胞数 200个巨噬细胞 脏器重量 小鼠重量 模型组足趾容积-给药组足跖容积 模型组足跖容积