食品酶学课件第3章蛋白酶

第3章蛋白酶Proteinases第一页，共五十三页。COOHR1—CH—N—H+HO—C—CH—R2HONH2COOHR1—CH—N—C—CH—R2+H2OHONH23.1.1、蛋白酶的作用(zuòyòng)水解蛋白质或多肽(duōtài)中的酰胺键（肽键）。第二页，共五十三页。pH作用(zuòyòng)方式活性中心来源动物(dòngwù)、植物、微生物酸性、中性(zhōngxìng)、碱性蛋白酶（内切）、肽酶（外切）氨肽酶羧肽酶丝氨酸、巯基羧基、金属离子3.1.2、分类和特性[EC3.4.#.#]第三页，共五十三页。3.2蛋白酶的分类(fēnlèi)3.2.1丝氨酸蛋白酶3.2.2　半胱氨酸蛋白酶3.2.3　金属(jīnshǔ)蛋白酶3.2.4　天冬氨酸蛋白酶第四页，共五十三页。活性中心:丝氨酸(Ser)和组氨酸(His)包括-胰凝乳蛋白酶（chymosin）胰蛋白酶（trypsin）弹性蛋白酶（elastase）枯草芽孢(yábāo)杆菌蛋白酶（subtilisin）地衣芽孢杆菌蛋白酶（alcalase）必需基团：羟基、咪唑基、羧基不可逆抑制剂：二异丙基氟磷酸（DFP）3.2.1　丝氨酸蛋白酶第五页，共五十三页。活性中心氨基酸组成(zǔchénɡ)相似性第六页，共五十三页。酶原酶原激活(jīhuó)酶原激活的意义-胰凝乳(nínɡrǔ)蛋白酶（EC3.4.21.1）第七页，共五十三页。胰凝乳蛋白酶原的激活过程示意图由三个肽链组成，由双硫键将各部分结合在一起。胰凝乳蛋白酶原A由245个氨基酸残基（分子量约为25,000），分子中有五个双硫键，它没有酶的活性；在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用(zuòyòng)下，裂解生成了三个双硫键-胰凝乳蛋白酶。第八页，共五十三页。催化(cuīhuà)机制活性中心57位组氨酸、102位天冬氨酸、195位丝氨酸第九页，共五十三页。性质(xìngzhì)在近弱碱性条件下有较高的酶活性专一性较差，甚至可以(kěyǐ)水解酯键钙离子有激活作用重金属离子、胰蛋白酶抑制物等有抑制作用第十页，共五十三页。（2）胰蛋白酶(yídànbáiméi)（EC3.4.21.4）消化系统中重要的蛋白质消化酶在机体(jītǐ)内不仅可以自激活，还要激活其它的蛋白酶。胰蛋白酶原的激活过程，可以看出酶的立体构象对于酶活性的影响。第十一页，共五十三页。胰蛋白酶(yídànbáiméi)的激活过程示意图第十二页，共五十三页。第1个问(wèntí)酶原的激活具有(jùyǒu)什么生理意义？第十三页，共五十三页。性质(xìngzhì)具有较高的专一性水解时的最适pH为7~9，较高pH下自我催化分解。钙离子有保护(bǎohù)和激活作用大豆中的胰蛋白酶抑制物、生花生凝集素、蛋类中的卵糖蛋白等有抑制作用第十四页，共五十三页。3.2.2　巯基蛋白酶活性中心：半胱氨酸木瓜蛋白酶（papain）、无花果蛋白酶（ficin）、菠萝蛋白酶（bromelain）和剑麻蛋白酶（agavain）等植物酶链球菌蛋白酶（streptococcalproteinase）等微生物酶必需(bìxū)基团：巯基-SH抑制剂：氧化剂或烷基化试剂或重金属离子激活剂，还原剂如半胱氨酸、谷胱甘肽等和金属螯合剂如EDTA等第十五页，共五十三页。蛋白酶活性中心附近氨基酸残基的排列(páiliè)顺序第十六页，共五十三页。（1）木瓜(mùɡuā)蛋白酶（EC3.4.22.2）分子量23900道尔顿，一级结构和立体结构都清楚底物特异性较宽，作用于精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、瓜氨酸的羧基参与的肽键。在pH5下最稳定。底物不同，最适pH也会改变，酪蛋白最适pH为7，明胶则为5。最适温度65℃,在较高温度下仍然保持活性，例如在中性条件下70℃加热处理30min，对牛乳的凝结活性仅下降20%；商品化的木瓜蛋白酶中，木瓜蛋白酶一般只占可溶性蛋白质总量的10%，另外(lìnɡwài)的蛋白酶还有木瓜凝乳酶、溶菌酶以及木瓜肽酶等。在肉品嫩化、啤酒加工中应用第十七页，共五十三页。（2）无花果蛋白酶（EC3.4.22.3）分子量约为26,000道尔顿在pH3.5~9的范围内稳定，最适pH为6~8。最适pH不会随着底物的变化而发生明显的改变，例如对于酪蛋白它的最适pH在6.7和9.5，对于明胶的液化为pH7.5。热稳定性稍差，在80℃下溶液中无花果蛋白酶将完全失活。重金属离子对其有抑制作用。商品酶制剂中含有多种蛋白酶，用途(yòngtú)广泛第十八页，共五十三页。（3）菠萝(bōluó)蛋白酶（EC3.4.22.33）分子量约为33,000道尔顿，属于糖蛋白（含糖约2%）适宜pH为6~8适宜的反应温度为30℃~45℃因底物的种类及浓度(nóngdù)不同而有所改变其它(qítā)植物蛋白酶剑麻蛋白酶中华猕猴桃蛋白酶第十九页，共五十三页。3.2.3　金属(jīnshǔ)蛋白酶活性中心：金属离子(lízǐ)必需基团：Zn2+、Mn2+、Fe2+二价金属离子螯合剂（EDTA)螯合以后，抑制了它的活性。通过透析除去金属离子也可以失活。添加恢复活性第二十页，共五十三页。大多数金属蛋白酶是外切酶嗜热菌蛋白酶（EC3.4.24.4）、橡胶原酶和出血蛋白酶是金属内切酶羧肽酶羧肽酶A和羧肽酶B等一些需要Zn2+，脯氨酰氨基酸酶、亚氨基二肽酶等需要Mn2+。金属离子(lízǐ)置换化学修饰分子修饰氨肽酶第二十一页，共五十三页。3.2.4　天冬氨酸蛋白酶活性中心：Asp必需基团:羧基(suōjī)也被称为羧基酸性蛋白酶最适pH范围是2~4胃蛋白酶（pepsin）、凝乳蛋白酶（chymosin）微小毛霉、毛霉、利疫菌的蛋白酶等。第二十二页，共五十三页。（1）胃蛋白酶(wèidànbáiméi)（EC3.4.23.1）由胃粘膜细胞分泌出胃蛋白酶原，经过激活而得到的。不同动物源的胃蛋白酶的氨基酸组成有一点(yīdiǎn)差异，所有脊椎动物的胃液中均有胃蛋白酶。第二十三页，共五十三页。　胃蛋白酶原向胃蛋白酶的转化。　字母P标示肽键(tàijiàn)水解释放出几个肽片断（A）、胃蛋白酶抑制物（B）和胃蛋白酶（C）第二十四页，共五十三页。性质(xìngzhì)在pH为2~5的范围内稳定在以蛋白质为底物时，最适pH为2，超过此范围时胃蛋白酶容易失活，例如，在pH>6.2时或者70℃以上(yǐshàng)酶就开始失活最适温度37℃~40℃。在温度超过80℃时酶不可逆的失活。第二十五页，共五十三页。（2）凝乳酶（EC3.4.23.4）是雏牛皱胃(zhòuwèi)中蛋白酶的主要形式，以酶原的形式分泌出。凝乳酶在从无活性的酶原转化为有活性的酶的过程中，发生部分水解。　活性中心：两个天冬氨酸在pH5.5~6.5的范围内稳定，在pH低于2时还相当稳定，在pH3.5~4.5的范围内由于酶的自催化作用而很快被分解，在中性或碱性pH范围内，凝乳酶也很快失去活性。第二十六页，共五十三页。基因技术（克隆技术，克隆酶）：将小牛的凝乳酶基因克隆到微生物达系统，通过发酵的方法得到具有凝乳能力的重组凝乳酶，以此来满足干酪生产需要(xūyào)。蛋白质工程技术（定点突变，突变酶）：凝乳酶分子中的Tyr-77或Val-113用Phe替代后，其凝乳能力相对于原来的酶明显增强。第二十七页，共五十三页。第2个问题(wèntí)以蛋白酶为例如何考虑(kǎolǜ)酶制剂的来源如何考虑建立体外消化道模拟系统第二十八页，共五十三页。3.3　蛋白酶在食品工业(shípǐnɡōnɡyè)中的应用3.3.1、蛋白质水解物的生产(shēngchǎn)3.3.2、氨基酸的生产3.3.3、明胶的生产3.3.4、干酪的生产3.3.5、肉的嫩化3.3.6、在啤酒中的应用3.3.7、在茶饮料中的应用3.3.8、酶法生产脱腥速溶豆乳第二十九页，共五十三页。蛋白质蛋白(dànbái)胨、多肽、氨基酸蛋白酶水解(shuǐjiě)原料(yuánliào)：动物蛋白植物蛋白微生物蛋白3.3.1、蛋白质水解物的生产第三十页，共五十三页。肽类吸收的意义1.促进氨基酸的吸收2.直接进行(jìnxíng)蛋白质合成3.有利于矿物质元素的吸收和利用4.提高机体免疫力5.其他的生理意义营养调节功能肽、调节肽、生物活性肽、营养性多肽第三十一页，共五十三页。多肽的来源来自植物体的多肽大豆(dàdòu)水解多肽、苦瓜多肽、南瓜多肽等来自动物体的多肽柞蚕抗菌肽、蛇毒肽、海洋动物等来自微生物的多肽肽类抗生素：那西肽多肽的作用降血压肽、降血糖肽、睡眠肽、镇痛肽、调节生理活性肽、抗肿瘤肽、抗菌肽第三十二页，共五十三页。多肽的开发酶法制备多肽流程：原料蛋白预处理酶解分离(fēnlí)精制成品微生物发酵法制备多肽动植物蛋白原料菌种发酵第三十三页，共五十三页。1大豆多肽2白蛋白多肽3玉米多肽4大米多肽5绿豆多肽6花生肽7豌豆肽8菜籽肽9苦瓜肽10南瓜(nánguā)肽11核桃肽12棕榈肽13灵芝肽14虫草肽15丝肽第三十四页，共五十三页。酪蛋白磷肽（cpp）含有成簇的磷酸丝氨酸基的肽以牛乳酪蛋白为原料经单一(dānyī)酶或复合酶系水解,通常采用胰蛋白酶与钙、铁离子有亲和性，在无需增加维生素D的条件下，促进了佝偻病患儿骨骼的发育。第三十五页，共五十三页。鸡粉、鸡精调味品的生产牛肉水解物调味品的生产酱油的发酵(fājiào)生产鱼露的发酵(fājiào)生产谷朊粉水解肽废弃啤酒酵母水解生产酵母粉第三十六页，共五十三页。如何利用蛋白酶开发(kāifā)功能多肽？第3个问题(wèntí)第三十七页，共五十三页。3.3.2蛋白酶在氨基酸的生产的应用必需(bìxū)氨基酸共有8种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸非必需氨基酸必需氨基酸摄入不足会导致大脑和内脏器官受损，血液系统、免疫系统功能下降。WHO把氨基酸列为人体必需的营养素之一  。主要生理功能第三十八页，共五十三页。氨基酸的生产(shēngchǎn)工艺流程(ɡōnɡyìliúchénɡ)：蛋白质原料(yuánliào)预处理蛋白酶水解氨基酸混合液分离纯化氨基酸氨基酸混合液浓缩结晶干燥产品用途：食品、饲用、医药年消费量约140万T，谷氨酸和赖氨酸占总量的95%。其余的为小品种氨基酸及药用氨基酸。第三十九页，共五十三页。明胶(mínɡjiāo)的制备原料(yuánliào)：动物的皮或骨原理：天然胶原蛋白是三股螺旋结构，不溶于水，经处理，形成单链，溶于热水(rèshuǐ)，成为热可溶性凝胶，冷却得明胶溶液。碱性蛋白酶采用酶法，条件、时间从几周降为不到一天。胶原蛋白酸碱水解明胶胶原多肽3.3.3蛋白酶在明胶生产的应用蛋白酶第四十页，共五十三页。胶原多肽的功能及应用营养价值高保护胃粘膜抑制血压的上升促进(cùjìn)成骨作用防治关节病食品工业的应用第四十一页，共五十三页。3.3.4、蛋白酶在干酪(gānlào)生产的应用原料(yuánliào)乳酶法凝固(nínggù)（凝乳酶）除去乳清产品乳酸菌发酵干酪是在牛乳凝固后，排除乳清，将凝块压成块状而制成的产品。制成后未经发酵的称为新鲜干酪，经长时间发酵成熟而制成的产品称为成熟干酪。干酪中的蛋白质经过发酵后，由于凝乳酶及微生物中蛋白酶的分解作用，形成氨基酸、肽、胨等，因此很容易消化吸收。第四十二页，共五十三页。凝乳蛋白酶生产(shēngchǎn)干酪的基本原理：-酪蛋白酶副--酪蛋白+糖肽Ca2+形成(xíngchéng)凝胶凝固对Ca2+不稳定的-和-酪蛋白，失去-酪蛋白的保护也析出，形成凝胶。除了几种类型的鲜干酪，如农家干酪、夸克干酪，主要是通过(tōngguò)乳酸来凝固，而其他所有干酪的生产全是依靠凝乳蛋白酶的反应而形成凝块。第四十三页，共五十三页。肉类(ròulèi)嫩化原理老龄动物中的胶原蛋白因交联作用呈交链状、网状，肉粗糙(cūcāo)、坚韧，故需进行嫩化处理。3.3.5蛋白酶在肉类嫩化生产(shēngchǎn)的应用第四十四页，共五十三页。不同蛋白酶对牛肉嫩化的能力：按每克牛肉嫩化所需酶单位为：番木瓜蛋白酶2.5、菠萝(bōluó)蛋白酶5.0、无花果蛋白酶5.0、枯草杆菌蛋白酶75.0、米曲霉蛋白酶100.0、黑曲霉蛋白酶200.0、根酶蛋白酶250.0。番木瓜蛋白酶在肉嫩化上效果较好第四十五页，共五十三页。广州华琪生物制品有限公司的嫩肉粉主要成分为番木瓜蛋白酶。能使肉类松嫩可口易消化吸收，可节省60％烹饪时间和燃料(ránliào)。其用法为：与肉片拌匀后，10min即可烹饪。每500g肉用本品（小匙）：鸡鸭鹅猪肉2～4g，牛羊狗肉猪肚鱿鱼3～5g。净重：25g／瓶。保存期：一年。第四十六页，共五十三页。蛋白酶嫩化肉类的方法，主要有两种：3.1　酶粉嫩肉法　通常将粉末状番木瓜蛋白酶匀称地撒在肉块上，或者将肉块浸泡在液态番木瓜蛋白酶中，一般(yībān)经10分钟，即可烹煮。3.2　宰前注射法　在牲畜屠宰前5～10分钟注射番木瓜蛋白酶，通过血管分布全身，在其宰后产生嫩化作用。第四十七页，共五十三页。3.3.6、在啤酒(píjiǔ)中的应用添加蛋白酶制剂如木瓜(mùɡuā)蛋白酶、菠萝蛋白酶，可分解引起混浊的蛋白质，使其不易与多酚物质缩合，从而提高啤酒的稳定性。解决冷浑浊据报导，在啤酒旺季酒龄较短的情况下，采用在啤酒过滤后加木瓜蛋白酶，能够使啤酒稳定时间达到４个月以上，而对啤酒的其他质量指标几乎没有不利影响。第四十八页，共五十三页。3.3.7蛋白酶在茶饮料中的应用(yìngyòng)研究茶叶中蛋白质约占干物重的20%~30%,其中有很少一部分可溶于茶汤。这部分可溶性蛋白质可与多酚类、咖啡碱通过不同方式产生沉淀，参与茶乳酪(冷后浑)的形成。在茶汤中添加(tiānjiā)蛋白酶来水解这部分水溶性蛋白质，减少了蛋白质与多酚类形成复合物浑浊的机会，还增加茶汤中氨基酸含量，从而增加茶饮料的鲜爽滋味。第四十九页，共五十三页。3.3.8、酶法生产(shēngchǎn)脱腥速溶豆乳粉正已醛、正已醇与蛋白质结合，当蛋白质水解为低分子量的肽，正已醛、正已醇几乎完全释放出来，通过(tōngguò)酶水解所得豆类蛋白是无腥味的。豆腥味产生(chǎnshēng)的原因大豆中的油脂在脂肪氧化酶作用下氧化产生呈味物质，与大豆中的蛋白质有亲和性，一般条件下不易除去。第五十页，共五十三页。物理化学：加热，酸碱处理分离蛋白(dànbái)方法：真空脱臭添加糖、酸等风味剂掩盖法和酶法酶法脱腥豆乳酶量0.5%原料温度50℃，2h脱腥豆乳去除(qùchú)豆腥味方法第五十一页，共五十三页。蛋白酶的活性测定(cèdìng)酪蛋白血红蛋白硝基苯酯第五十二页，共五十三页。内容(nèiróng)总结第3章蛋白酶。在机体内不仅可以自激活，还要激活其它的蛋白酶。水解时的最适pH为7~9，较高pH下自我催化分解。在pH3.5~9的范围内稳定，最适pH为6~8。分子量约为33,000道尔顿，属于糖蛋白（含糖约2%）。适宜的反应温度为30℃~45℃。胃蛋白酶原向胃蛋白酶的转化。最适温度37℃~40℃。每500g肉用本品（小匙）：鸡鸭鹅猪肉(zhūròu)2～4g，牛羊狗肉猪肚鱿鱼3～5g。硝基苯酯第五十三页，共五十三页。