null第二章 基因工程制药第二章 基因工程制药第一节 基础知识
第二节 基因工程制药的基本
第一节 基础知识第一节 基础知识1. 细胞的结构(真核和原核)1. 细胞的结构(真核和原核)真核细胞原核细胞nullnull细胞大小null非细胞生命体2. 细胞核中的染色体2. 细胞核中的染色体nullnull染色体
chromosome染色体
chromosomenullDNA 长度: 4.6 x 107 bp = 1.5 cm
Chromosome 长度: 2 µm
压缩率 = 8000130 nm 纤维null30 nm 染色质纤维5压缩率 = 50null4DNA组蛋白组蛋白3. DNA3. DNAhelical10 layer
Lines
Between
Cross
Patterns
(10
Residues
Per turn)碱基互补:A/T C/G碱基互补:A/T C/GnullABZ12DNA半保留复制DNA半保留复制4. 基因组4. 基因组任何一条染色体上都带有许多基因,一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因,一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes(基因组)。
null 几种生物的基因组比较病毒SV40 5.2 1 环状
大肠杆菌 4000 1 环状
酵母 17 × 17000 17 线状
人 23 × 5-7×106 23 线状 种类 大小 ( Kb) 染色体数 形状5. 基因5. 基因DNA上具有特定功能的一个片断,负责一种特定性状的
达。一般来讲,一个基因只编码一个蛋白质。DNA上的基因DNA上的基因6. DNA、RNA与蛋白质6. DNA、RNA与蛋白质DNA:两条互补链。由ATCG四个字母(碱基)形成的字符串。
RNA:单链结构。由AUCG四个字母(碱基)形成的字符串。
蛋白质:一条或多条肽链。每个肽链是由20种氨基酸形成的长链,即20个字母(氨基酸)形成的字符串。
翻译:每3个碱基翻译成一个氨基酸。7. 电泳7. 电泳在凝胶一端小槽中放入荧光标记的DNA片断,两端加电压,短DNA片断跑得快,长DNA片断跑得慢。
测序时需要区分长度只差一个碱基的片断8. PCR8. PCRDNA体外扩增方法的一种,能够将很少的试样(比如只有罪犯的一滴血),扩增成完全相同的无数拷贝。
每PCR一轮,扩增两倍 1-2-4-8-16…
PCR(polymerase chain reaction,
聚合酶链式反应)很少有在公司工作的科研人员得
诺贝尔奖, Mullis是其中之一很少有在公司工作的科研人员得
诺贝尔奖, Mullis是其中之一Kary B. Mullis (1944 -),在Cetus公司工作期间,发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进
序工作, 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上,他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物(而不是一个引物)去扩增模板DNA 的想法…...nullMullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链,自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶,面对面地合成着DNA, ……null PCR技术的发明Mullis教授开汽车时的联想逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋1988年发明了PCR技术
1993年获得诺贝尔奖行驶的汽车——一小段DNA引物Mullis的第一个PCR实验Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。 Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37 ℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链,每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应,依次循环。1983年12月,他终于看到了被同位素标记的PCR条带。PCR的发展史PCR的发展史1983年春,Mullis发展出PCR的概念;
1983年9月,Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验,只用一个循环;
1983年12月,用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断;
1985年12月20日,Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文,方法中用了PCR技术,导致Mullis的文章到处被拒;
1985年10月25日申请了PCR的专利,1987年7月28日批准(专利号4,683,202 ),这回Mullis是第一发明人。
1986年5月,Mullis在冷泉港
做专
报告,全世界从此开始学习PCR的方法;
1986年6月,Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶,Taq DNA polymerase,这是85年春天Mullis建议做的;
1988年,第一台PCR仪问世;
1991年,Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。nullPCR不只是一个方法改进PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”,“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”;
到了1991,Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司,并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红;
Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖,PCR和DNA重组技术一样意义深远。null变性、退火、延伸三步曲变性:双链DNA解链成为单链DNA
退火:部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合
复制延伸:以目的基因为模板,合成互补的新DNA链null每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得——230(1.07×109)个基因片段nullPCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4 小时PCR的应用领域: 生物学领域几乎无处不用PCR的应用领域: 生物学领域几乎无处不用基因、DNA片段的克隆
人工基因构建
DNA序列测定
基因定点突变
基因型(突变)检测,
SNP分析,遗传背景分析
生物物种鉴定,系统进化研究
基因表达量研究(real-time PCR) /基因表达谱研究( DNA chip, SAGE)耐高温DNA聚合酶的种类耐高温DNA聚合酶的种类Taq DNA聚合酶 (Thermus aquaticus,Cetus/Roche)
Tth DNA聚合酶 (Thermus thermophilus,Toyobo)
Pfu DNA聚合酶 (Pyrococcus furiosus,Stratagene) Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs)
Tfl DNA聚合酶 (Thermus flavus,Promega)
Tli DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis,Promega) Vent DNA聚合酶 (Bio-labs)
Pwo DNA聚合酶 ( Pyrococcus woesei,Roche)
Pfx DNA聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen)
Dynazyme DNA聚合酶(Thermus brockianus,Finnazyme)
FD DNA聚合酶 (Thermus sterophilus?,复旦大学)
Tma, Tne, KOD, ……9. DNA测序9. DNA测序确定一条染色体片断上的碱基顺序。
Sanger法:
在PCR时加入荧光标记的复制终止剂,比如ddA, ddT, ddC, ddG(相应于4种碱基)
ddX的两个作用:
可以当作正常碱基参与复制
一旦链入DNA中,其后就不能再继续连接
电泳
谁终止,碱基就是谁
此方法获1974年的Nobel奖Sanger第一步:加入复制终止剂Sanger第一步:加入复制终止剂荧光检测探头电泳,看谁跑得快Sanger第二步:荧光检测Sanger第二步:荧光检测全自动的测序仪器:MegaBace全自动的测序仪器:MegaBacenull已完成测序工作的生物面包酵母线虫果蝇拟南芥2002年中国科学家公布水稻基因组2002年中国科学家公布水稻基因组A Draft Sequence Assembly of the Rice Genome Science 2002 April 5; 296(5565): p. 79-92Refer Science Online:
http://intl.sciencemag.org/cgi/content/abstract/296/5565/792000年6月白宫的庆典人类基因组测序完成2000年6月白宫的庆典人类基因组测序完成VenterCollins