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分子克隆实验原理分子克隆实验原理一、菌种保存和活化二、质粒提取和保存三、感受态细胞的制备四、载体的制备五、基因的制备六、连接七、转化八、重组克隆的筛选菌种保存和活化一.甘油菌保存：1、100ul菌液＋100ul灭菌甘油【混匀】2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】3、－20℃可保存半年；【－80℃可长期保存】二、甘油菌活化：1、取一管甘油菌，混匀；2、用接种针接种并在培养平板上划线；3、37℃倒置培养12h；4、挑单克隆于2.5mlLB(视情况加抗生素〕，37℃振荡培养12h.【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】质粒的提取原理－碱裂解法三种溶液：溶液1：50mmol/l葡萄糖----------------维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；25mmol/lTri·Cl〔pH8.0)---维持pH;10mmol/lEDTA(pH8.0)------螯合Ca2+,DNase失活，保护DNA溶液2：0.2mol/NaOH--------------------核酸变性〔pH>12或pH<3)(解链〕1%SDS-----------------------------蛋白变性，裂解细胞。溶液3：7.5mol/LNH4AC〔pH7.6)-------沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性〔可溶〕。其它溶液：〔1〕2MNH4AC------------------------------沉淀蛋白，溶解核酸；(2)异丙醇-----------------------------沉淀质粒〔3〕70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。(4)RNase--------------------------------除去细菌RNA质粒的提取原理－碱裂解法Protocal:1.5ml菌液，12000rpm*1min,弃上清〔repeat)－－收集细菌溶液1(200ul),剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液溶液2(400ul)，温柔混匀，冰中5min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性溶液3(300ul),温柔混匀，冰中10min;－－－－－－－质粒复性13000rpm*5min,取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA540ul异丙醇，室温10min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒14000rpm*10min,弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质100ul2MNH4AC13000rpm*5min,取上清；100ul异丙醇，室温10min;14000rpm*10min,弃上清；70%乙醇500ul,14000rpm*10min,弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分烘干10-30min,－－－－－－－－－－－－－－－－－除去乙醇50ulddH2O(含0.1mg/mlRNase),37°C*30min.－－－－除去细菌RNA电泳鉴定初抽精抽除去少量杂质蛋白质粒的保存1.ddH2O(可含EDTA)中可短期保存[4℃保存1月;-20℃可保存一年]2.75%乙醇可长期保存.3.烘干可长期保存(可能难溶)感受态细胞的制备1.菌种活化2.取菌液至50mlLB培养液中；3、37℃，振荡培养2h至对数期；4、转至50ml无菌塑料管，0℃*10min;5、5000rpm*10min*4℃6、取沉淀，加25ml50mMCaCl2【0℃，无菌】7、5000rpm*10min*4℃8、取沉淀,加2ml含15％甘油的50mMCaCl2重悬，200ul/tube分装，液氮速冻后至－80℃冰箱保存〔半年有效〕。【注意：〔1〕需要做一个无质粒的对照〔2〕并用质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率－－大约106【1ugPUC质粒，产生克隆106】载体的制备1、酶切〔放大体积100ul，要充分)2、胶回收〔注意远紫外照射时间不能太长，防止DNA突变〕3、纯度，浓度测定。(电泳测定〕基因的制备(*)1、PCR扩增2.酶切3、胶回收4、纯度，浓度测定连接1、总体积为10ul；2、16℃连接过夜；3、基因mol/载体mol≈10;【平端≈15】转化1、连接产物5ul参加感受态细胞中；2、混匀，冰上30min-------cell吸附DNA3、42℃,90s－－－－热击，促进DNA进入cell4、冰上1～2min－－使细胞复原5、加1mlLB(无Amp)－－外源DNA还未达6、37℃培养1h－－Amp抗性基因表达7、6000rpm*30s，浓缩100ul8、涂板〔Amp板〕－－抗性筛选9、37℃培养过夜。重组克隆的筛选*1、抗性筛选；2、蓝白斑筛选；3、酶切电泳筛选(*)；4、PCR筛选；5、测序验证；6、表达筛选；7、生物活性筛选。抗性筛选--质粒载体携带的筛选标记1.AmpR〔氨苄青霉素抗性〕2、TetR(四环素抗性〕3、KanR(卡那霉素抗性)特点：一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入。克隆的Amp抗性筛选蓝白斑筛选－－β半乳糖苷酶〔LacZ)的显色反响一、α互补：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一局部〔无活性〕，载体表达一局部〔无活性〕，合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。〔需要IPTG诱导表达〕－－蓝斑；二、外源基因插入载体后，使载体局部LacZ失活，无法进行α互补－－白斑。〔√〕三、特点：1、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；2、无法确定基因插入的方向；3、特殊：基因过小，且读框正确，可能无法使载体局部LacZ失活，将产生α互补，产生蓝斑。酶切电泳筛选(*)一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断的大小。二、特点：1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。2、结果可靠但操作比较麻烦；3、无法检测基因内部的突变。EcoR1和Xho1双酶切筛选PCR筛选1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒。二、特点：1、可用2ul菌液做，快速，方便，可批量检测。2、不能检测基因插入方向3、不能检测基因内部突变。测序验证一、选取阳性克隆，送公司测序；二、特点：1、最可靠的检测方法。可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。1、一次测序反响一般准确测定500bp左右(也有测准800bp,价格贵〕－－60元左右。2、测定的序列靠近引物〔起点〕20~30bp不准，500bp后的序列也不准。3、〔1〕质粒测序：测序引物公司提供〔2〕PCR产物直接测序：测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。注意:A.测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引物一般不能测序；B.测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在50％～60%左右。测序验证表达筛选一、SDS-PAGE筛选；二、亲和筛选；三、免疫筛选；SDS-PAGE筛选1、小量诱导表达；2、全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳；3、重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。〔需加不诱导的对照〕特点：1、可检测外源基因的表达。〔一般基因的插入，方向，读框都正确〕2、无法筛选不能有效表达的重组质粒。亲和筛选1.50ml菌液诱导表达，2、超声破菌，3、用少量亲和beads吸附上清；4、SDS-PAGE检测，在特点位点将出现一条蛋白带。特点：1、适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测；2、比SDS-PAGE筛选更灵敏〔富集〕，可靠；3、比较麻烦。免疫筛选用抗体检测目标蛋白：Westernblot〔最准确〕ELISA(可能会受到交叉反响的干扰〕生物活性筛选酶：测定酶活；亲和蛋白：与亲和底物作用。其它的生物活性。分子克隆流程1、分析基因，载体特点；2、设计克隆策略；3、检测基因，载体的正确性；4、制备感受态细胞，目的基因，载体；5、连接，转化。6、筛选克隆〔1〕Amp抗性初筛；〔2〕PCR筛选〔或酶切筛选〕；〔3〕表达筛选〔SDS-PAGE和亲和筛选〕；〔4〕测序验证〔5〕生物活性筛选。