兽用生物制品关键技术

兽用生物制品概述第一节兽用生物制品分类与命名兽用生物制品是依照免疫学原理，运用天然或人工培养微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备一类物质，专供相应疫病诊断、治疗或防止之用。一.兽用生物制品分类兽用生物制品种类繁多，按不同原则分类有不同归类。本书根据生物制品性质、用途和制法等将其分为疫苗、类毒素、诊断制剂、免疫血清、免疫调节剂、微生态制剂。1.疫苗凡接种动物后能产生积极免疫和防止疾病一类生物制剂均称为疫苗。（1）活疫苗又称弱毒疫苗，它是微生物自然强毒株通过物理、化学或生物解决，并经持续传代和筛选，培养而成丧失或削弱对原宿积极物致病力，但仍保存良好免疫原性和遗传特性毒株，或从自然界筛选具备良好免疫原性自然弱毒株，经培养增殖后制备疫苗。其长处是可以在免疫动物体内繁殖；能刺激机体产生全面系统免疫反映和局部免疫反映；免疫力持久，有助于清除局部野毒；产量高、生产成本低。缺陷：是疫苗残毒在自然界动物群体内持续传递后有毒力增强和返祖危险；有不同抗原干扰现象；规定在低温、冷暗条件下运送和储存。（2）灭活疫苗又称死疫苗，用原则强毒或免疫原性良好弱毒株，经人工大量培养后，用理化办法将其灭活后制成疫苗。其长处是微生物不能在免疫动物体内繁殖，安全性好；不存在毒力返祖现象；有助于制备多价或多联等混合疫苗；制品稳定，受外界环境影响小，有助于保存运送。缺陷是该类疫苗免疫剂量大，生产成本高，有时需多次免疫；有疫苗存在过敏反映；普通只能诱导机体产生体液免疫和免疫记忆，故常需要用佐剂来增强其免疫效果。（3）单价疫苗运用同一种微生物菌（毒）株或同一种微生物中单一血清型菌（毒）株增殖培养物制备疫苗。（4）多价疫苗指用同一种微生物中若干血清型菌（毒）增殖培养物制备疫苗。（5）多联疫苗运用不同种类微生物增殖培养物，按免疫学原理和办法组合而成疫苗。（6）同源疫苗指运用同种、同型或同源微生物株制备，又应用于同种类动物免疫防止疫苗。如猪瘟兔化弱毒疫苗。（7）异源疫苗①用不同种微生物菌（毒）株制备疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中并未具有病原体产生抵抗力。如犬在接种麻疹疫苗后，能产生对犬瘟热抵抗力；兔接种兔纤维瘤病毒疫苗后能使其抵抗兔黏液瘤病。②用同一种微生物中一种型菌（毒）株制备疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原抵抗力。如接种猪型布鲁氏菌弱毒菌苗后，能使牛获得对牛型布鲁氏菌病免疫力。2.类毒素类毒素又称脱毒素。它是指细菌生长繁殖过程中产生外毒素，经化学药物（甲醛）解决后，成为无毒性而保存免疫原性生物制剂。接种动物后能产生积极免疫，也可用于注射动物制备抗毒素血清。3.抗血清抗血清为具有高效价特异性抗体动物血清（或卵黄），能用于治疗或紧急防止相应病原体所致疾病，因此又称为被动免疫制品。通过给恰当动物以重复多次注射同一种抗原物质，促使动物不断产生免疫应答，在血清中或禽卵黄中具有大量相应特异性抗体，通过提取血清或卵黄中具有大量相应特异性抗体，普通提取血清或卵黄制成。4.诊断制品运用微生物、寄生虫及其代谢产物，或动物血液、组织制备，专供诊断动物疫病、监测动物免疫状态及鉴定病原微生物制品称为诊断制剂或诊断液。5.免疫调节剂该类制剂是通过刺激动物机体，提高特异性和非特异性免疫力免疫制品，从而使动物机体对抗原物质特异性免疫力更强更持久。6.微生态制剂微生态制剂又称益生素、活菌制剂或生菌剂。是用非病原性微生物，如乳酸杆菌，醋样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或双歧杆菌等活菌制剂。第1章生产用重要设备第1节灭菌设备一.干热灭菌器干热灭菌是用于干热空气进行灭菌办法，均采用电加热，可自动控温，温度调节范畴在室温至400℃，温差±1℃。干热灭菌器重要分为箱式和层流隧道箱式，按GMP原则规定，必要使用双扉型箱式嵌墙构造，在操作区将消毒物品装箱，灭菌后从净化区取出。用法：灭菌开始应把排气孔敞开，以排除冷气和潮气。灭菌器升温必要缓慢均匀，不能剧增，特别是130~160℃之间不适当突击加温。要保持被灭菌物品均匀升温。干热灭菌法所用温度普通规定为160~170℃，时间为1~2h。灭菌结束，必要让灭菌器内温度下降到60℃如下，才干缓慢开门，否则也许引起棉花纸张起火、器皿炸裂。注意事项：合用于耐高温物品以及不能使用温热办法灭菌、潮湿后容易分解或变性物品。生产所用玻璃瓶、注射器、试管、吸管、培养皿和离心管等惯用干热法灭菌。玻璃瓶和各种玻璃器皿灭菌前必要完全干燥，以免破裂。装灭菌物品时要留有空隙，不适当过紧过挤。各种灭菌物品必要包扎装盒，包扎纸张不能与干燥箱壁接触，以免烤焦。二.高压蒸汽灭菌器（1）用法准备→开饱和蒸汽→夹层预热→夹层冷凝水排出→放置待灭菌物品（装锅）→锁紧气门→用抽空器排出器内空气→蒸汽输入器室→排放器室内空气→开始灭菌→维持灭菌所需时间→灭菌完毕→关闭蒸汽总阀门→夹层蒸汽排出→器室送入空气→压力真空指针降到0度→启动器门→取出灭菌物品→清洗器室→器门小开，器室通风→结束灭菌工作。（2）灭菌时间和温度不同灭菌物品时间和温度有不同规定。惯用培养基、培养液普通116℃20~40min；玻璃器皿、用品等，普通121℃30min。（3）操作注意事项安全办法：蒸汽压力灭菌器是受压容器，务必保证设备完好，安全阀、压力表、温度计敏捷精确。用前检查，定期检修，校正仪表，技术鉴定。灭菌物品保存期：工具、用品、器皿、工作衣帽等灭菌后保存期不超过48h；培养基、溶液等最佳72h内使用，最长保存期不能超过5d。三.电离辐射灭菌运用γ射线、伦琴射线或电子辐射穿透物品，杀死其中微生物灭菌办法称为电离辐射灭菌。该办法是在常温下进行，特别合用于各种怕热物品灭菌，最适合于大规模灭菌。当前国内外大量一次性使用医用制品都采用辐射灭菌，各种SPF动物饲料使用辐射灭菌后，不但其营养成分不被破坏，并且使用安全、保存期长。辐射灭菌长处是：①消毒均匀彻底。②价格便宜，节约能源。③可在常温下灭菌，特别合用于热敏材料。④不破坏包装，消毒后用品可长期保存。⑤消毒速度快，操作简便。⑥穿透力强。本办法唯一缺陷是一次性投资大，并要专门技术人员管理。四.无菌室当前，依照兽药GMP规定，开始应用净化空气进入无菌室。净化空气所用干净技术，系将通过调温调湿和过滤无菌空气，通过排气孔循环，使室内空气对外保持一定压差（正压或负压），同步室内可以保持恒温恒湿和空气干净。干净无菌室空调过滤系统设备有空调机、过滤机、送回风管道等。五.净化工作台净化工作台应安装在无菌室或干净室使用。第2节微生物培养设备一.温室温室是生物制品生产必备设备。用于细菌或病毒繁育，普通为36~38℃，培养温度有也有特殊规定，如培养霉菌需20~25℃。二.细胞培养转瓶机是用于大量培养细胞一种设备。这种大型转瓶机都安装在自动控温温室中，并设有高温及低温报警装置，转瓶机通过变速箱使转瓶转速控制在9~12r/h。实验室及小规模生产转瓶可安放在温箱中。细胞转瓶机应符合国际GMP原则各项规定，具备可靠性高、平稳运转、拆装以便、耐酸、耐油耐腐蚀等特点。三.发酵培养罐可进行细菌和细胞培养，当前各生物制品公司均采用培养罐培养细菌，生产规模可观。培养罐可自动调温、调PH值，用无级调速电动机、磁搅拌、消泡、控制氧压、自动补液、换液、自动高压灭菌、自动计算呼吸商等精密仪表，而罐体构造均为不锈钢质。这种深层培养法长处是可使细菌培养有比较一致环境，抽样时高度一致性，特别便于生物化学分析、细胞动力学及对单位体积内细胞数目增长状况研究，也是一种生产优质疫苗办法。四.生物反映器可用于培养悬浮生长或贴壁生长动物细胞，可生产疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素等，用生物反映器培养动物细胞比当前用静止培养、转瓶培养有更多优越性。五.微生物浓缩装置为有效地持续对微生物、抗体及生物制剂进行浓缩、分离，必要使用超滤器。依照不同用途、不同容量、超滤器可构成内压型、外压型和实验型。它们都是以中空纤维超滤膜组件为主体，中空纤维膜为不对称半透膜，呈毛细管状，膜外表面和内表面存在致密层，可分别形成外压和内压。在压力作用下，原液在膜内或膜外流动。体积不不大于微孔溶质截留在原液内，不大于微孔溶质则随溶剂透过膜，对微粒、胶体、细菌以及各种大分子有机物具备良好分离作用，从而可达到物质分离、浓缩和提纯目。内压型以获得纯净超滤液为目，重要用于提纯、除菌。外压型以浓缩为目，原液循环直至达到需要浓度为止，重要用于有用物质回收。六.孵化器按GMP原则规定，易消毒、易清洗。新型孵化器多是高分子材料制造，耐热、耐湿，抗酸碱及消毒药，供SPF鸡胚使用孵化器，还具备空气过滤系统，保证进入空气呈无菌状态。第3节乳化设备一.胶体磨立式胶体磨是制造佐剂工具之一，但由于其耐磨性较差及受电压影响大缺陷，从而影响了灭活疫苗质量。其乳化液珠直径在1~5μm之间。二.高压匀浆泵这是一种制备超细液-液乳化物或液-固分散物通用设备，其重要加工部件具备极高耐腐蚀性和良好耐磨性，对加工乳化油佐剂、抗原均不会产生不良影响，代替本来应用胶体磨。乳化液珠直径仅0.25~2μm。三.乳化装置用于规模化油乳剂疫苗生产，由贮油罐、油相制备罐、水相制备罐、剪切泵、乳化罐及贮苗罐构成。操作环节:先打开油相制备罐通向乳化罐阀门，并打开贮油罐压缩空气阀门，给贮油罐加压，再打开乳化罐无菌呼吸器阀门，然后缓慢打开乳化罐上进油阀门。油相进入乳化罐后，启动搅拌电机，使电机缓慢搅拌。关闭贮油罐上控制压缩空气手动球阀。打开冷却水循环手动球阀。打开水相罐通往乳化罐阀门，并打开水相罐压缩空气阀门，给水相罐加压，打开乳化罐上无菌呼吸器手动隔膜阀，慢慢启动乳化罐上水相进入阀门，使流量计指针缓慢上升。将水相输入乳化罐内。从乳化罐加样口按比例加入1%硫柳汞溶液，硫柳汞最后浓度为10-4.然后打开乳化罐出料阀门同步启动乳化机，开始乳化，乳化结束，打开贮苗罐进料阀门将乳化好乳剂苗输入至贮苗罐中。四.分装与包装设备一.自动灌装半加塞联动机二.瓶装液剂分装包装设备第5节冷冻真空干燥设备一.冻干机冷冻真空干燥设备简称冻干机，由制冷系统、真空系统、加热系统和控制系统四某些构成，涉及冻干箱、冷凝器、真空泵组、制冷压缩机组、加热装置、控制装置等。冻干箱内设有若干层隔板，冻干制品在隔板上，隔板内置冷冻管和加热管，分别对制品进行冷冻和加热。冷凝器又称水汽凝集器或冷阱，内装有螺旋状冷凝蛇管数组，其操作温度应低于干燥箱内制品温度，工作温度可达-45~-60℃，其作用是捕获制品升华水蒸气，以保证冻干过程进行。真空泵组对系统抽真空，使冻干箱中绝对压力应保持在0.13~13.3Pa。制冷压缩机组对冻干箱中隔板及冷凝器中冷冻盘管降温，冻干箱中隔板可降至-30~-40℃。惯用冷冻剂有氨、氟利昂、二氧化碳等。加热装置供制品在升华阶段时升温用，应能保证干燥箱中隔板温度达到80~100℃，加热系统可采用电加热、辐射加热或循环油间接加热。控制装置是运用计算机输出程序控制整个工作系统正常运转。新型冻干机冻干箱内板层上有液压装置，箱内可通入高压热蒸汽，可以实现箱内自动压瓶塞和在线高压消毒。二.冻干程序冷冻真空干燥又称冷冻干燥，简称冻干。它是物质干燥一种办法。是将物料或溶液在较低温度下冻结成固态，然后在真空下将其中水分不经液态直接升华成气态而脱水干燥过程。真空冷冻干燥在生物制品方面应用十分广泛，干燥后制品水分被排除了96%以上，易于长期保存。生物制品冷冻干燥程序：冻干箱进行空箱降温→液态制品装箱→预冻→升华干燥→解析干燥→结束冻干→加塞封口。（1）预冻在干燥之前，先将溶液物质在低温下冻结称为预冻。预冻是将溶液中自由化水固化，使干燥后产品与干燥前有相似形态，防止真空干燥时起泡、浓缩、收缩和溶质移动等不可逆变化产生。预冻温度必要低于产品共熔点温度，各种产品共熔点温度是不同样，必要认真测得。溶液达到所有凝固冻结温度称为凝固点或共晶点，实质上物质凝固点也是该物质融化点，故又称此温度为共熔点。共熔点测定是1对白金电极和1支温度计侵入待测样品溶液中，并将电极、温度计、仪表与记录仪连接，然后将溶液冷冻到-40℃如下，直至电极达到无穷大，然后缓慢升温至电阻突然减少温度，即为该溶液共熔点温度。实际制定曲线时，普通预冻温度要比共熔点温度低5~10℃。制品装量普通为容器容量1/4~1/5，厚度不适当不不大于15mm。生物制品普通预冻时间为2~4，即可开始升华。（2）升华干燥阶段也称第一阶段干燥。将冻结后产品置于密闭真空容器中加热，冰晶升华成水蒸气逸出，使产品脱水干燥。干燥是从外表面开始逐渐向内推移，冰晶升华后残留下空隙变成升华水蒸气逸出通道。当所有冰晶除去时，第一阶段干燥完毕。此时除去所有水分90%左右，占总干燥时间80%。此阶段箱内真空度普通为10~30pa。（3）解析干燥阶段也称第二阶段干燥。在第一阶段干燥结束后，必要对产品进一步干燥以除去残存水分。该阶段产品温度应上升到该制品最高容许温度，并在该温度始终维持到冻干结束。制品最高容许温度视制品品种而定：病毒性制品为25℃，细菌性制品为30℃，血清和抗生素等可高达40℃。箱内必要是高真空，真空度普通为15~30Pa如下，使解析出来水蒸气逸出产品。第二阶段干燥后，产品内残存水分含量不超过4%。（4）加塞与压盖冻干程序结束，干燥制品进行加塞、压盖，入待检库。加塞可采用箱内加塞法和箱外加塞法两种方式。当前，几乎所有生物制品公司冻干制品都采用箱内加塞法。冻干箱配有液压或气压压塞动力装置，在真空下或放入惰性气体下，将分装时放置在瓶口上四叉胶塞自动压紧。该办法可从主线上防止干燥制品受空气中水分和氧气影响。冻干总时间是指预冻时间、升华时间和第二阶段干燥时间总和。普通为18~24h，有些特殊制品需要几天时间。第6节冷藏设备一.冷库冷库可分为中、小型两类。小型只设冷藏间或活动冷库。中型冷库房，普通由主体建筑和附属建筑两某些构成。主体建筑涉及冷藏库和空调间；附属建筑涉及包装间、真空检查室、原则间、机房、泵房、配电房等。保温性能应符合生物制品贮藏保管最基本规定：①空调间，其最高库温不能超过15℃。最低在0℃以上，普通用冷风机作冷却设备。②冷藏间，规定在-15℃如下，作制品保管。为保证库温恒定，在建筑构造上，必要在其外墙、地坪、平顶设立持续隔热层，要有足够厚度，以制止冷气从室内散逸；做好保温层防潮设施，低温库要采用电动冷库门。使用注意事项：①新冷库初次投产时，不应降温过快，避免构造内部结冰膨胀。当库温在4℃以上时，每天降温不得超过3℃，直至到达规定为止。②冷库在使用后来，要保持温度稳定性，即高温库（10±5）℃；低温库（—18±3）℃。③严格防水、汽渗入构造保温层；低温库内不得做多水物品作业。④合理使用库容，合理安排货位和堆放高度，保持库内地坪受荷均匀。二.冷藏运送设备为保证生物制品使用效果，在运送过程中必要使用品有隔热车体及降温装置冷藏车。此类车按性能来说可分为机器冷藏车与冰箱冷藏车。当前国内多使用后者，这种车造价低，使用维修以便。无论任何类型冷藏车，都必要具备：①具备良好隔热车体，减少车内与外界热互换。②设有制冷降温装置，适应生物制品保存条件。③设有空气循环装置，以保证车内温度均衡。④设有温度批示，最佳有自动控制仪表，以控制车内温度。保温箱无制冷系统，亦以软木、玻璃纤维和聚氨酯泡沫塑料为保温材料。内外层惯用镀锌钢板和铝板为保护层。不能自动降温至冰点如下，而是使用时将冷冻干燥生物制品置于箱内，并加入一定冰块，严密加盖。箱内可维持20多小时不解冻，能维持运送途中低温保存。当前国内兽用冷冻干燥制品运送，多使用这种简朴保温箱。三.液氮罐液氮罐是专供贮存液氮用容器，液氮温度可达-196℃，属超低温，因而是保存活细胞、活组织、生物制品、冷冻精液、微生物等抱负容器。液氮罐构造和玻璃热水瓶同样，能防止热传导、辐射和对流。液氮罐都是双壁，双壁之间有一夹层。夹层吧、空隙越大，真空度越高，蓄冷时间也越长。新罐或使用后液氮挥发已净和清洗后待用容器，在使用前，先加入适量液氮预冷30min左右，然后加满别的液氮，充装后液面应低于颈管。液氮布满后，液氮浮现沸腾不止或罐上半部结霜，证明此缸性能已不正常。放入或提取罐内贮存物时，要迅速浸入或离开液氮面，取出被保存物动作要快、准、稳。第7节污物解决设备由于生物制品都是使用病原体进行制造和检查，如果排放到外界，会导致环境污染，引起动物疫病流行，甚至危害人类健康。一．污水解决生物制品公司生产污水，须经无害化解决，检查合格后才干排放。普通采用高压热蒸汽灭菌法。生产和检查污水直接排放到污水储罐中，当收集于污水储罐中污水达到一定量时，用泵向储罐夹层中通入蒸汽，待罐内温度达到100℃，煮沸60min，关闭蒸汽阀，降温后经检测合格后排放。强毒舍生产污水排入污水管网集中到污水池，进行高压蒸汽灭菌，经检测合格后排放到污水解决站进行二次解决。污水排放原则：①生化需氧量（5d、20℃）达到60mg/L，生化需氧量越高，表达水中有机污染物越多；②化学需氧量重铬酸钾法达到100mg/L，氧化剂也可用高锰酸钾；③动物检测二、带毒粪便及垫草解决采用生物发酵法进行。原则是每池装满后能自然发酵2年以上。发酵池内外墙用水泥沙浆粉刷外，还应涂沥青防水层，防止池内污水渗漏，池外地表、地下水渗入影响发酵效果。为了便于清除，应一半设在强毒区，一半设在隔离区外，以便发酵彻底后，启盖清出粪便和残渣、垫草腐烂物。强毒区内产生废弃物要经高压无害化解决后移出工作区，对不适当高温解决应使用消毒液浸泡消毒解决后，进行生物发酵。三、动物尸体解决所有感染疫病死亡动物以及检查耐过动物，实验结束后须宰杀，将尸体用高压蒸汽消毒、焚尸炉焚烧或化制后，按粪便残渣解决办法进行生物发酵解决，安全可靠。第2章保护剂、灭活剂与免疫佐剂第1节保护剂保护剂又称稳定剂，是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏物质。生物制品冷冻真空干燥普通都加冻干保护剂，以使制品在冻干后仍保持有较高生物学活性，并且可以延长制品保存期并提高耐热性。一.冻干保护剂构成与作用冻干保护剂普通由营养液、赋形剂和抗氧剂三某些构成。（1）营养液可使因冻干而受损伤细胞修复，对水分子起缓和作用，并能使冻干生物制品仍具有一定量水分；还可增进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔海绵状，增长溶解度，常为低分子有机物，如蔗糖、山梨醇、乳糖、氨基酸和糖类等。（2）赋形剂重要起骨架作用，防止低分子物质碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响，使冻干制品形成多孔性、疏松海绵状构造，从而使溶解度增长，常为高分子有机物，如脱脂乳、蛋白胨、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、明胶等。（3）抗氧剂可抑制冻干制品中酶作用，增长生物活性物质在冻干后贮存期间稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。二.影响保护剂效能因素保护剂效能重要体当前保证生物活性物质在冻干和保存过程中存活率。（1）保护剂种类用不同保护剂冻干同一种微生物，在其保存过程中存活率不同。（2）保护剂组分浓度保护剂组分浓度可直接影响冻干制品细菌或病毒成活率，必要严格掌握。（3）保护剂配制办法配备办法不同会影响保护剂效果，例如含糖保护剂灭菌温度不适当过高，否则由于糖炭化而影响冻干制品物理性状和保存效果，因此均采用116℃30min灭菌或间歇灭菌；又如血清保护剂就不能用热灭菌法，必要以滤过法除菌。（4）保护剂酸碱度（pH）保护剂pH应与微生物生存时pH值相似或相近，过高或过低都能导致微生物死亡。对于冻干活疫苗而言，一种良好冻干保护剂不但可以在冻干过程中最大限度地提高疫苗微生物存活率，并且需要提高其耐热性，延长保存期。三.惯用冻干保护剂（1）5%蔗糖脱脂乳保护剂蔗糖5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后，100℃蒸汽间歇灭菌3次，每次30min；或110~116℃高压灭菌30~40min。合用于鸡新城疫、猪瘟、羊痘和狂犬病等病毒性活疫苗保护剂。（2）明胶蔗糖保护剂明胶1%~2%、蔗糖5%、硫脲1%~2%。先将12%~18%明胶液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加热溶解，116℃高压灭菌30~40min；或100℃3次灭菌，每次30min。合用于猪肺疫和猪丹毒等细菌性活疫苗保护剂。第2节灭活剂一.灭活概念与灭活办法兽用生物制品生产中灭活，是指破坏微生物生物学活性、繁殖能力、致病性和毒性，但尽量不影响其免疫原性，被灭活微生物重要用于生产灭活疫苗；或指破坏诊断血清或待检血清中补体活性，以避免补体对诊断实验干扰作用。灭活重要办法有两类，即物理学办法和化学办法。补体可以非特异性和抗原结合（1）物理学灭活涉及加热及射线照射等办法。加热灭活办法除用于血清灭活（56℃30min）外，很少用于疫苗生产，加热杀死微生物办法比较粗糙，容易导致蛋白质变性，因而免疫原性受到明显影响。（2）化学灭活该办法当前采用最多。用于灭活微生物化学试剂或药物称为灭活剂。二.惯用灭活剂1.甲醛溶液甲醛溶液是甲醛气体水溶液，又称福尔马林。惯用甲醛溶液约含37%甲醛气体，为无色透明液体，有辛辣窒息味，对眼、鼻粘膜有强烈刺激性，较冷温度下久贮易变浑浊，形成三聚甲醛沉淀，虽加热可变清，但会减少其灭活性能，故普通商品甲醛溶液加10%~15%甲醇，以防止其聚合。恰当浓度甲醛可使微生物丧失增殖力或毒性，保持抗原性和免疫原性，不同类型微生物，使用甲醛灭活浓度不同；普通需氧菌为0.1%~0.2%、厌氧菌0.4%~0.5%、病毒多数为0.1%~0.3%。无论是杀菌或脱毒，使用甲醛或其她灭活剂，其浓度及解决时间都要依照实验成果来拟定，普通以用低浓度、解决时间短而又能达到彻底灭活目为原则，必要时在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反映。灭活作用机理是甲醛醛基作用于微生物蛋白质氨基产生羟甲基胺，作用于羧基形成亚甲基二醇单酯，作用于羟基生成羟甲基甲酚，作用于巯基形成亚甲基二醇。上述反映生成羟甲基等代替敏感氢原子，破坏生命基本构造，导致微生物死亡。甲醛还可与微生物核糖体中氨基结合，使两个亚单位间形成交联联，亦可抑制微生物蛋白质合成。2.烷化剂此类灭活剂能破坏病毒核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而又不损害其蛋白衣壳，从而保存其保护性抗原。3.苯酚又名石炭酸。为无色结晶或白色熔块，有特殊气味，有毒及腐蚀性，暴露在空气中和阳光下易变红色，在碱性条件下更易增进这种变化。4.结晶紫是一种碱性染料，为绿色带有金属光泽结晶或深绿色结晶状粉末，易溶于醇，能溶于氯仿。灭活机制重要是其阳离子与微生物蛋白质带阴电荷羟基形成弱电性化合物，妨碍微生物正常代谢。5.β-丙酰内酯三.影响灭活作用因素（1）灭活剂特异性在选取灭活剂时，应考虑其特异性，即应考虑其对微生物作用范畴。如酚类能抑制和杀灭大某些细菌繁殖体，真菌和病毒对酚类不太敏感。（2）微生物种类与特性不同种类微生物对各类灭活剂敏感性并不完全相似；细菌繁殖体及其芽孢对化学药物抵抗力不同；生长期和静止期细菌对灭活剂敏感限度亦有差别。（3）灭活剂浓度灭活剂浓度越高，灭活脱毒越快，但抗原损失量亦较大。有时可以采用分次加入灭活剂进行灭活、脱毒比较缓和办法。即将灭活溶液分多次加入，加量有小至大，ph由低而高，温度逐渐提高到容许最高温度，这样利于保护抗原免疫原性。（4）灭活温度普通状况下，灭活作用随灭活温度上升而加速。但是温度上升，细菌死亡率可成倍增长，如果温度超过40℃或更高，对微生物抗原性将有不利影响。（5）灭活时间与灭活剂浓度和作用温度密切有关。普通随着灭活剂浓度及作用温度升高，灭活时间则缩短。在生物制品生产中，应以保证制品安全和效力，采用低灭活剂剂量、低作用温度和短时间解决为最佳。（6）酸碱度（PH）pH对细菌灭活作用有较大影响。在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但抗原性易受破坏。同步，PH也影响灭活剂电离度。未电离分子普通较易通过细菌细胞膜，灭活效果较好。（7）有机物存在被灭活病毒或细菌液中，如果具有血清或其她有机物质，会影响灭活剂灭活能力。由于有机物能吸附于灭活剂表面或者与灭活剂化学基团相结合。则明显减少灭活剂灭活作用。第3节免疫佐剂免疫佐剂是生物制品惯用物质，单独使用时普通没有免疫原性，与抗原物质混合或同步注射使用时，能非特异性增强抗原特异性免疫应答作用。一.概念与作用佐剂：凡是可以增强抗原特异性免疫应答物质均称为佐剂。免疫佐剂作用：①抗原递呈。是指抗原分子递呈给T细胞办法。佐剂与疫苗联合伙用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性结合、保护、运送并递呈给效应细胞。②抗原寻。是指抗原传递给免疫系统中恰当效应细胞效率。佐剂可延长抗原在组织内贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释。③免疫调节。是指任何可以修饰免疫效应细胞对抗原或表位进行加工机制。通过这种机制，可以变化特异性免疫应答本质或强度。同一抗原和不同佐剂一起使用可以引起不同免疫反映。二.常规免疫佐剂1.铝盐类佐剂（1）氢氧化铝胶佐剂又称铝胶，质优铝胶分子细腻，胶体性良好，稳定，吸附力强，保存2年以上吸附力不变。（2）明矾佐剂（3）磷酸三钙佐剂2.油乳佐剂油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成佐剂。此类佐剂知名有弗氏佐剂（FA），分为弗氏不完全佐剂（FIA）和弗氏完全佐剂（FCA）。弗氏佐剂可使在正常状态下没有免疫原性物质成为免疫原，其作用机理是先作用于Th1细胞，后作用于Th2细胞，并能启动细胞免疫而发挥作用。（1）乳剂概念乳剂是将一种溶液或干粉分散成细小微粒，混悬于另一不相溶液体中所形成分散体系。被分散物质称为分散相（内相），承受分散相液体称持续相（外相），两相间活性物质称为乳化剂。（2）乳化剂商品乳化剂种类诸多，普通可依照用途根据乳化剂HLB值（亲水亲油平衡值）进行选取。HLB值高，容易形成水包油型油乳剂；HLB值低，易形成油包水型油乳剂。（3）白油制乳剂苗用白油，为无多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。（4）乳剂配方与乳化办法乳化剂、油相和水相配合比例及乳化办法，决定了制备乳剂性状和稳定性。一种好乳剂疫苗应是粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。大量生产乳剂疫苗时，可将94%白油与6%司本-80混合后加1%~2%硬脂酸铝，灭菌后即为油相；将抗原液加4%吐温-80为水相。检查：取样于10ml离心管中装满乳剂，3000r/min离心15min，相称于保存一年以上不破乳，如不分层，即获得稳定W/O型乳剂苗，如分层则继续乳化直至合格为止。3.蜂胶佐剂三、新型免疫佐剂1.细胞因子类佐剂细胞因子是机体各种细胞在其生命周期中所释放具备不同生物学效应物质，是免疫细胞间互相作用调节信号。细胞因子作用特点体现为多效性、靶细胞多样性、多源性、高效性和迅速反映性。几种重要细胞因子为白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-12、γ-干扰素。2.CpGDNA具有非甲基化CpG（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序脱氧核糖核酸DNA。它在诱导机体非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答及调控免疫应答类型等方面发挥着重要作用。3.毒素佐剂当前，已证明通过基因突变体外表达霍乱毒素（CT）、大肠杆菌不耐热毒素（LT）和破伤风类毒素（TT）等没有毒性，具备较好佐剂作用。4.免疫刺激复合物（ISCOM）佐剂应用于各种细菌、病毒和寄生虫病疫苗，具备产生全面免疫应答效力，可长期增强特异性抗体应答。5.脂质体（LIP）佐剂脂质体在宿主体内可以生物降解，自身无毒性，并且能减少抗原毒性，无局部注射反映。脂质体与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用，效果最佳。第3章细菌性疫苗生产技术第1节细菌性疫苗生产工艺流程1.培养基制备培养基是人工制备供细菌生长繁殖一种营养物质，是维持与繁殖细菌基本。2.生产用种子制备（1）原种由中华人民共和国兽医药物监察所或其委托单位负责保管。（2）基本种子由中华人民共和国兽医药物监察所或其委托单位负责制备、检查、保管和供应。（3）生产种子有生产公司自行制备、检查和保管。以上种子如果按菌（毒、虫）种毒力可以分为:①强毒菌（毒、虫）种：是指具备强大体病力菌（毒、虫）种，普通免疫原性好，惯用于制造某些灭活疫苗、免疫血清以及疫苗效力检查等。②弱毒菌（毒、虫）种：是指对动物无致病力而具备一定免疫原性菌（毒、虫）种，重要用于制造弱毒疫苗。生产用种子是由基本种子扩繁制备而成，涉及一级种子和二级种子。普通将基本种子划线接种于适当琼脂平板培养基中，选用经分离培养后获得典型菌落5~10个，混合接种于适当琼脂斜面若干支，普通37℃培养，经纯粹检查和鉴定实验，合格后，作为一级种子。3.制苗用菌液制备将合格种子液以1%~2%量接种于适当培养基，然后依不同菌苗规定进行培养。4.半成品检查上述培养获得菌液即为半成品。半成品检查涉及纯粹检查和活菌计数。如果制备灭活菌苗，菌液经纯粹检查和活菌计数检查合格后，还需用灭活剂进行灭活，灭活后需进行无菌检查。第2节培养基制备技术一、培养基原料原则（1）水是制造培养基重要原材料，是细菌生长所需营养成分良好溶剂。（2）肉浸汁是生产培养基基本原料。（3）蛋白胨是蛋白质经蛋白酶或酸水解后水解产物。（4）明胶是由动物胶原组织加工解决制成，是一种蛋白质。（5）琼脂是从石花菜等海藻类中提取复杂多糖，为半乳糖胶。（6）酵母浸出液酵母浸出液具有某些维生素与生长因子，是增进细菌生产繁殖重要材料之一。二、培养基分类1.按原料来源分类（1）天然培养基（2）人工合成培养基2.按物理性状分类（1）液体培养基（2）半固体培养基（3）固体培养基3.按用途分类（1）基本培养基（2）营养培养基（3）选取培养基（4）鉴别培养基（5）增菌培养基（6）厌气培养基（7）生化培养基（8）检查培养基三、培养基制造程序1.配制依照培养基配方精确称取各种成分放于容器中，加少量水浸透原料后，补足水量，使原料溶解。也可用热水或加热进行溶解，并随时搅拌，防止外溢。2.调节酸碱度由于细菌对酸碱度很敏感，培养基酸碱度通过调节后才干使用。3.过滤与澄清培养基配制成后普通有沉渣或混浊，须过滤澄清使其清晰透明才可使用。可用纱布、脱脂棉或滤纸进行过滤。澄清是运用培养基中引起混浊胶体混悬物在高温下汇集沉淀特性，将制好培养基置于高压锅内110℃加热30min后，放置数小时，使培养基自然冷却凝固，然后取上层澄清某些进行分装。4.灭菌普通培养基均用高压蒸汽灭菌，普通为116℃灭菌30min5.无菌检查普通将制好培养基于37℃保温24~48h，证明无菌后方可应用。第3节细菌培养技术细菌培养是指细菌在动物体外人工培养基以及人工控制环境中生长繁殖过程。制备细菌性疫苗一方面应通过细菌分离培养，获得单个细菌菌落，制备细菌菌种，然后，进行规模化细菌培养。一、细菌分离培养（1）划线接种法此法最为惯用，即在不同培养基平面上，以各种办法划线接种细菌，使细菌生成单个菌落。依照菌落特性进行鉴别、挑选典型菌落进行纯培养，制备种子培养物。（2）倾注培养法该法合用于深层条件下生长良好细菌分离培养。即先将营养琼脂培养基加热溶解，冷至45~50℃，加入适量细菌培养液，混匀后倾入灭菌培养皿内，制成平板。置37℃培养24~36h后，挑取典型菌落移植培养。厌氧菌分离培养多数在含二氧化碳条件下进行。二、细菌规模化培养1.菌种接种量细菌菌种是指有一定原则菌体增殖培养物，简称菌种。如接种量过少，会引起生长繁殖缓慢，影响活菌数，有时甚至浮现无菌生长；接种量过多，就会将过多代谢物带入培养基内，导致有害物质抑制生长。普通菌种接种量为1%~2%。2.培养时间最佳培养时间普通根据细菌生长曲线而定。多数在对数繁殖后期至稳定前期间活菌数最高，生命力最强，宜于收获。3.培养办法（1）固体表面培养法惯用大扁瓶琼脂平板，经无菌检查后，无菌接入菌种液，使其均匀分布于琼脂表面，平放静置培养，收集菌苔，制成细菌悬浮液，用于制备诊断抗原或疫苗。（2）液体静置培养法适于普通细菌性疫苗生产。培养容器可用大玻璃瓶或培养罐，培养基装量为容器体积1/2~2/3，灭菌后，冷却至37℃接入菌种，保持适当温度静置培养。（3）液体深层通气培养法合用于需氧菌培养，可加速细菌分裂繁殖，缩短培养时间，提高细菌数量。（4）透析培养法透析培养是指培养室与培养基室之间隔1层半透膜培养办法。该系统把培养基与培养物分开为各自循环系统，中间经透析器互换营养物。4.采用通气培养需注意问题（1）补充营养物质依照被培养细菌对营养规定，在培养过程中注意补充营养物质。如恰本地加葡萄糖补充碳源；恰当加蛋白胨或必须氨基酸补充氮源，才干更好发挥通气培养作用，增长菌数，提高制品质量。（2）控制通气量细菌对氧需要，在不同生长发育阶段又有所不同，各种细菌繁殖过程中需氧量亦不同样。（3）控制最适PH值深层通气培养PH值变化较快，保持培养过程最适PH值很重要。（4）培养温度在培养过程中要恰当调节培养温度，培养罐夹层直接用蒸汽加热往往不稳定，最佳用自控调节温水循环控制温度，以使最适培养温度上下不超过1℃。（5）控制污染重要是通入空气解决不当、搅拌轴密封不严或底盘与进出液阀门灭菌不彻底等，为此，培养罐罐体与部件，应以不锈钢制造，垫圈用聚四氟乙烯制品，使之密封良好，易于灭菌。此外空气滤过装置，一方面是将压缩出来空气通过油水分离。不能使有气味空气进入培养罐内，通过棉花与活性炭滤器，再通过除菌过滤，以免通气带进杂菌，导致培养液污染。同步培养过程排气管口也应有消毒设备，以免污染环境。三、细菌计数计数1.活菌计数法活菌计数是将待测样品精准地做一系列稀释，然后再吸取一定量某稀释度菌液样品，用不同办法进行培养。经培养后，从长出菌落数及其稀释倍数就可换算出样品活菌数，通惯用菌落形成单位（CFU）表达。（1）倾注平板培养法依照标本中菌数多少，用普通肉汤将被检标本进行10倍递进稀释。取某稀释度菌液样品1ml加在灭菌平皿中，然后取预先加热融化且冷至45~50℃琼脂培养基分别倾入上述平皿中，及时摇匀放平，待其充分凝固后，置37℃培养一定期间。记录平皿上长出菌落数，乘以稀释倍数，即为每毫升标本中具有活菌数。（2）平板表面散布法按常规办法制作琼脂培养基平板，分别取不同稀释度细菌液0.1ml滴加于平板上，并使其均匀散开。（3）微量点板计数法本法中培养基制备、解决及样品稀释与平板表面散布法相似，只是每个稀释度接种量为0.02ml，使其自然扩散。2.比浊计数法其原理是菌液中含菌数多少与其混浊度成正比。取一定稀释度菌液与原则比浊管进行比浊，能概略计算出每毫升菌液中菌数。3.颜色变化法其原理是在液体培养基中按0.1%量加入1%酚红溶液，运用支原体生长过程中产酸，使得培养基颜色由粉红变成黄色，从而拟定支原体含量，以每毫升颜色变化单位计数。重要用于支原体培养物菌数测定。细菌自家苗1.细菌分离：取病料，分离致病菌。2.毒力鉴定：将单个细菌分别接种营养肉汤，37℃培养20h，取1ml接种鸡，选取死亡最快菌株，检查合格作为菌种。3.菌液培养：将菌种2%比例加入营养肉汤，37℃18~20h。（时间长会产生内毒素）4.灭活：加入0.5%甲醛，37℃灭活20~24h5.灭活彻底检查6.铝胶佐剂制备：将NaOH溶液缓慢加入Alcl3溶液中，当溶液由絮状沉淀变为均一白色时，停止加热。7.配苗：菌液：铝胶=1:2充分混匀8.浓缩：弃去一定上清液，1/2上清液0.5%硫柳汞9.检查，安检第4章病毒性组织疫苗生产技术第1节病毒性组织疫苗生产工艺流程1.健康动物或敏感禽胚选取禽胚质量对于病毒和生物制品质量极为重要。当前抱负禽胚是无特定病原体（SPF）鸡胚。据国标，SPF鸡胚不应具有鸡特定22种病原体，可合用于各种禽疫苗生产。但由于SPF鸡饲养条件严格，价格昂贵，商品化种蛋供不应求，故惯用非免疫鸡胚加以补充，这种蛋只用于灭活疫苗生产，不能用于活疫苗生产。2.生产中毒制备生产毒种是由基本种子扩繁制备而成。普通将基本种子经恰当稀释接种于动物或鸡胚中，按规定期间和温度培养，收获含病毒组织或病毒液。经毒种鉴定合格后，直接分装或冻干，注明收获日期、代次，作为生产用毒种。3.接种、病毒培养与收获将合格生产用毒种经恰当稀释接种于动物或鸡胚中，接种办法诸多，可依照培养病毒种类进行选取。接种后动物或鸡胚，按各自规定期间和温度进行培养，收获含毒组织或病毒液，即为半成品。4.半成品检查半成品检查涉及无菌检查和病毒含量测定。如果制备灭活疫苗，经无菌检查和病毒含量测定合格后病毒液，还需用灭活剂进行灭活，灭活后需进行无菌检查。半成品必要无菌，才可以进行配苗。如不合格经无害化解决。5.配苗与分装将合格半成品加入保护剂或佐剂，定量分装，制成活疫苗或灭活疫苗，轧盖、贴标、包装后入待检库。活疫苗普通加入5%蔗糖牛奶保护剂，经冷冻真空干燥制成，低温冷冻保存。灭活疫苗惯用油乳佐剂，按比例与灭活毒液混匀乳化后直接分装，低温保存。第2节动物增殖病毒技术一、动物选取选取动物原则：对相应病毒有易感性高；健康，体重、年龄要基本一致，个体差别不适当过大；大动物应来源于非疫区，未接种过相应病毒疫苗青壮年动物。二、接种办法（1）脑内接种法（2）皮内接种法（3）皮下接种法（4）静脉接种法（5）腹腔接种法三、接种后动物观测和收获病毒动物接种后应每天观测特性性变化，如体温曲线、特性性临床症状等。依照观测选出接种后浮现符合所规定反映症候动物，按规定期间，规定办法剖杀，采用含毒组织或器官，各项检查合格后即可使用。第3节禽胚增殖病毒技术一、接种途径（1）绒毛尿囊膜接种多用于嗜皮肤性病毒增殖，如痘病毒、疱疹病毒等。选取10~12日龄鸡胚，划出气室，将卵气室向上直立，经消毒后于气室中央打孔，用细针头插入刺破壳膜，再退出气室内接种0.2ml病毒液，将病毒滴在气室壳膜上，病毒即慢慢渗到气室下面绒尿膜上，封口后将鸡胚直立培养。另一种办法需作人工气室法，照检后划出气室和胚位，将卵横卧于蛋架上，胚胎位置向上，消毒后于气室部位和胚位卵壳上分别钻一种小孔，用吸耳球紧贴气室孔轻吸，鸡胚面小孔处绒毛膜下陷形成一种人工气室，天然气室消失。在人工气室处接种0.1~0.2ml病毒液，封孔，人工气室向上横卧培养。（2）尿囊腔接种普通选9~11日龄鸡胚，在气室边界上2~3mm处避开血管处，消毒后打孔，接种病毒0.1~0.2ml，封口后孵育。（3）卵黄囊接种法通惯用5~8日龄鸡胚，经照检后划出气室和胎位，在气室中心壳上钻一小孔，接种针头沿胚纵轴插入约3cm，注入0.1~0.2ml（4）羊膜腔接种法二、病毒培养与病毒收获技术（1）绒毛尿囊膜收获将整个蛋内容物倒掉，用灭菌镊子撕下整个绒毛尿囊膜，放灭菌容器中备用。经研磨制成病毒悬液。病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见痘斑。（2）尿囊液收获用镊子压住胚体，用灭菌吸管插入尿囊液腔，吸取尿囊液。（3）羊水收获收获尿囊液后，用无菌镊子夹起羊膜，用灭菌吸管或注射器刺入羊膜腔吸取羊水。（4）卵黄囊收获（5）胚胎收获用眼科镊子撕破绒毛尿囊膜和羊膜，挑起鸡胚，置灭菌容器中。三、病毒含量测定计术毒力或毒价单位基本上采用半数致死量（LD50）表达，并且LD50计算应用了记录学办法，减少了个体差别影响，因而成果比较对的。以感染发病作为指标可用半数感染量（ID50）；以体温反映作指标者，可用半数反映量（RD50）。用鸡胚测定期，可用鸡胚半数致死量（ELD50）或鸡胚半数感染量（EID50）；在细胞培养上测定期，可用细胞半数感染量（TCID50）.LgEID50=高于50%死亡稀释倍数对数×稀释系数对数+距离比距离比=（高于50%死亡率—50%）/(高于50%死亡率—低于50%死亡率)四、影响禽胚增殖病毒因素（1）种蛋质量种蛋质量直接与增殖病毒质和量有关。最抱负禽胚是SPF种蛋，另一方面是非免疫种蛋。①病原微生物家禽有诸多疫病及病原可垂直传递于鸡胚，如白血病等。这些病原体既可污染制品自身，又可影响病毒在鸡胚内增殖。②母源抗体鸡感染病原或使用抗原后会使其种蛋带有母源抗体，从而影响病毒在鸡胚内增殖。③禽胚污染禽胚污染是危害病毒增殖最严重因素之一，应严格防止。定期清扫消毒孵化间，保持室内空气新鲜，无尘土飞扬。（2）孵化技术①温度普通禽胚发育适当温度为37~39.5℃，其适当温度应控制在37.8~38℃。鸭、鹅孵化温度比鸡胚高。此外，鸡胚较能忍受低温，短期降温对鸡胚发育尚有增进作用，故禽胚孵化温度应严格控制，宁低勿高。有些病毒对温度比较敏感，如鸡胚接种传染性支气管炎病毒后，应严格控制孵化温度，不应超过37℃。②湿度湿度可控制孵化过程中蛋内水分蒸发。鸡胚孵化湿度原则为55%~65%③通风禽胚在发育过程中吸入氧气，排出二氧化碳。因而需更换孵化机内空气。④翻蛋在孵化过程中定期翻蛋，既可使胚胎受热均匀，有助于发育；又可防止胚胎与蛋壳粘连。翻蛋还可变化蛋内部压力，强制胚胎定期活动，促使胚胎发育。（3）接种技术不同病毒增殖有不同接种途径，同一种病毒接种不同日龄禽胚获得病毒量也不同。如普通鸡胚发育至13~15日龄，鸭胚发育至15~16日龄，尿囊液含量最高，平均6~8ml，羊水1~2ml。因而，由尿囊腔接种病毒时，应依照不同病毒培养所需要时间选取最恰当接种胚龄，以获得最高量病毒液。第5章病毒性细胞疫苗生产技术第1节病毒性细胞疫苗生产工艺流程1.细胞选取与制备可依照培养病毒种类选取敏感细胞。选取根据是病毒适应性强、毒价高；细胞来源以便、制备简朴、生命力强。2.生产毒种制备生产毒种是由基本种子扩繁制备而成。普通将基本种子按规定在易感动物、禽胚或敏感细胞继代培养，经检查合格后，作为生产用毒种。毒种继代不超过3~5代。3.接毒、培养与收获病毒将合格生产用毒种接种于细胞单层，病毒接种普通按维持液1%~10%量接入。科学接种量应以TCID50为根据。病毒接种细胞办法有异步接毒和同步接毒两种。异步接毒是细胞长成单层后倒去生长液，将毒种37℃吸附1h后加入维持液。多数病毒采用该接毒方式。同步接毒是在制备细胞同步或在制备细胞后4h内将病毒接入，重要用于病毒复制发生在细胞有丝分裂时期病毒，如细小病毒等。接毒后选取适当温度进行培养，大多数病毒增殖温度为37℃。病毒在敏感细胞内增殖普通会产生细胞病变（CPE），当CPE达75%左右时收获，重复冻融多次使病毒释放，细胞培养物；或将细胞培养物离心除去细胞碎片，收集上清液，即为半成品，-20℃保存。4.半成品检查半成品检查涉及无菌检查和病毒含量测定。5.配苗与分装将合格半成品加入保护剂或佐剂，制成活疫苗或灭活疫苗，入待检库。成品检查合格后，可以销售使用。第2节细胞制备技术细胞体外培养已成为增殖病毒重要办法。细胞增殖病毒技术原理重要是为病毒易感组织细胞提供良好体外生长环境，使细胞适应并繁殖，从而为病毒增殖提供宿主进行复制。一、细胞类型（1）原代细胞是指由新鲜组织经胰酶消化后，将细胞分散制备而成，如鸡胚成纤维细胞（CEF）。原代细胞对病毒检测最为敏感，但制备和应用不以便。（2）次代细胞原代细胞长成单层后用胰酶从玻璃瓶壁上消化下来后，再作培养细胞称次代细胞，又称继代细胞。它保持本来细胞理化特性不变，可在体外传代几代到几十代，最后不可避免地衰老死亡。次代细胞形态和染色体与原代细胞基本相似。（3）传代细胞是指从原代细胞经传代培养后得来可以长期持续传代细胞。涉及细胞株和细胞系。细胞系是指从原代细胞经传代培养后得来一群不均一细胞，可以长期持续传代。细胞系又分为有限细胞系和无限细胞系，有限细胞系在体外传代是有限，无限细胞系能在体外无限传代，其染色体数目及增殖特性均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞。细胞株由细胞系克隆获得、具备特殊遗传、生化性质或特异标记细胞群，其生物学性质、生化性质呈均一性。细胞株又分有限细胞株和持续细胞株。有限细胞株大多数染色体为二倍体，能持续传诸多代，但为有限生命；没有肿瘤原。广泛应用于病毒性生物制剂制备，安全可靠。持续细胞株可以持续传代，如HeLa细胞株。二、细胞培养液配制1.生理平衡盐溶液（1）汉克氏液（2）欧氏液2.7.5%碳酸氢钠溶液3.细胞分散液（1）0.25%胰蛋白酶溶液（2）EDTA-胰酶分散液4.批示剂（1）1%酚红溶液（2）0.1%中性红溶液5.营养液（1）0.5%乳汉液（2）0.5%乳欧液（3）合成培养液（4）3%谷氨酰胺溶液6.血清血清是细胞污染支原体、病毒等重要来源。因而，对血清质量控制尤为重要。血清必要无菌，不得有支原体污染，不得有牛黏膜病毒污染，血清中细菌内毒素含量应不高于10EU/ml7.抗生素溶液三、细胞制备办法1.原代细胞一方面选用恰当组织或器官，采用机械分散法如剪碎、挤压等使之成为约1mm³小块，然后用0.25%胰酶消化掉细胞间组织蛋白，消化时间长短与温度、组织来源及大小等关于，普通37℃消化10~50min，4℃消化需要12h左右。消化好组织块去掉胰酶经吹打成分散细胞，加上营养液进行培养。（1）鸡胚成纤维细胞（CEF）制备（2）犊牛睾丸细胞（BTC）制备2.传代细胞多采用EDTA-胰酶消化法，胰酶浓度为0.05%，其作用是消化细胞间组织蛋白；EDTA浓度为0.01%，其作用是螯合维持细胞间钙镁离子和细胞与细胞瓶间钙镁离子，使细胞易脱落和分散。3.细胞冻存与复苏细胞株与细胞系均需保存于液氮中（-196℃）。为保持细胞最大存活率，普通采用慢冻快融法。四、细胞培养法（1）静置培养培养瓶和营养液都静止不动，细胞沉降后贴附在培养瓶内面上生长分裂，3~5d形成细胞单层。静置培养是最惯用细胞培养办法。（2）转瓶培养将培养瓶放在转瓶机上，使营养液和培养瓶作相对运动，转瓶转速普通为9~11r/h，使贴壁细胞不始终浸于培养液中，有助于细胞呼吸和物质互换。可在少量培养液中培养大量细胞来增殖病毒，多用于生物制品生产。（3）悬浮培养是通过振荡或转动装置使细胞始终处在分散悬浮于培养液内培养办法，培养瓶不动营养液运动。重要用于某些在振荡或搅拌下能生长繁殖细胞，如生产单克隆抗体杂交瘤细胞。（4）微载体培养微载体是以细小颗粒作为细胞载体，通过搅拌悬浮在培养液内，使细胞在载体表面繁殖成单层一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养长处。五、细胞培养要素（1）培养液不同培养液合用于不同细胞，（2）血清血清中具有细胞生长某些必须氨基酸，尚有增进细胞生长和贴壁成分。因而在细胞培养中必要加入一定量血清方能获得成功。当前国内多用犊牛血清，使用前56℃水浴灭活30min。细胞培养时血清含量为营养液10%，接毒后含量不超过5%。（3）细胞接种量在适当培养条件下，需要有一定量活细胞才干生长繁殖，这是由于细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂物质，若细胞量太少，这些物质分泌量少，细胞生长为单层速度也慢，但细胞过多对细胞生长也不利。（4）PH细胞生长PH值为6.6~7.8，但最适PH值为7.0~7.4。细胞代谢产生各种酸性物质可使PH值下降，因而要使用缓冲能力强培养液。（5）温度细胞培养最适温度应与细胞来源动物体温一致，在此基本上，如升高2~3℃，则对细胞产生不良影响，甚至在24h内死亡。六、细胞培养污染与控制细胞培养污染以微生物污染最常用，化学物污染较少，而细胞交叉污染近几年来随细胞种类增多也有发生。（1）细菌污染多见于消毒不彻底、操作不严格和环境污染所致，体现为营养液不久混浊和PH值下降，随之细胞死亡脱落。（2）真菌污染也与消毒不彻底和操作不严格关于。在培养液中可见白色或黄色小点状悬浮物，镜检时可见菌丝构造。（3）支原体污染支原体在细胞培养中最常用，不适当察觉，危害较大。当前细胞支原体污染率为50%~60%，重要来源于犊牛血清、实验人员、细胞原材料及已污染细胞。当前多用如下办法：①抗生素解决②41℃18h③加入特异性抗支原体高免血清等。这些办法在一定限度上能减少支原体在细胞培养中滴度，但很难彻底清除。（4）病毒污染病毒污染是指细胞培养中浮现非目病毒。其来源有组织带毒和培养液带毒。细胞一旦污染病毒，就很难排除。（5）胶原虫污染在犊牛血清中，有时会发现一种新对细胞培养有害胶原虫，一经污染就难于消除。当前唯一办法是将犊牛血清37℃培养1个月以上，然后高速离心取沉淀物镜检检查胶原虫。第3节细胞增殖病毒技术一、细胞选取病毒须在敏感宿主细胞中增殖，宿主细胞普通选取相应易感动物组织细胞。普通病毒细胞感染谱是通过实验获得，同一病毒在不同敏感细胞增殖后其毒价不尽相似。二、病毒增殖指标与收获细胞接种病毒后，在适当温度下培养，多数病毒在敏感细胞内增殖可引起细胞代谢等方面变化，发生形态变化，即细胞病变，显微镜下重要体现为：①细胞圆缩②细胞聚合③细胞融合形成合胞体④轻微病变。有些病毒在细胞上增殖并不产生CPE，如猪瘟病毒和猪圆环病毒等。普通在CPE达75%左右时收获细胞培养物，低温冷冻保存。三、细胞