线粒体tRNA_Leu_UUR_基因突变糖尿病的基因诊断技术及临床意义

�与临床� 线粒体 tRNALeu(UUR)基因突变糖尿病的基因诊断技术 及临床意义 王战建 � 李红 � 刘宽芝 � 庞建华 � 杨锁印 作者单位: 050051� 石家庄市,河北医科大学第三医院内分泌科 � � 糖尿病的发展是多因素、多基因参与的过程, 目前 普遍认为线粒体 tRNALeu(UUR)基因 nt3243 A�G点突变 糖尿病是一种新亚型[ 1, 2] , 此种基因突变糖尿病在起 病早、消瘦、磺脲类继发失效患者改用胰岛素治疗、有 糖尿病家庭史或伴神经性耳聋的�型糖尿病患者中占 2. 5% ~ 11. 0% [ 3] ;用分子生物学技术可诊断该病。为 更好地对糖尿病进行分型并指导临床治疗, 我们开展 了PCR/Apa �或 PCR/ Hae�基因诊断技术, 用于临床, 线粒体 tRNALeu(UUR)基因nt3243 A�点突变糖尿病进行 基因诊断。现介绍如下: 1 � 研究对象 本院住院 �型糖尿病患者 18例, 男 8 例, 女 10 例;平均年龄( 37. 6 � 9. 2)岁, 糖尿病诊断依据 1985年 WHO。 2 � 材料 2�1� 仪器 � PCR扩增仪一台,电泳仪及垂直电泳槽各 一台,低温高速离心机一台, 台式高速离心机一台, 透 射式紫外线检测仪一台, 摄影装置。 2�2 � 试剂 � ( 1)引物: 100pM/�1 T-Leu-F( 5�-TTC ACA AAG CGC CTT CCC CC-3�) , T-Leu-R ( 5-CCA TTG CGA TTA GAA TGG GTA CA-3�) ; ( 2) 2 mmol/ L dNTP, ( 3) 5U/ �1 Taq聚合酶; ( 4) Apa I 酶; ( 5) N、N、N�、N�-四甲基乙 烯基二胺( TEMED) ; ( 6) 1mg/ ml牛血清白蛋白( BSA) ; (7) 1%二巯基乙醇( BME) ; ( 8) 12%聚丙烯酰胺; ( 9) 10 � PCR缓冲液, 10 � Apa I缓冲液; ( 10) 1 �TBE 电泳缓 冲液( pH8. 3~ 8. 4) ; ( 11) 0. 5%溴乙啶; ( 12)阳性患者 对照 DNA。 3 � 方法 3�1 � 样品处理 � 周围静脉血用常规苯酚/氯仿法提取 DNA,或干血纸片煮沸法提取 DNA。后者具体操作方 法:取静脉血约 100 �l滴于 3mm新华滤纸上, 凉干,置 干净纸袋内 4 � 保存,检测前取 8mm2 干血纸片用剪刀 剪碎, 放于 1. 5ml Eppendorf管内,取双蒸水没于纸面, 浸泡 0. 5 h后,煮沸15 min,冷却后取 10�l煮沸液进行 PCR反应。 3�2 � PCR反应 � PCR反应体系: 10 � PCR缓冲液 5�l, 2mM dNTP 5�l, T-Leu-F ( 100pmo/�l ) 0. 5�l, T- leu-R� ( 100pmol/ �l) 0. 5�l, Taq 聚合酶( 5U/�l ) 0. 3�l, DNA 标 本1 �l( �0. 1 �g)。ddH2O至总体积 50 �l,用石蜡油封 液面, PCR仪进行扩增。程序为: 95 � 5 min后进入循 环,变性94 � 1 min, 退火及延伸 65 � 2min, 30个循环 后, 72 � 延伸 10 min[ 4]。 3�3 � 酶解 � 反应体系: 10 � Apal 缓冲液 4�l, 1 mg/ ml BSA 4�l, 1% BME 1 �l, Apal 酶 40U, PCR 产物 15�l, ddH2O到总体积 40�l;置 37 � 过夜。 3�4 � 12%非变性聚丙烯凝胶电泳, 以 DNA-pGEH-3zf ( + ) Hac�作标准,电压 100V,时间约 4 h。 3�5 � 呈色 � 0. 5%溴乙啶染色 20 min后用透射式紫外 线观察结果,也可以用银染法鉴定,结果照相保留。 4 � 结果 用限制性内切酶 ApaI 酶解后, 线粒体 tR- NALeu(UUR)基因 nt3243 A �G点突变型糖尿病患者可见 206、112及 94bp三个片断[简称 Apa � ( + ) ] ; 无此点 突变者,仅见206片断[简称 Apa � ( - ) ] , 为其他类型 糖尿病患者。 在对 18例糖尿病患者进行的基因诊断实验中,同 时用阳性标本作为对照, 发现 1例阳性结果,排除出现 的污染情况外, 又重复检测两次,仍显示阳性结果。 5 � 讨论 基因突变是基因组分子在结构上发生碱基对组成 或排列顺序改变,它可导致相应的产物功能或结构发 生改变,而使机体致病。线粒体是机体细胞代谢中的 供能者,线粒体 DNA( mtDNA)是人类基因组的重要组 成部分,由于线粒体遗传系统有着与核遗传系统不完 全相同的特点, 即异质性、阈值效应、母系遗传等特 点[ 5] ,因此, mtDNA 单基因突变糖尿病的基因诊断技 术,用于对具有母系遗传史的患者家系进行筛查, 确认 该基因突变者,做出发病前诊断, 便于早期干预治疗, 以延缓发病,更具实用价值。 线粒体 tRNALeu(UUR)基因 nt3243A �G 点突变是线 143河北医药 2000 年 2月第 22 卷第 2 期 � Hebei Medical Journal Feb 2000, Vol. 2, No. 2 粒体单基因突变 �型糖尿病中最常见的一种,此项基 因诊断技术特点为: ( 1)技术较简便; ( 2)省时,在 1~ 2 d内可作出诊断; ( 3)结果易判断。因此适用于临床医 院常规检验,通过基因诊断从 �型糖尿病人中筛查本 突变,从而指导临床医生依据分子病因及发病机理对 糖尿病进行分型和有效防治。 参考文献 1 � Van den Ouweland JMW, Lemkes HHPJ, Ruitenbeek W, et al. Mutation in mitochondrial tRNALeu(UUR) gene a large pedigree with matemal ly ransmitted type � diabetes mellitus and deafness. Nature Genetics, 1992, 1: 368� 2 � Van den Ouweland JMW, Lemkes HHPJ. Trembath RC, et al. Matenally in- herited diadbetes and deafness is a distinct subtype of diabetes and associates w ith a single point mutat ion in the mitochondroal tRNALeu(UUR) gene. Dia- betes, 1994, 43: 746� 3 � 项坤三,王延庆,吴松华等 � 线粒体 tRNALeu(UUR)基因突变糖尿病患 病率估测、临床特点及基因诊断途径 � 中国糖尿病杂志, 1995, 3( 3) : 129� 4 � 陆惠娟,项坤三 �新发现的糖尿病亚型 � 线粒体 tRNALeu(UUR)基因突 变-糖尿病的临床基因诊断技术 � 中华内分泌代谢杂志, 1997, 13 ( 1) : 45� 5 � 左及,张克雄主编� 医学遗传学 �第 1版 �上海:上海医科大学出版 社, 1998�4� (收稿日期: 1999- 04- 5) �诊疗技术� 传统宫内节育器失败后放置吉妮节育器 100例临床观察 冯英丽 � � 为了提高宫内节育器( IUD)的续用率 并减轻副反应,吉妮( GyneFix IN) IUD于近 年应运而生。我院自 1998 年开始引进吉 妮 IUD(天津和杰医疗器械公司生产) , 并 主要用于使用传统 IUD 失败者, 总结如 下。 1 � 资料与方法 1�1 � 对象选择 � 均为我院门诊病例。( 1) 宫腔过大 �8. 50 cm 或宫口松, 传统 IUD 有频脱环史 48 例; ( 2)有带器妊娠史 36 例; ( 3) 有月经过多、月经紊乱、腹痛等症 状取出史 16例。 1�2� 放置时间 � 月经干净后 2~ 7 d 内, 且均排除妊娠的可能, 人工流产、自然流 产等一个月子宫恢复后放置。 1�3� 放置方法 � 常规消毒, 检查子宫大 小及位置, 遇前屈、后屈位子宫尽可能将 其校正为水平位, 准确测量宫腔大小, 术 者左手牵拉宫颈钳, 固定子宫位置 , 右手 平托吉妮放置器, 将其置入宫腔直达宫 底,经临床实践, 认为此时助手协助, 向前 用中等力猛推进放置器后端的手柄, 这 样,放置器内芯的不锈钢针即可把携带吉 妮的固定小结置入宫壁达 0. 8~ 1cm, 取出 手柄及放置器, 距宫口 1. 5~ 2cm 处剪断 尾丝。 2 � 结果 2�1 � 结果 � 使用传统 IUD失败后放置吉 妮 IUD 100例随访 6 个月, 共计终止 2 例, 1例因腹痛于 2 个月取出 (原为带器妊 娠) , 1 例因月经过多、月经紊乱于 5 个月 取出(原为带器月经过多、月经紊乱 ) , 脱 落率及妊娠率均为 0, 6 个月末续用率 98%。 2� 2� 不良反应 � 上环 1 个月内的主诉较 多, 3 个月末时明显减少, 月经过多占 4% ,经期长、周期短占 7% , 不规则出血占 1% ,疼痛占 2% , 6 个月末时以上各项分别 占 1%、2%、1%、1% , 与河北省人民医院 报道的资料相仿[ 1]。因症取出组中出血 主诉(月经过多, 经期长, 周期短, 不规则 出血)所占比例较大, 且延续时间长。 3 � 讨论 3� 1� 使用 IUD的主要影响是使用者的续 用率, 影响续用率的两个主要原因是: 因 脱落和因出血或疼痛而取出[ 2] , IUD 的脱落率,根据世界卫生组织的统计报告 约 5% ~ 20% , 放置后的初 3 个月脱落率 最高[3]。本组选用的病例为既往使用传 统 IUD失败的病例, 在应用吉妮 IUD 后 6 个月末的妊娠率及脱落率为 0, 续用率为 98% ,原因为吉妮 IUD 的特殊形状: 吉妮 是由 6 个铜套组成的, 长 3 cm, 由手术缝 合线串起来, 手术线的一端有一个小结, 用放置器可将此小结置入子宫肌层达 1. 0 cm,此小结起着固定作用。正是由于铜离 子持续释入到宫腔上部, 有效的植入技术 使其能牢固的固定在子宫中, 可随意弯曲 性, 没有支架及占空间少, 使得吉妮具有 低的妊娠率、脱落率和出血少、不影响月 经、无明显腹痛的优点。 3�2� 既往带传统节育器因症取出组 16 例 中因出血主诉 (月经过多、经期长、周期 短,不规则出血)而取出的占 94% , 从本文 统计的不良反应中可以看出, 该组的出血 主诉有比脱环组及带器妊娠组多, 原因可 能为这些人的子宫内膜对铜离子反应敏 感所致,但本组病例在 6 个月末时各项主 诉均降为 1 例, 且症状较以往带传统 IUD 时为轻 , 说明吉妮 IUD 是一种合理、 续用率高、不良反应小、使用安全的新型 宫内节育器, 可接受性强, 尤对既往有脱 环史, 带器妊娠及因症取出史者应首选, 以提高生育质量,减少不必要的人工 流产,值得推广使用。 参考文献 1� 侯建秀、王秀丽,于风华 � 放置 GyneFixIN 宫 内节育器 120例临床观察 � 河北医药, 1999, 21(4) : 311� 2� Thiery M . Intra-uierine contraception in the year 2001. In: Coutraception in the year 2001, PA van keep. edior. Excerpta Medica, Series759, Amster- dam, 1987�141- 158. 3� 王淑贞 � 妇产科理论与实践 � 第 1版 � 上海 科学技术出版社, 1981�835- 838� (收稿日期: 1999- 06- 17) 作者单位: 050011� 石家庄市第一医院 144 河北医药 2000年 2 月第 22卷第 2 期 � Hebei Medical Journal Feb 2000,Vol. 2, No. 2