ImageLab中文操作手册

RevisedbyPetrelat2021ImageLab中文操作手册ImageLab中文操作手册FastandReliableImageLab全自动图像获取和分析软件用于MolecularImagerChemiDocXRS+、MolecularImagerGelDocXR+和CriterionStainFreeTM成像系统，可应用于凝胶电泳和转印膜的数字成像和分析，而自动化的工作流程能加速图像获取步骤及参数优化，并针对调整好的凝胶或转印膜影像进行系统性分析，进而得到所需的分析数据结果。一、软件操作界面启动精灵程序桌面主窗口工具列分析工具列状态列1.主窗口工具列档案管理分析数据ResultsData2.显示工具列转换3D成模式像亮度明暗度转换改变图像色彩全窗口大小放大缩小图像显示设定图像信息3.分析工具列（1）图像工具（ImageTools）（2）泳道及条带工具（LaneandBandTools）（3）分子量工具（MWMolecularWeight）（4）自动定量工具（QuantityTools）（5）注释工具（AnnotationTools）（6）手动定量工具（VolumeTools）二、使用ImageLab软件进行化学发光图像获取流程1.建立图像获取程序：在凝胶成像（GelImaging）对话框中选择Chemi（化学发光）应用程序在成像区域（ImagingArea）对话框中的下拉式选单中选择合适的样品大小（非必需，可之后通过PositionGel选择）选择成像曝光（ImageExposure）方法，可以人为评估曝光时间并以手动设定（ManualExposure），或是使用信号累积模式（SignalAccumulationMode，SAM）来进行操作。在建立一个化学发光的程序时最难的任务就是图像曝光的确定，因为您想获得一个充分利用了相机大的动态范围的图像。过短的图像曝光时间可能使高于膜背景的微弱信号不能被识别；过长的图像曝光时间能够使得某些条带饱和（也就是说，超出了相机准确信号的能力）。如果这是您第一次用ChemiDocXRS+分析化学发光样品，您需要在使用手控或信号累积模式（SAM）之前决定一个合适的成像时间框架。获得这个信息的最好的方式是取得一个相对短的手工曝光并利用ImageLab里的工具估计最适的曝光时间。2.手动曝光选择手动设定曝光时间（Manuallysetexposuretime）并在读秒框中输入10秒。选择Highlightsaturatedpixels。把胶置于透射箱的中心位置。在程序窗口中点击按钮。观察显示器中样品的实时图像，打开照胶系统的门并移动样品直到位于视野的中心区域。可利用照相机的变焦滑板调节成像区域的大小。选择按钮获得你的第一个图像。若所需的图像出现在计算机的显示器上，确认图像中是否包含红色的饱和区域。若有饱和区域存在，请重新以较短的曝光时间来获取图像。若无饱和区域存在，则可移动鼠标置于最暗的条带之上，在较低的右下角ImageLab窗口中观察信号的强度数值。如图中显示强度为1994，照相机能记录的最大值的32分之一（最大值为65,535）。用你的最初的10秒曝光再乘以30就可在照相机的最大动态范围附近成像你的样品。若你只需针对单一图像的成像时间进行评估，可直接在手动曝光区域中输入300。3.信号累积模式（SignalAccumulationMode，SAM）如果预估方法不足以精确满足您的目的，请选择SAM按钮，然后按Setup按钮。一个新的对话框会跳出来，其包含有可输入细分的成像时间的领域。在这个例子中，我们已经输入了小于和大于我们原始的300秒曝光估计时间，因为我们有理由相信准确的成像时间将会在这些时间之中。我们总共想要5个成像，推测其中一个将会与最佳成像极为接近。一个您的SAM设定的图像显示出现在对话框里。而SAM设定的影像显示对话窗口，在您选择按钮后再点选按钮，窗口会显示相关进度图标来说明整体图像获取的时间。在250秒获取第一个图像，同时一个小的缩略图会出现在窗口的下方，以此类推整个过程将持续到获取所有的图像。就像前面做过的那样，通过移动鼠标在图像上，您能判定强度值。您也可以通过使用位于程序窗口左边的图像转换窗口（ImageTransform）中的调节划片改变图像的表观。在SAM程序中的任何地方您都能通过点击缩略图查看图像。若确定调整到符合您要求的图像时，点击按钮舍弃其它不适合的图像来完成获取图像的程序。也可在SAM获取图像的过程中或之后来保存需要的所有图像，直接点选右键单点缩图窗口内的图像即可进行存盘保留下来。在决定获取图像的数量时，记住增加SAM图像会导致背景信号的平均。当较多的图像被获得时，在背景强度水平附近的弱的信号将会变得难以识别。如果辨别最弱的信号很重要，我们推荐在合适的时间下获得单一的成像。三、建立全自动图像获取及分析程序（CreatingProtocols）1.启动分析精灵窗口--STEP1.GELIMAGING（1）按照应用（NucleicAcid/Protein/Blots）选择相关的程序（Chooseanapplication）（2）选择成像区域（ChoosetheImagingArea）（3）选择成像曝光时间（ChooseImageExposureTime）（4）选择显示设定（ChooseDisplayOptions,HighlightsaturatedpixelsandImageColor）2.图像自动分析（AnalyzeImage）--STEP2.DETECTLANESANDBANDS设定DETECTLANESANDBANDS的参数（LowBandDetectionSensitivity（Lowsensitivity=25）、HighBandDetectionSensitivity（Highsensitivity=75）或自行设定灵敏度。3.分子量分析（AnalyzeMolecularWeight）--STEP3.ANALYZEMOLECULARWEIGHT设定AnalyzeMolecularWeightSettings的分子量标准品（MolecularWeightStandard）类型，所有Bio-Rad的各类标准品（包括核酸、蛋白）均已预存。当然，您也可以根据您的实验设置您自定义的分子量标准品。并同时设定分子量标准品的泳道及回归方式。4.报告输出设定（ReportSettings）--STEP4.SPECIFYCONTENTOFREPORTS5.结果（ResultsOverview）及报告（Report）（1）数据显示信息（DisplayingData）（2）分析表格设定（AnalysisTableOptions）（3）Lane信息（LaneProfile）（4）标准曲线（StandardCurve）四、建立图像分析程序（CreatingImagesAnalyzingProtocols）1.图像分析（AnalyzingImages）（1）分析工具AnalysisToolBox（A）自动分析（AutoAnalysis）点选进入DetectionSettings窗口设定Detectlanesandbands的参数（LowBandDetectionSensitivity（Lowsensitivity=25）、HighBandDetectionSensitivity（Highsensitivity=75）或自行设定灵敏度），接着再设定MolecularWeightAnalysisSettings的MolecularWeightStandard、StandardLanes及RegressionMethod参数。2.图像工具（ImageTools）可进行水平或垂直翻转、左右旋转90℃或自由旋转（Rotate）、裁剪（Crop）、反转（InvertData）及迭合（Merge）。3.Lanes及Bands工具（LaneandBandTools）（1）LaneTab使用自动（Automatic）或手动（Manual）搜寻Lane功能（A）针对所有的Lanes（AllLanes）进行大小调整（Resize）、（Adjust）及删除（Delete）等参数调整。（B）针对单一Lane（SingleLane）进行增加（Add）、弯曲（Bend）、移动（Move）、宽度（Width）及删除（Delete）等参数调整。（C）利用LaneBackgroundSubtraction进行背景值的扣抵，并可点选（ApplytoselectedLane）针对单一Lane进行调整。-可以藉由RollingDisk参数设定（1-99mm）来去除背景值。（2）BandsTab通过DetectBands进行自动搜寻Bands功能或手动进行增加（Add）、删除（Delete）及（Adjust）等参数调整。4.分子量分析工具（MolecularWeightAnalysisTools）此工具可由已知的标准品测算相对的分子量或碱基对（basepairs）。5.定量工具（QuantityTools）（1）相对定量（RelativeQuantityTab）从图像中选择已知的标准品（referenceband）及其标准品浓度（以绿色R表示），其分析结果可从Analysistable观察。（2）绝对定量（AbsoluteQuantityTab）通过选择已知标准品浓度的bands（至少两个以上,以R表示），并设定合适的回归参数计算所得之标准曲线来推算目标bands的绝对浓度（回归参数设定如Linear(较常用)、Point-to-Point或Cubicspline）。RegressionMethodMinimumnumberofstandardbandsMinimumnumberwithForceThroughOptionLinear21Point-to-Point21CubicSpline546.注释工具（AnnotationTools）可以通过AddAnnotations工具增加文字批注及箭头批注，并可调整批注相对位置（Alignment）、文字属性、颜色及旋转方向等参数7.定量工具（VolumeTools）按下选择较适合的Band型态,选取想要定量分析的Band位置,并在Band上点击左键两下可将样品定义为标准品、未知样品或背景空白,并分别定义其定量依据（如kb，ppm，mg/ml…）建议用RectTool方形，先框出适当的方形，并用复制方式将分析的Band框出（Ctrl+C+左键/即可复制，或Ctrl+C复制/Ctrl+V粘贴）。在Band上点击左键两下可将样品定义为标准品、未知样品或背景空白。（1）VolumeBackgroundSubtraction-Local（Localbackgroundsubtraction）通过我们所圈选的unknownvolume和standardvolume的pixels密度总和来进行背景值的扣抵。-Global（Globalbackgroundsubtraction）通过整张胶（或膜）的背景平均的密度来进行背景值的扣抵。有任何疑问与意见，欢迎随时来电询问800-820-5567