发酵工程课后题参考答案

发酵课后题参考答案 第一章 一.发酵工程技术的发展大致可分为那几个阶段？每个阶段的技术特点是什么？ 答：发酵工程技术大致可分为六个发展阶段分别为： 1.自然发酵阶段，在这一阶段人们对微生物的性质尚未认知，只是利用自然接种方法进行发酵制品的生产。此阶段的技术特点是多数产品属嫌气发酵，且非纯种培养，凭经验传授技术和产品的质量不稳定的特点。 2.转折阶段，这一阶段又可分为三个阶段。第一个阶段以纯种培养和无菌操作技术为转折点，这一阶段的技术特点发酵过程避免了杂菌污染，发酵效率逐步提高，生产规模逐渐扩大，产品质量稳定提高。第二个转折点是深层液体通气搅拌纯种培养的采用，这一阶段的技术特点是深层液体通气搅拌纯种培养技术解决了大量培养基和生产设备的灭菌以及大量无菌扛起的制备问题，，且在提取精制中采用离心萃取机，冷冻干燥器等新型高效化工设备，是生产规模，产品质量和收效稳步提高。第三个转折点是利用代谢调控进行微生物菌种选育和发酵条件的控制，技术特点是采用遗传育种方法进行微生物人工右边，选育出某种营养缺陷株或者抗代谢类似物菌株，在控制营养条件的情况下发酵生产大量积累所预期的氨基酸。 3.发酵放大技术的进一步发展阶段，技术特点是发酵罐的容积发展到前所未有的规模，发酵时氧耗大，对发酵设备提出了新的要求，并逐步运用计算机以及自动化控制技术进行灭菌和发酵过程的PH，溶解氧等发酵参数的控制，使发酵生产向连续化，自动化前进了一大步。 4.以基因工程为中心的时代。技术特点是定向的改变生物性状与功能，创造新物种的目的，赋予微生物细胞具有生产较高等生物细胞所产生的和化合物的能里。扩大了微生物的范围，大大丰富了发酵产业的内容，使发酵工业发生了革命性的变化。 二.简述工业发酵的应用范围？ 答：发酵工业的应用范围很广，按其产品可以分为四大类：1 1.微生物菌体。工业生产的微生物菌体可分为两种，一种是供制面包用的酵母，另一种是作为人类或者动物使用的微生物细胞。 2.酶制剂。微生物酶制剂可以用发酵技术来大量生产，而且提高微生物的生产能力很方便，具有动物或植物无法比拟的优点。现今酶制剂广泛用于医药，食品加工，活性饲料，纤维脱浆等许多行业。 3.代谢产物。微生物利用外界的营养无知，通过包括分解代谢和合成代谢在内的两种紧密相关的物质代谢过程，生产许多重要的代谢产物，包括初级代谢产物和刺激代谢产物。 4.生物转化。生物转化是指利用微生物细胞或者酶对化合物的某一部位进行催化修饰，使其变成结构像是淡具有更大经济价值的化合物。生物转化反应通常包括脱氢，氧化，酰化等作用。 三.简述液体发酵生产的一般工艺流程。 答：液体发酵的工艺流程可以划分为一下六个基本工程： 1.用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制。 2.培养基，发酵罐及其附属设备的灭菌。 3.扩大培养有活性的适量纯种，以一定的比例将菌种介入发酵罐中。 4.控制合适的发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物。 5.将产物提取并精制，以得到合格的产品。 6.回收或处理发酵过程中形成的三毁无知。 四.结合科学发展和国家的需要，讨论发酵工业的发展前景、 答：发酵工程未来的发展趋势主要有以下几大方面: 1.基因工程的发展为发酵工程带来了新的活力。主要是以基因工程为龙头，对传统发酵工业进行改造，提高发酵单位，建立新型的发酵产业。 2.新型发酵设备的研制为发酵工程提供先进的工具。新型发酵设备主要是指发酵罐，也可以称为生物反应器。 3.大型化，连续化，自动化控制技术的应用为发酵工程的发展提供了新空间。这些技术的应用，大大提高了发酵的效率和质量，降低了能耗和成本，开拓了发酵原料的来源和用途，提高了设备的利用率。 4.强调代谢机理与调控的研究，使微生物的发酵技能得到进一步的开发。 5.生态型发酵工业的兴起开拓了发酵的新领域。 6.再生资源的利用给人们带来了希望。对各种废弃物的处理和转化，变害为宝，实现无害化，资源化和产业化具有重大的意义。 五.简述发酵工程与生物技术和生物工程其它学科的区别和联系。 答：现代身无技术作为生命科学的核心备受重视，它可以解决可持续发展中的粮食，能源，资源，环境等各方面的问题。通常身无技术可分为基因工程，细胞工程，发酵工程，酶工程，升华工程等五个方面，它们紧密相连，不可分割。发酵工程和生化工程通常合称为中下游生物技术，是现代生物技术实验成果产业化的关键技术，发酵工程更具有连接生物技术上下游的纽带作用，学科地位显而易见。 第四章 一.试述消毒和灭菌的区别。 答：消毒是用物理或化学的方法杀死无聊和设备中所有生命无知的过程。 灭菌是用无力或化学的方法杀死空气，地以及容器和器具表面的微生物。 消毒和灭菌的区别一方面在于消毒仅仅杀死生物体或非生物体表面的微生物，而灭菌是杀死所有的生命体。另一方面在于消毒一般只能杀死营养细胞，而不能杀死细菌芽胞和真菌孢子等，适合于发酵车间的环境和发酵设备，器具的无菌处理。 二.染菌对发酵有什么危害，对产物有什么危害？试从污染杂菌的种类分析发酵污染的原因，染菌以后应采取那些措施？ 答：染菌对发酵及发酵产物的危害如下： 1.由于杂菌污染，使发酵培养基因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。 2.杂菌合成了一些新的代谢产物，或杂菌污染后改变了培养基的理化性质，使 发酵产物的提取和分离变得困难，再成产物收率或产品质量的下降。 3.杂菌代谢会改变元反应体系的PH，使发酵发生一场的变化。 4.杂菌分解产物，是生产失败。 5.细菌发生噬菌体污染，卫生物细胞被破裂，导致整个发酵的失败。 三.如何避免菌种在移接过程中染菌？ 答：为了避免军中在移接过程中的染菌，首先要严格无菌室，严格控制无菌室的洁净程度，根据生产工艺的要求，建立合理的无菌室，并交替使用各种灭菌手段对无菌室进行灭菌。另外将种子的转移，接种等操作放在超净工作台上进行，严格按照无菌操作要求接种。 四.简述染菌的检验方法及染菌类型的判断。 答：生产上要求准确，迅速的方法来检查出污染杂菌的类型及其可能的染菌途径，目前有一下几种常用的方法。 1.显微镜检查法。通常用简单的染色法或革兰氏染色法，将菌体染色后镜检。对于霉菌，酵母发酵，先用低倍镜观察生产菌的特征，然后用高倍镜观察有无杂菌的存在。根据生产菌与杂菌的不同特征来判断是否杂菌，必要时还可用芽胞染色或鞭毛染色。 2.平板划线培养检查法。先将待检样品爱无菌平板上划线，根据可能的染菌类型分别置于37或27摄氏度下培养，8个小时后可观察到是否有杂菌污染。对于噬菌体检查，可采用双层平板培养法。 3.肉汤培养检查法。将待检样品介入无菌的肉汤培养基中，分别置于37或27摄氏度下进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样镜检，判读是否有杂菌污染及杂菌的类型。 4.发酵过程的异常现象观察法。发酵过程出现的异常现象如溶解氧，PH，尾气中二氧化碳含量，发酵液的粘度等的异常变化，都可能产生染菌的重要信息，也根据这些异常现象来分析发酵是否染菌。 五.简述影响培养基灭菌效果和灭菌时间的因素有那些？ 答：影响培养基灭菌效果和灭菌时间的因素有很多，主要有以下几种因素：污染杂菌的种类，数量，灭菌的温度，压力和时间，培养基的成分，PH，物理状态，泡沫以及微生物德尔热阻等。 六.感染了噬菌体后应采取哪些措施？ 答：在细菌或放线菌发酵过程中，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，发酵体系容易受噬菌体的污染。噬菌体易在空气中传播，因此环境污染是噬菌体染菌的主要根源。目前最有效的防止噬菌体感染的方法是以净化环为中心的综合防治法，主要有净化生产环境，消灭污染源，提高空气的净化度，保证纯种培养，轮换使用同类型的菌种，使用抗噬菌体的军中，改进设备装置消灭死角，遵从操作等措施。若在培养前期染菌，重新灭菌然后重新接种：若培养中后期染菌，则要倒掉培养基，重新配制。 七.为提高空气过滤除菌效率可采取哪些有效措施？ 答：提高空气过滤除菌效率生产上进场采用以下一些措施： 1.正确选择采气口，提高采气口的位置或安装前置粗过滤器，提高空压机进口空气的洁净度等。 2.根据发酵工厂地理气候条件，设计合理的空气预处理流程，尽可能的减少过滤空气的含油量和湿度，适当的提高空气的温度，降低空气的相当湿度，保持过滤的干燥状态。此外，防止空气过滤器的渗漏，勿使冷却水进入空气处理系统。 3.设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效，选择除菌效率高的过滤介质。 (苏磊) 第二章 1 发酵工业用菌种应具备哪些特点？ ①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；②生长较快，发酵周期短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何的生物活性物质和毒素。 2.什么是选择性培养基？它在菌种筛选中有何应用价值？试举例说明选择性培养基的筛选原理。 选择性培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长，提高所需微生物的分离效率。 一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，也可以称为富集培养基。例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基；利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基；缺乏氮源的选择培养基等。 另一种类型选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。例如，在培养基中加入数滴10％酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从而从混杂的微生物群体中分离出放线菌；在培养基中加入亚硫酸铋，可以抑制革兰氏阳性细菌和绝大多数革兰氏阴性细菌的生长，而革兰氏阴性的伤寒沙门氏菌可以在这种培养基上生长；在培养基中加入染料亮绿或结晶紫，可以抑制革兰氏阳性细菌的生长，从而达到分离革兰氏阴性细菌的目的。 现代基因克隆技术中也常用选择培养基，在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中，利用质粒上具有的对某种（些）抗生素的抗性选择标记，在培养基中加入相应抗生素，就能比较方便地淘汰非重组菌株，以减少筛选目标菌株的工作量。 3. 以氨基酸代谢为例，说明为什么有些突变菌株对末端代谢产物的结构类似物具有抗性？ 答：正常情况下，代谢末端产物氨基酸A是菌体蛋白的必需组成成分，它能反馈阻遏或抑制合成它的有关酶。它的结构类似物A’在空间结构上与之相似，也能象A一样与原阻遏物或调节酶的调节亚基结合，从而发生阻遏或抑制作用。但A’不能正常参与蛋白质的合成，或只能合成无活性的蛋白质。当结构类似物A’达到一定浓度后，一方面A’能起反馈控制作用，阻止A的正常合成，另一方面A’又无法代替A参与正常蛋白质的合成，从而造成正常的细胞因缺乏A而饥饿死亡。 但如果突变株解除了反馈控制，即末端产物氨基酸A无法与原阻遏物或调节亚基结合，那么A’也就无法起反馈调节作用，A’的毒害作用就表现不出来。我们说该菌株对A’有抗性而得以生存下来。根据以上原理，只要选取结构类似物抗性突变株，就有可能得到解除了反馈调节的突变株。 结构类似物抗性菌株不一定都是解除反馈调节的菌株。 4.防止菌种退化的方法有：减少传代，创造良好的培养条件，用单细胞移植传代及科学保藏等措施 5．简述自然界分离微生物的一般步骤 自然界分离微生物主要是从土壤中采集 具体步骤如下： 1. 含微生物的样品的采集 采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度 对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种 2) 样品的预处理 目的：提高分离效率 方法： 物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法 3)分离方法的选择 根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法: 菌种的营养特征独特 生长特征独特 无选择性特征: 根据产物的特征进行随机分离 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。 6.菌种选育分子改造的目的是什么，具体方法有哪些？ 来源于自然界中的微生物菌种，在长期进化过程中形成了一整套紧密的代谢机制，微生物细胞内具有反馈抑制阻遏代谢等代谢调控系统，不会过量生产超过其自身生长.代谢需要的酶或代谢产物。所以，从自然界分离得到的野生菌株，不论在产量或质量上，都很难适合工业话生产的要求，因此需要进行菌种改良。改良目的主要有以下四点： 1）。提高目标产物的产量。2）。提高目标产物的纯度，减少副产物。3 ).改良菌种性状，改善发酵过程，4 ）改变生物合成途径，以获得高产的新产品。 改良方法： 1 ）代谢水平调节：是只对生物的初级和次级代谢的酶合成和酶活性的调节。 2 ）常规育种，包括诱变和筛选。 3 ）细胞工程育种。杂交育种和原生质体融和育种。 4 ）基因工程育种。 5 ）蛋白质工程育种 6 ）代谢工程育种 7. 自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程，叫做自然选育 自然选育的主要作用是对菌种纯化以获得遗传背景较为均一的细胞群体。一般菌种经过多次传代或长期保藏后，由于自然突变或异核体和多倍体的分离，使有些细胞的遗传性状发生改变，造成菌种不纯，严重者生产能力下降，称为菌种退化。因此在工业生产和发酵研究中要经常进行菌种纯化。微生物的自然突变率很低，因此通过自然选育来获得优良菌株的效果远不如诱变育种。 8.如何实现使微生物合成比自身需求多得多的产物？试举例说明。 育种工作者的任务是设法在不损及微生物的基本活动的前提下，采用物理、化学或生物学以及各种工程学方法，改变微生物的遗传结构，打破其原有的代谢控制机制，使之成为“浪费型”菌种。同时，按照人们的需要和设计安排，进行目的产物的过量生产，最终实现产业化的目的。 分为以下育种方法：常规育种，细胞工程育种，基于代谢调节的育种技术，基因工程育种，蛋白质工程育种，代谢工程育种，组成生物合成育种，反向生物工程育种。 常规育种包括诱变和筛选，其理论基础是基因突变，新的诱变技术如：低能离子束诱变，激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变，原生质体诱变等。细胞工程包括杂交育种和原生质体融合育种。代谢工程育种是通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢产物的生产或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累的方向进行。基因工程能创造新的物种，能赋予微生物新的机能，使微生物生产出自身本来不能合成的新物质，或者增强它原有的合成能力。蛋白质工程主要是寻找新的物种，再从中分离筛选新的蛋白，或通过对天然功能蛋白进行改造。 9. 设计一个从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的实验，说出主要步骤及基本原理。   答：欲从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌，最好在温度较高的南方，或温泉，火山爆发及北方堆肥中采集样品。将采集来的样品经过预处理（如高温加热），减少杂菌量，然后进行富集培养，富集培养以淀粉为唯一碳源，这样形成的优势菌种即为以为能产生淀粉酶的一类菌株，然后采用平板筛选，通过初筛与复筛，最终获得性能优越的高温淀粉酶产生菌。 10. 如果纤维素酶的合成受反馈阻遏作用的调控，如何根据这一调控机制设计纤维素酶高产菌的选育方案？ 答：将菌种经过紫外线照射或其他方式诱变后接种在纤维素基质培养基上，在筛选纤维素酶活高产菌时可通过刚果红染色透明圈法筛选、进行发酵产物酶活性 11.菌种保藏主要利用哪些原理，试举例说明。 菌种保藏的基本原理主要是根据微生物的生理、生化特点，人工地创造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。 斜面低温保藏法的原理是低温；矿油封藏法（液体石蜡保藏法）的原理是低温、缺氧、缺营养；冷冻真空干燥法的原理是低温、干燥、缺氧；液氮超低温保藏法的原理是在超低温（低于-130℃）状态下，所有的代谢活动暂时停止而生命延续，并且不会发生变异。 第四章 发酵工业的无菌技术 1、 答：灭菌指用物理或化学方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程；消毒指用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物；消毒和灭菌的区别在于：消毒仅仅是杀灭生物体或非生物体表面的微生物，而灭菌是杀灭所有的生命体。 2、 答：染菌对发酵的危害：a、消耗营养；b、杂菌合成新产物，改变发酵液的某些物化性质，造成产物分离困难；c、改变pH；d、分解产物；e、噬菌体破坏极大，使微生物细胞裂解，导致整个发酵失败。 若污染耐热芽孢杆菌，则染菌原因通常为灭菌不彻底；若污染球菌、无芽孢杆菌，则种子带菌、无菌空气带菌、设备渗漏和操作失误都有可能；若污染浅绿色菌落的杂菌，则与水有关，通常为冷却盘管渗漏的原因。 染菌以后采取的措施：种子扩大时期染菌，灭菌后弃去；发酵前期染菌，应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种；发酵中期染菌，挽救困难，应早发现，快处理，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定；发酵后期污染，若染菌量不多，可继续发酵，若污染严重，则提前放罐。 3、 答：a、严格无菌室，严格控制无菌室的洁净程度；b、交替使用各种灭菌手段对无菌室进行经常性的洁净处理；c、将种子的转移、接种等操作放在洁净工作台上进行，严格按照无菌操作要求接种。 4、 答：染菌检验方法与判断：a、显微镜检查；b、平板划线培养或斜面培养检查法，噬菌体检查可采用双面平板法：噬菌斑；c、肉汤培养检查法；d、发酵过程的异常现象观察。 5、 因素有：a、培养基成分；b、培养基pH；c、培养基的物理状态；d、泡沫；e、培养基中的微生物量。 6、 答：如果污染了噬菌体，通常采用甲醛、双氧水或高锰酸钾等灭菌剂处理。（不是很有把握） 7、 答：可采用措施有：a、提高空气吸气口的位置；b、在空气吸入口处设置粗过滤器，以滤去空气中颗粒较大的尘埃。 8、 解：t = 2.303 / k *lg(105*30*106/0.001)=3.24 min 由于连消塔不能保证先进先出，所以培养液至少需维持8min。 故维持体积为：V= 6 / 60 *8 *0.9=0.89 m3 (0.9为充满系数) 9、 解：由 得： 查表得26℃，所以至少应冷却至 26℃。 （曹雄文） 第三章 史达 生物技术0502班 1、什么是培养基？简述发酵培养基的特点和要求。 培养基是指用于维持微生物生长繁殖和产物形成的营养物质。 发酵培养基的特点和要求： eq \o\ac(○,1)单位培养基既能够产生最大量的目的产物； eq \o\ac(○,2)能够使目的产物的合成速率最大； eq \o\ac(○,3)能够使副产物合成的量尽可能少； eq \o\ac(○,4)所采用的培养基应该质量稳定、价格低廉、易于长期获得； eq \o\ac(○,5)所采用的培养基尽量不影响工业好气发酵中的通气搅拌性能以及发酵产物的后处理等。 2、什么是生长因子？ 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘧啶、嘌呤、维生素等均为生长因子。生长因子不是对于所有微生物都必须的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。 3、简述培养基设计的一般步骤和应注意的问题。 培养基设计和优化过程一般步骤： eq \o\ac(○,1)根据以前的经验以及在培养基成分确定前必须考虑的一些问题，初步确定可能的培养基组分； eq \o\ac(○,2)通过单因子优化试验确定最为适宜的各个培养基组分及其最适浓度； eq \o\ac(○,3)最后通过多因子实验，进一步优化培养基的各种成分及其最适浓度。 应注意的问题： 必须根据具体情况抓住主要环节，使其既能满足微生物的生长要求，又能获得优质高产的产品，同时也要符合增产节约、因地制宜的原则。 4、工业发酵常用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？ 工业发酵中，常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳酸等。其中，糖类是发酵培养基中应用最广泛的碳源，主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉。 葡萄糖是最容易利用的碳源之一，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖。葡萄糖是加速微生物生长的一种速效碳源，但过多的葡萄糖会抑制微生物的生长和产物的合成(加速呼吸、降低溶解氧、积累中间产物、降低ph、影响酶的活性)。 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，是制糖工业的副产物。其中含有丰富的糖、氮类化合物、无机盐和维生素等，是价廉物美的碳源。 淀粉等多糖作为碳源，可克服葡萄糖效应对次生代谢产物合成的影响，价格也比较低廉。 5、常用的无机氮源和有机氮源有哪些？简述各类氮源在发酵培养基中的作用。 常用的有机氮源有黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉和酒糟等；常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。 氮源主要用于构成菌体细胞物质和合成含氮代谢物。 有机氮源含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，故其营养丰富；有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，大多数发酵工业利用有机氮源来获得所需的氨基酸；此外，某些有机氮源还是产物的前体。 无机氮源也称为速效氮源，微生物对他们的吸收利用一般较快；此外，其作为生理酸、碱性物质，可以稳定和调节发酵过程的PH。 6、什么是理论转化率和实际转化率？ 理论转化率：理论状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，得出原材料的转化率大小。 实际转化率：发酵实验中所得原材料的转化率大小。 由于实际发酵过程中，一般有副产物形成、原材料利用不完全等因素存在，实际转化率往往要小于理论转化率。 7、举例说明培养基设计的方法和步骤？ 首先，做好调查研究工作，了解菌种的来源、生长规律、生理生化特征和一般的营养要求。其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构，一般提炼方法和产品质量要求也需要有所了解，以便在选择培养基时心中有数。最好先以一种较好的化学合成培养基为基础，先做一些摇床试验，然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要营养物质，如碳源和氮源的利用情况和生产代谢产物的能力。注意培养过程中的PH变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同的PH，不断调整配比来适应上述情况和要求。有了初步结果后，先确定培养基配比，再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最佳范围和最佳用量。在合成培养基上得出一定结果后，在做复合培养基实验；最后通过实验确定各种发酵条件和培养基的关系。 8、简述培养基优化在发酵优化控制中的作用。 一个好的发酵培养基是一个发酵产品能否成功实现产业化和商业化的关键一环。 第五章 韩玉玲 生物技术0502班 1．简述种子扩大培养的目的与要求及一般步骤。 目的：为每次工业规模的发酵生产提供相当数量的代谢旺盛的种子。 要求： ①菌种细胞的生活力强，转种之发酵罐后能迅速生长，延迟期短 ②菌种生理壮大稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和种子培养液的特性等符合要求。 ③菌种浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 ④无杂菌污染，保证纯种发酵。 ⑤菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。 一般步骤;： ①将沙土管或冷冻干燥管中的种子接种到斜面培养基中进行活化培养。 ②将生长良好的斜面孢子或菌丝转种到扁瓶固体培养基或摇瓶液体培养基中扩大培养，完成实验室种子制备。 ③将扩大的孢子或菌丝体接种到一级种子罐，制备生产用种子。如有需要，可将一级种子再转种到二级种子罐进行扩大培养，完成生产车间种子制备。 ④制备好的种子转种到发酵罐进行发酵。 2．在大规模发酵的种子制备过程中，实验室阶段和生产车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点？ 实验室种子制备包括孢子制备和摇瓶液体种子制备。对于产孢子类微生物一般采用平板或斜面培养基制备种子，以孢子作为培养物；对于产孢子弱或者孢子发芽慢的菌种一般采用摇瓶液体制备种子，而以菌丝作为培养物；对于不产孢子的种类，生产上一斜面营养细胞保藏法保藏，使用时在一定温度下活化后接入三角瓶液体培养基中，培养一段时间即可作为种子。制备放线菌类孢子，培养基的原料一般采用琼脂和其他一些适合产孢子的营养成分，其中的碳源和氮源不要太丰富。因为碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境，不利于放线菌孢子的形成；而氮源丰富有利于菌丝繁殖而不利于孢子的形成。碳氮比例大一些为好，这样避免菌丝的大量形成，有利于产生大量孢子。一般情况下，干燥和限制营养可宣接或间接诱导孢子的形成。制备细菌类袍子，斜面培养基多采用碳源限量而氯源丰富的配方。 生产车间阶段中子制备在种子罐里进行。培养基采用容易被生产菌利用的营养成分如葡萄糖、玉米浆、无机盐等，且尽量接近发酵罐中的成分。培养物一般为菌丝体。 3．细菌、放线菌及霉菌常用的接种量分别是多少？ 接种量主要根据发酵产物类型确定，一般来说，大多数抗生素发酵的最适接种量为7%—15%，有时可以增加到20%—25%。氨基酸、有机酸、溶剂发酵接种量一般为1%-5%。 4．什么是发酵级数？发酵级数对发酵有何影响？ 影响发酵级数的因素有哪些？ 什么情况下采用一级种子发酵？ 发酵级数即种子扩大的级数，是指被种子需要扩大培养的次数。 发酵级数不够则种子量达不到工业发酵所需接种量的要求，太大又不利于简化生产工艺和生产控制，并且会增加染菌机会和种子罐生长异常而造成发酵波动。 影响发酵级数的因素有菌种生长特性、孢子发芽和生长速度及所采用的发酵罐容积等。 对于生长快的菌种比如谷氨酸棒状杆菌。 5．影响种子的质量的因素有哪些？ 可采取什么措施保证种子的质量？ 影响因素：原材料质量、培养温度、湿度、通气和搅拌、斜面冷藏时间、培养基与pH等。 控制措施：定期进行菌种稳定性检查、提供种子培养的适宜环境（温度、培养基、通气量等）、每一步移种均进行无杂菌侵入检查。 6．在实验室种子的制备过程中，对于产孢子能力强的菌种应采取什么方式？对产孢子弱或孢子发芽慢的菌种有应采取何种方式？ 对产孢子能力强的菌种，采取固体培养基培养孢子孢子可作为种子罐的种子；对产孢子弱或孢子发芽慢的菌种，可以采用摇瓶液体培养法，将孢子接入含液体种子培养基的摇瓶中恒温震荡培养，获得的菌丝可作为种子 第六章 ： 罗丹菊 生物技术0502班 1、微生物的发酵通常分为哪几个阶段？ 次级代谢产物通常在什么阶段开始合成？ 微生物的发酵通常分为延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期（静止期）和衰亡期五个时期。次级代谢产物通常在稳定期开始合成。 2、 根据无抑制细胞生长动力学（Monod方程），试述 与Cs（基质浓度）之间的关系。 限制性底物的减少使微生物的生长速率减小，这里的Monod方程可以表示成： 其中，KS是底物亲和常数，表示的是微生物对该底物的亲和力。在分批培养的中后期，由于底物浓度的下降成为微生物生长的限制性因素，培养中前期比生长速率一直保持在很高的水平，直到底物浓度下降到KS水平， 迅速下降，最后跌倒零。（P89图6-4） 3、 获得所培养细胞的生物量，可以采用什么方法进行测定，试举2~3例进行说明。 微生物生物量的测定有计数、重量和生理指标等方法。计数法中有间接计数法和直接计数法。直接计数法例如细菌计数板和血球计数板；间接技术是通过一系列的稀释平板获得平均菌落数来进计算的。重量法是通过测量微生物的干重或者是湿重来得到微生物的生物量的。生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等，因此我们可以利用特定的仪器例如瓦氏呼吸仪、微热量热计等设备来测定相应得指标，根据微生物在生长过程中伴随出现的这些指标测定微生物数量。 4、影响分批发酵过程中总产率的因素有哪一些？ 简述生产上提高发酵产率的有效方法。 发酵过程中的通气状况，PH控制情况，发酵液的性质，菌种自身的影响。 了解不同产物合成的动力学关系与微生物细胞生长动力学关系类型可以帮助我们采用不同的工艺来提高所需产物的产率：如果产物是微生物细胞本身，可以采用能支持最高生长量的培养条件；如果产物是初级代谢产物，可以设法延长与产物关联的对数生长期；如果产物是次级代谢物，可以缩短对数生长期，延长稳定期，或者降低对数期的生长速率；或采用二阶段培养（也称二步法培养，即第一阶段主要积累生物量，第二阶段合成次级代谢产物）,从而使次级代谢物大量积累。 5、 发酵操作方式可以分为分批、补料分批和连续发酵三种，试述三种培养方式的优缺点。 分批发酵的优点：①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化的问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高一些。 缺点：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长跪履，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经过菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的克数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且还包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。 连续发酵的优点：①在连续发酵达到稳态之后，其非生产时间要少许多，故其设备的利用率高、操作简单、产品质量较稳定；②对发酵设备以外的外围设备（如蒸汽锅炉、泵等）的利用率高，可以及时排除在发酵过程中产生的对发酵过程有害的物质。 缺点：①污染杂菌的问题，在连续发酵的过程中需要不断的向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这大大增加了污染杂菌的可能性；②生产菌种的突变问题，微生物细胞的遗传物质DNA在复制的过程中出错的概率为百万分之一，但是，一旦连续培养系统的生产菌出现某一个细胞的突变，且突变的结果使得这一细胞获得高生长能力，那么它最终会取代系统中原来的生产菌株，使连续发酵过程失败。 补料分批发酵的优点：①通过控制底物初始浓度水平来消除高浓度底物对生长代谢的抑制作用或由于可被快速利用的碳源所引起的分解阻遏作用，并且能够使发酵对于溶解氧的需求保持在发酵罐通气能力范围之内；②避免某些培养基组分高浓度下对微生物的生长及代谢的抑制甚至毒副作用，可以延长发酵生产时间，特别是代谢产物的积累时间，提高发酵产量。 缺点：相对于分批发酵来说，污染杂菌的可能性要大一些。 6、 什么是菌体的比生长速率、产物比生成速率以及基质的比消耗速率？ 比生长速率是菌体的生长速率与菌体的浓度的比值，而产物的比生成速率则是产物生成速率和所形成的产物的浓度的比值，基质的比消耗速率是基质的消耗速率跟基质的浓度的比值。 7、 什么是Monod方程？其使用条件是什么？请说明各个参数的意义。 Monod方程是 ，它的使用条件是：当培养物中只有一种限制性基质而不存在其他生长因素的限制时。其中， 是微生物的比生长速率， max是最大比生长速率， KS是底物亲和常数，表示的是微生物对该底物的亲和力，其数值相当于 处于 max的一半时的底物浓度， CS是限制性底物的浓度。 8、 什么是初级代谢产物？什么是次级代谢产物？ 初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。 次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质，这一过程的产物，即为次级代谢产物。它们大多是分子结构比较复杂的化合物.根据其作用,可将其分为抗生素,激素,生物碱,毒素及维生素等类型。 9、 什么是连续培养？什么是连续培养的稀释率？ 连续培养是在培养的过程中在添加培养基的同时，从容器中放出等体积的发酵液，从而形成的一个连续生产的过程，即在发酵罐中所形成的新细胞数量与从发酵罐中流出的细胞数量相等。它又可以分为单级连续发酵和多级连续发酵。 将单位时间内连续流入发酵罐中的新鲜培养基体积与发酵罐内的培养液的总体积的比值称为稀释率。 10、恒化培养与恒浊培养各自有哪些特点？ 连续培养系统被称为恒化器；通过控制补充的培养基的流速，使得发酵罐内发酵液中细胞浓度保持恒定，即将发酵液的浊度保持在某一窄小的范围内的发酵系统称为恒浊器。 现在广泛使用的是恒化器，因为它又明显优于恒浊器的地方，即保持稳态时不需要控制系统，但是在连续发酵时，采用恒浊器独特的优点是在发酵的早期避免细胞被完全洗出。 生物技术053班 聂斯做第七章1.2.和第八章第6题 田根根做第七章3.4题 尹江安做第七章567题 黄佳彬做第8.9.10题和第八章第8题 肖林做第七章11题和第八章1.2.7题 郑亮做3.4.5题 谢家钊做9.10.11.12题 陈旭峰做13.14.15.16题 1微生物生长中呼吸强度和摄氧率变化的一般规律及其影响因素各有哪些？ 答：在培养初期，呼吸强度Qo2逐渐增高，此时菌体浓度很低。在对数生长期初期呼吸强度达到最大值，即，但此时菌体浓度还较低，摄氧率并不高。随着细胞浓度的迅速增高，培养液的摄氧率也迅速增高，在对数生长期的后期达到最大值，此时呼吸强度低于最大值，菌体浓度也低于最大值。在对数生长期末，由于培养基中营养物质的消耗以及培养装置氧传递能力的限制，呼吸强度下降，虽然这时细胞浓度仍有增加甚至达到最大值，但是细胞活力已经下降，导致培养液的摄氧率下降。培养后期，因基质耗尽，细胞自溶，呼吸强度进一步下降，摄氧率也随着迅速下降，以上是呼吸强度和摄氧率变化的一般规律。 影响因素：微生物本身遗传特征的影响；培养基的成分和浓度；菌龄：一般幼龄菌生长旺盛，呼吸强度大，老菌生长慢，呼吸强度小；发酵条件；代谢类型。 2影响氧传递的因素有哪些？氧在传递过程中的传质阻力有哪些？ 在氧的传递过程中，主要阻力在于气液间的传递过程。根据气液传递速率方程OTR＝KLa(C*-CL) 凡影响推动力C*-CL、比表面积a、和传递系数KL的因素都会影响氧传递速率，从而影响到供氧。 (1) 影响推动力的因素 温度，推动力随着发酵液温度的升高而下降。 溶质 a.电解质 在溶液中，由于发生盐析作用使氧的饱和溶解度降低，推动力随着发酵液中电解质浓度的增加而下降。 b.非电解质 氧的溶解度一般随着溶质浓度的增加而下降 c.混合溶液 溶剂：发酵过程中，通常使用的溶剂为水。由于氧在一些有机物中的溶解度比水中高，因此实际发酵过程中也可以通过合理添加有机溶剂来降低水的极性从而增加溶解氧的浓度。 氧分压：增加氧分压也能 通过提高氧的溶解度来增加氧传递的推动力。方法之一是提高空气总压，即增加罐压，相应的氧溶解度也得到提高。方法之二是保持空气总压不变，提高氧分压，即改变空气中氧的组分浓度，如进行富氧通气，但此方法成本较高。 （2）影响KLa的因素 KLa与以下因素有关： 设备参数 发酵罐的形状结构、搅拌器、挡板、空气分布器等参数，通常以搅拌器直径d作为基本参数。 操作条件 通气表观线速度Ws、搅拌转速N、搅拌功率Pw、发酵体积V、液柱高度HL，通常以Ws，N作为基本参数。 发酵液性质 发酵液的密度 ，黏度，界面张力及扩散系数 (1) 操作条件的影响 搅拌的影响 通气的影响 （2）设备参数的影响 （3）发酵液性质的影响 表面活性剂 由于消泡用的油脂是具有亲水端和疏水端的表面活性物质，加入发酵液后分布在气液界面，会增大传递阻力，使KL下降。 离子强度 在同一气液接解反应器中，相同的操作条件下，电解质溶液的KLa比水大，而且随电解质浓度的增加，KLa也有较大的增加。 菌体浓度 菌体浓度的增加会使KLa变小 氧在传递过程中的传质阻力： 气膜传递阻力 气液界面的传递阻力 液膜传递阻力 液相传递阻力 细胞或细胞团表面的液膜阻力 固液界面传递阻力 细胞团内的传递阻力 细胞膜和细胞壁阻力 细胞内反应阻力 3.什么是临界饱和溶氧浓度，临界溶氧浓度以及氧饱和度？ Answer： 临界饱和溶氧浓度是指满足发酵微生物正常生长最大的溶解氧浓度，超过这一浓度则会影响微生物的正常生长。 临界溶氧浓度是指满足微生物呼吸的发酵液中最低溶氧浓度。在临界溶氧浓度以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降。 氧饱和度是之培养液中当前实际溶解的氧占其溶氧饱和状态下氧的比例。 4，影响微生物需氧的因素有哪些？如何调节摇瓶发酵的供氧水平？如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？ Answer: 影响微生物需氧的因素有很多，包括微生物本身的遗传特征，其所处的培养基的成分和浓度，菌龄的大小，发酵的条件包括温度PH以及发酵过程中的一些有害代谢物的积累，最后还与微生物的代谢类型相联系。 对于摇瓶发酵，要改变其供氧水平，主要是通过改变摇床的摇动频率来实现的。 对于通气搅拌发酵，可以通过以下一些方式改变其供氧水平，比如改变通入的空气中氧气的浓度，改变通气速率，实际生产中更多的采用的是改变搅拌的转速。 5.写出发酵液中的体积氧传递方程？指出其中KLa的物理意义。 答： 氧的传递速率OTR为 OTR=KLa(C*-CL) 式中 OTR——单位体积培养液的氧传递速率，kmol/（m3·h）； KLa——以浓度差为推动力的体积溶氧系数，h-1； C*——与气相中氧分压p到达平衡时氧的浓度，kmol/m3； CL——液相中和汽、液界面处氧的浓度，kmol/m3。 KLa的物理意义：体积溶氧系数或体积传质系数。 6.测定KLa的方法有哪些？可以采取哪些措施调节发酵液中的KLa？ 答：测定KLa的方法：亚硫酸盐氧化法、取样极谱法、物料衡算法、动态法、排气法、复膜电极法；通过改变设备参数、操作条件、发酵液性质均可调节发酵液中的KLa。 7.溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有哪些？ 答： A. 化学法 原理：在样品中加入硫酸锰和碱性KI溶液，生成氢氧化锰，与溶解氧反应生成锰酸锰，再在反应液中加入H2SO4, 释放出游离的碘，然后用标准Na2S2O3液滴定。 MnSO4+2NaOH→ Mn(OH)2十Na2SO4 2Mn(OH)2+O2→MnO(OH)2↓ MnO(OH)2+Mn(OH)2→MnMnO3+2H2O MnMnO3+3H2SO4+2KI→2MnSO4+I2+3H2O+H2SO4 I2+Na2S2O3→2NaI十Na2S4O6 当样品中存在氧化还原性物质，测定结果会有偏差；当样品带有颜色时，会影响测定终点的判断，故不适合测定发酵液的溶氧浓度。 B.极谱法 原理：给浸在待测液体中的贵金属阴极和参考电极（阳极）加上直流电压，当电解电压固定在0.8V左右时，与阴极接触的液体中的溶解氧发生如下氧化还原反应而被消耗， 酸性时 O2+2H++2e→ H2O2 中性或碱性时 O2＋2H2O +2e → H2O2＋2OH－ 阴极表面与液体的主体之间存在氧的浓度差，于是液体主体的溶解氧就会扩散到阴极的表面参加电极反应，使电路中维持一定的电流。当氧的扩散过程达到稳定状态时，扩散电流和溶解氧浓度成正比，即 i=KDLCL 阴极表面极易被污染，影响重现性，所以一般采用滴汞电板作为阴极，阳极则可用甘汞电极。如果样品中含有其他的氧化还原性物质会影响电极反应，从而影响到该法的准确性，使测定结果有误差。 C.溶氧电极法 溶氧电极类型：极谱型；原电池型 原理：复膜氧电极测得的实际为氧从液相主体到阴极的扩散速率。当扩散过程达到稳定状态时，单位面积氧的扩散速率为： no2=KL(PL-P1)=Km(P1-P2)=Ke(P2-Pc)=K(PL-Pc) 根据Faraday定律，原电池型氧电极的稳定电流为： i=4F· A· no2= 4F· A· K · (PL-Pc)=K’ ·PL ∴溶氧电极测定的实际是液体中的氧分压 8.氧从气相传递到液相的推动力是什么？并简述影响推动力的因素有哪些？ 答：氧从气相传递到液相的推动力是界面处氧的浓度与液体中氧浓度之差。影响推动力的因素有：（1）温度， 发酵液中的温度不同，氧的溶解度也不同，氧在水中的溶解度随温度的升高而降低，因此氧传递过程中的推动力将随发酵液温度的升高而下降。 （2）溶质， 在电解质溶液中，由于发生盐析作用使氧电饱和溶解度降低，故氧传递的推动力随着发酵液中电解质浓度的增加而下降。 （3）溶剂， 由于氧在一些有机物中的溶解度比水中高，因此实际发酵过程中也可以通过合理添加有机溶剂来降低水的极性从而增加溶解氧的浓度。 （4）氧分压， 增加氧分压也能通过提高氧的溶解度来增加氧传递的推动力。 9.什么是双膜理论 　　双膜理论是1923年由Lewis & Whitusan提出的。其基本论点是： 　　 1．认为气、液两相接触的自由界面附近，分别存在着作层流流动的气膜和液膜，即在气相侧的气膜和液相侧的掖膜，如图4-2所示。气体必须以分子扩散的方式从气相主体连续通过此两层膜而进入液相主体。由于此两层膜在任何情况下均呈层流，放又称为层流膜。两相流动情况的改变仅影响膜的厚度，即如气体的流速越大，气膜就越薄；同样，如液体的流 速越大，液膜也就越薄。