安徽农业科学,JournalofAnhuiA咖.Sci.2011,39(10):5931—5932 责任编辑赵艳梅责任校对李岩
抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定
李春生1,吴萌1,李君华1,齐颖颖1,李玉静2,闫静辉h
(1.河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;2.河北交通职业技术学院,河北石家庄050035)
摘要[目的]制备特异性抗沙丁胺醇单克隆抗体,为其免疫学检测
的建立奠定基础。[方法]用SAL-BSA抗原免疫BALB/c小鼠;
使用细胞融合技术建立抗SAL的单克隆抗体(SALmAh)杂交瘤细胞株;体内诱生腹水法制备sALmAb。并鉴定其免疫学特性。[结果]
筛选出2I)9和lC4两株杂交瘤细胞。其细胞培养上清效价达l:104,腹水效价达1:10。;免疫球蛋白亚型鉴定为IgG。;抗体对SAL的半数
抑制浓度(IC。)为1.14ng/nd;与沙丁胺醇和盐酸克伦特罗的交叉反应率(CR)分别为100.00%和26.09%,与其他化舍物无交叉反应。
[结论]获得了高效价、敏感且异性的抗SAL抗体,为沙丁胺醇残留的免疫学检测方法的建立奠定了基础。
关键词沙丁胺醇;杂交瘤;单克隆抗体
中图分类号$851.34+7文献标识码A 文章编号0517—66ll(2011)10—05931—02
PreparationandIdentificationofMonocionalAntibodiesagainstSallmtamol
LIChun·shengetal(BiologyInstitute,HebeiAcademyofScience,Shijiazhuang,Hebei050081)
Abstract[Objective]Topreparespecificmonoclonalantibodiesagainstsalbutamolandthustoprovidethebasisfortheimmunologicaldetec-
fion.【Method]BAIB/CmicewereimmunizedwithSAL-BSA.Hybridomalines(SALmAb)secretingmonoclonalantibodyagainstSALweree8-
tablishedthroughcellfusion.Ascitesof卧LLmAbwereprepared加v/voandtheimmunologicalcharacteristicswereobserved.[Result]Twohybri.
domalines,2D9andlc4,wereestablished,andtheindirectEUSAtitersofthecellsupematantandasciteswere1:l×104andl:1×106,respec.
tively.TheirisotypewasIgGI.11lemedianinhibitoryconcentration(IC蜘)oftheSALmAbagainstSALWaS1.14ng/=d.Ithadcm够一reactivityof
100.00%againstsalbutamoland26.09%againstclenobuterolhydrochloride.andnocross—reactionwasfoundbetweentheSALmAbandother
compounds.[Conclusion]‰hi#一titer,semitiveandspecificanti—SALmonoclonalantibodieshavebeenproduced,whichmakesitpossibletO
developimmunoassayfordetectionofSALresidues.
Keywords$albutamo;Hybridomns;Monoclonalantibody
、。
沙丁胺醇(salbutamol,SAL),又名舒喘宁,为选择性B2
受体激动剂。对动物具有促进骨骼肌(瘦肉)生长,减少脂肪
蓄积等作用。常在猪、牛、鸡等畜禽的生产中非法用作促生
长剂,可提高饲料转化率、增加瘦肉产量。但是,食品中沙丁
胺醇的残留能引起心悸、头疼、目眩、呼吸困难,严重影响人
们的健康¨J。另外,检测沙丁胺醇残留的技术手段也相对滞
后。因此,一些不法分子为谋取经济利益,在养殖场非法使
用沙丁胺醇代替“瘦肉精”克伦特罗作为促生长剂旧。1。
目前,检测沙丁胺醇的方法有气相色谱一质谱联用法
(GC·MS)、)高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法
(LC.MS)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等p⋯。GC.MS、
HPLC和LC.MS方法准确可靠,但前处理繁琐,对仪器设备
以及操作过程的要求较高,不适于生产、基层单位及现场检
测。ELISA检测是一种基于抗原抗体反应和酶化学反应的
检测方法,具有快速、灵敏、操作简单和一次检测样品量大的
特点,而且不需要复杂昂贵的的仪器设备,对操作者的专业
要求也比较低¨川J。
1材料与方法
1.1试验动物8周龄BALB/e小鼠由河北实验动物中心
提供。
1.2主要试剂和仪器小鼠SP2/0骨髓瘤细胞、免疫原
SAL广BSA和检测原SAL-OVA(卵清蛋白)由河北省科学院生
物研究所细胞生化研究室保存和制备。HAT培养基、HT培
养基、PEG4000、福氏完全佐剂和不完全佐剂以及小鼠单克隆
基金项目
作者简介
收稿日期
河北省科技支撑计划项目(09227134D);石家庄市科技支撑
计划项目(10150142A)。
孛春生(1981一),男,河北平采人,助理研究员,硕士,从事
抗体应用研究,E—mail:hebeiswjc@sina.eom。·通讯作者。
E—mail:yanjinghui@126.corn。
20ll旬l—ll
抗体亚型鉴定试剂盒均购自Sigma公司;DMEM培养基和细
胞培养板购自GIBCO公司;HRP标记羊抗小鼠I如购自北
京中杉金桥生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。
1.3动物免疫选择8周龄BALB/c小鼠,初次基础免疫采
用颈背部皮下多点注射福氏完全佐剂与等体积免疫原SAL-
BSA;二次基础免疫采用颈背部皮下多点注射福氏不完全佐
剂与等体积免疫原SAL-BSA。免疫间隔为2周。断尾取血
分离血清,间接EHSA检测小鼠血清抗体效价。选取最佳免
疫小鼠,于融合前3d腹腔注射免疫原50嵋加强免疫。
1.4杂交瘤细胞株的建立悼o①细胞融合。取对数生长
期的小鼠SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞,按常规方法进行
融合。②阳性细胞克隆。检测培养上清抗体效价。选择强阳
性细胞进行克隆,采用有限稀释法连续亚克隆,直至100%阳
性。得到稳定分泌高特异性、高效价、高亲和力抗体的杂交
瘤细胞株,保存于液氮中。
1.5单克隆抗体的制备及其效价和亚型检测将克隆及扩大
培养的杂交瘤细胞注入提前致敏的BALB/c小鼠腹腔,诱生腹
水产生抗SAL单克隆抗体。收集3—9ml腹水进行抗体的纯
化,采用SDS-PAGE法检测抗体纯度睁枷1,并用凝胶成像系统
进行分析;采用紫外吸收法测定抗体浓度;采用间接ELISA法
测定抗体效价;使用抗体亚型试剂盒鉴定抗体亚型。
1.6抗体敏感性与特异性测定采用阻断ELISA法测定抗
SAL单克隆抗体的敏感性和特异性。以吸光率B/B0(B为
SAL不同
浓度下的A蜘值;B。为SAL标准浓度的A椭
值)为纵坐标,以不同浓度SAL的对数值为横坐标,绘制标准
抑制曲线,根据IC∞判定抗体敏感性。检测抗SAL单克隆抗
体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、异丙肾上腺素和
去甲肾上腺素的交叉反应性,根据交叉反应率(Cross舢.
don,CR)判定抗SAL单克隆抗体的特异性。
万方数据
安徽农业科学 2011生
CR=(沙丁胺醇的IC铂/各结构类似物的IC∞)×100%
(1)
2结果与分析
2.1小鼠杂交瘤细胞株的建立小鼠血清抗体效价检测结
果
明,小鼠的免疫效果较好,抗体效价均达到了l:103一l:
104,IC∞最低为270I∥“。选择免疫效果最好(抗体效价为
l:2.56X104)的小鼠用于细胞融合,平均每孔有1—2株融合
细胞生长,融合率为100%。经阳性细胞克隆后,获得6株杂
交瘤细胞,分别测定其IC柏,筛选出2株高效价、敏感、特异的
杂交瘤,分别命名为2D9和IC4。
2.2抗体的制备及纯化将筛选得到的2139和1C4杂交瘤
细胞分别注射到成年BALB/c小鼠腹腔,收集腹水,经蛋白
纯化后,获得蛋白含量为3.6me/.a,纯度达78%一86%。经
间接EHSA效价检测,2D9杂交瘤细胞株的细胞培养上清液
和腹水抗体效价分别为l:2.56X104和l:4.096×106;1C4杂
交瘤细胞株的细胞培养上清液和腹水抗体效价分别为l:
1.28X104和l:2.048×106。经抗体亚型鉴定,2139和1CA细
胞株所分泌的抗体均为IgG。。
裹1 SAt,mAb的间接ELISA效价
TabIel IndirectELISAliterofanti-SALmAb
杂交瘤细胞株 细胞培养上清液 腹水
生堕垫竺型塑 型竺塑丝型丝堕
2139 l:2.56×104 l:4.096×10‘
lCA 1:1.28X10' 1:2.048×106
2.3抗体敏感性根据吸光率和不同浓度SAL的对数值所
绘制标准抑制回归曲线(图1)。曲线回归方程为Y=
一32.595x+48.1(r=0.9841),,c∞为1.14ng/“,表明抗
SAL单克隆抗体对SAL具有较高的敏感性。
肆芒
薹_:耋-
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聋昌
≥
坞。【s^L妇咖1)】
圈1抗SAL单克隆抗体的标准抑制回归曲线
啦.1 ICm-basedregresaon删ofSAILmAbdeterminedby
blockingELISA
裹2抗SAL单克隆抗体与SAIL及其类似物的交叉反应性
Table2 C嗍.realitybeCwemSAILmAbamiSALmmiogo嵋。嘶
pounds
当Uo厶物mPound.s 陀。∥形d 交叉Uroe竺si'删率.1鬈Vlt%y-
沙丁胺醇Salbutamol 1.14 100.00
盐酸克伦特罗Clenhuterol4.37 26.09
莱克多巴胺 2.00×104 <0.Ol
Bactopamine
异丙肾上腺素 2.00X10' <0.Ol
Isoproterenol
去甲肾卜腺素 2.(30x104 <0.Ol
!!塑!Pi堡eb巫堡
2.4抗体特异性抗SAL单克隆抗体对盐酸克伦特罗有
26.09%的交叉反应性,对莱克多巴胺等其他肾上腺激素类
无交叉反应,说明所制备的抗SAL单克隆抗体具有很高的特
异性(表2)。
3结论与讨论
单克隆抗体的交叉反应性表示单抗与竞争结合物的结
构特异性,是揭示类似化合物与其交叉的重要化学参数。制
备的抗SAL单克隆抗体除对沙丁胺醇具有特异性反应外,还
对盐酸克伦特罗有一定的交叉反应,这可能是由于在抗原合
成过程中,沙丁胺醇产生了与盐酸克伦特罗相似的化学结
构。也有文献曾报道,制备的抗SAL抗体对盐酸克伦特罗都
有较高的抑制率¨卜12】。该研究中,抗SAL抗体对盐酸克伦
特罗的抑制效果不是很明显。抑制率为26.09%。因此,可通
过进一步优化来消除对盐酸克伦特罗的抑制效果。
免疫学方法具有灵敏度高、过程简单和分析速度快等优
点,可作为首筛法对大量样品进行快速筛选分析,再将疑似
阳性样品使用确证分析法进行确证,这样可以降低大批量样
品的分析成本并提高分析效率。沙丁胺醇为小分子物质,将
其连接到大分子蛋白载体上,借助载体蛋白的T细胞表位间
接诱导B细胞激活、分化与增殖,从而产生特异性抗体。抗
小分子物质抗体的免疫学特性主要体现在抗原抗体反应的
结合容量、敏感性和特异性。笔者制备的抗SAL单克隆抗体
效价达到了l:106,其敏感性(IC卯)为1.14ng/ml,且对SAL
具有较强的识别能力,与克伦特罗的交叉反应率为26.09%。
与其他化合物均无交叉反应。因此,通过该研究获得了高效
价、敏感、异性的抗SAL抗体,为沙丁胺醇残留免疫检测方法
的建立奠定了基础。
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∞加∞∞柏如加m
0叱
万方数据
抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定
作者: 李春生, 吴萌, 李君华, 齐颖颖, 李玉静, 闫静辉
作者单位: 李春生,吴萌,李君华,齐颖颖,闫静辉(河北省科学院生物研究所,河北石家庄,050081), 李
玉静(河北交通职业技术学院,河北石家庄,050035)
刊名: 安徽农业科学
英文刊名: JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES
年,卷(期): 2011,39(10)
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