TaqMan-MGB探针检测骨髓增殖性疾病患者JAK2V617F突变
TaqMan-MGB探针检测骨髓增殖性疾病患
者JAK2V617F突变
!生!旦7卷第34期NadMedJChina,September11.2007.Vo187.Nn34
TaqMan—MGB探针检测骨髓增殖性
疾病患者JAK2V617F突变
阮国瑞陈珊珊李玲娣刘艳荣秦亚溱李金兰
马曦王峰蓉江倩江滨刘开彦黄晓军
【摘要】目的建立实时定量PCR检测骨髓增殖性疾病(MPD)患者JAK2V617F突变的方法.
方法利用TaqMan—MGB探针,检测MPD患者JAK2V617F突变,部分标本用等位基因特异的定性
PCR及测序的方法同时进行验证.结果374份患者和对照的骨髓或外周血标本被用于JAK2
V617F突变
.其中76例PV,115例ET和19例MF患者JAK2V617F突变的检出率分别为70%,
51%及58%;65例急性髓性白血病中仅1例为阳性,而38例慢性髓性白血病,30例急性淋巴细胞白
血病,8例慢性淋巴细胞白血病,7例非霍奇金淋巴瘤及16例正常供者骨髓细胞中的检出率均为0.
结论JAK2V617F突变在我国MPD患者中是广泛存在的.利用TaqMan—MGB探针进行实时定量
PCR的方法可快速,准确地检测JAK2V617F突变.
【关键词】骨髓增殖性疾病;JAK2;突变;聚合酶链反应
DetectionofJAK2V617Fmutationinpatien~withmyeloproliferativedisorderswithTaqM
an.MGB
probeRUANGuo—mi,CHENshnn—shan,LIng一出,HUYan—rong,QINIra—
zhen,LIfin—lan,MAXi,
WANGFeng—rong,JIANGQian,JIANGBin,HUKai—
yan,HUANGXiao-jun.PekingUniversityInstituteof
HematologyandPeopletsHospita1.BetnglO0o44China
【Abstract】
0bjectiveTodevelopanovelplatformfordetectionoftheJAK2V617Fmutationin patientswithmyeloproliferativedisorders(MPD)byreal—
timequantitativePCR,MethodsTaqMan—MGB
probewasconstructed.Peripheralbloodsampleswerecollectedfrom374MPDpatients.76with
polycythemiavera(PV),38withchronicmyelogenousleukemia(CML),and115withessential
thrombocythemia(ET),and19withidiopathicmyelofibrosis(IMF).Peripheralbloodsamplesfrom65
patientswithacutemyelogenousleukemia(AML),30patientswithacutelymphoblasticleukemia,8
patientswithchroniclymphoblasticleukemia.and7patientswithnon—
Hodgkinslymphomaand16casesof
normaldonorbonemarrowwereusedascontrols.GenomicDNAorRNAwasextractedandreversely
transcrtibedintocDNA.TaqMan—
MGBprobewasusedtodetecttheJAl(2V617FmutantinMPD,
Furthermore.168specimensunderwentallelespecificPCRand8specimensunderwentsequencing.This
methodwasusedonbothDNAandcDNAspecimensfrom38MPDpatientssimultaneouslysoastotestthe
consistency.ResultsTheJAl(2v617FmutationratesofthePV,ET,andIMFpatientswere53(70%),
59(51%),(58%)respectively.JAl(2V617Fmutationwasfoundinonlyoneofthe65AMLpatientsand
wasnotidentifiedinothercontrolspecimens.BoththeresultsofallelespecificPCRandofseq
uencingwere
consistentwiththeresultofTaqMan—MGBprobemethod.ConclusionJAK2V617Fmutationiswidespread
inChineseMPDpatients.Real—timequantitativePCRwithTaqManMGBprobecanbeusedforrapidand
accuratedetectionoftheJAl(2V617Fmutation. 【Keywords】Myeloproliferativedisorders;JAK2;Mutation;PolymeraseChainReaction
骨髓增殖性疾病(MPD)是一组由一种或多种
血细胞成分异常增殖所致的疾病.四种主要的
MPD分别为慢性髓性白血病(CML),真性红细胞增
多症(PV),原发性血小板增多症(ET)和原发性骨
髓纤维化(IMF).其中,95%以上的CML患者存在
BCR/ABL融合基因,PCR—BCR/ABL检测已成为用于
作者单位:100044北京大学人民医院血液病研究所(阮国瑞,陈
珊珊,李玲娣,刘艳荣,秦亚溱,李金兰,王峰蓉,江倩,江滨,刘开彦,
黄晓军),北京大学疾病基因研究中心(马曦)
?
240l?
.
临床研究.
CML诊断的常规项目,而其余3种MPD分别是影响
红细胞系,巨核细胞系及骨髓微环境的恶性肿瘤,长
期以来,未发现特异的分子诊断标志.2005年,
有关MPD发病机理研究的主要进展是发现部分
PV,IMF和ET患者具有JAK2(Januskinase2)
V617F突变,JAK2核苷酸1849位上G突变为T,导
致在JAK2的假激酶域中第617位密码子的氨基酸
残基由缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F),即
JAK2V617F,该突变是造血前体细胞中的体细胞突 变,它介导激活JAK/STAT途径,进而导致细胞异常
!生!月11日第87卷第34期Nat]MedJChina 增殖?.这一发现,不仅使快速,可靠诊断MPD成 为可能,而且可针对突变型JAK2开发出与甲磺酸 伊马替尼类似的新的靶向疗法,将为MPD提供一种 新的治疗方法.我们建立了TaqMan—MGB探针 (TaqManMinorGrooveBinderProbe.TaqMan—MGB 探针)检测JAK2V617F突变的方法,并对MPD患者 进行了检测.
对象与方法
,
,研究对象
成人MPD患者248例,其中PV76例,ET115 例,MF19例,CML38例(均为BCR/ABL融合基 因阳性),急性髓性白血病(AML)65例,急性淋巴细 胞白血病(ALL)30例,慢性淋巴细胞白血病(CLL) 8例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)7例及正常供者骨髓 (NDM)16例,诊断标准依据世界卫生组织新的分型 标准.本试验经本院伦理委员会批准,患者骨髓穿 刺前签署知情同意书.
二,方法
1.待测样品基因组DNA及cDNA制备: JAK2V617F纯合突变基因型rrI'阳性对照HEL细 胞及野生基因型GG对照K562细胞,为本室保存, 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(美国 GIBCO公司)在5%CO:孵箱中常规大量培养,取对
数生长期细胞用于DNA或RNA提取.患者及正常 骨髓移植供者的骨髓或外周血标本,参照DNAzol或 TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书在无菌 条件下提取基因组DNA或RNA,方法为:用 NaEDTA抗凝,用淋巴细胞分层液(相对密度1.077 g/L,上海华精高科技有限公司)分离出单个核细 胞,将分离出的单个核细胞及用常规方法培养的 HEL(纯合突变阳性对照细胞),K562细胞系细胞 (阴性对照细胞)用生理盐水洗涤2次后,加人60O txlDNAzol试剂,或1mlTRIz0l试剂,参照试剂盒说 明提取DNA或RNA,RNA按本室常规逆转录成 cDNAE.
2.PCR扩增:根据JAK2的基因组基因及cDNA 中包含第617位氨基酸残基(野生型为缬氨酸, JAK2V617F突变体为苯丙氨酸)编码序列的基因序 列(野生型JAl(2基因的GenBank号:NT_008413;野 生型JAK2基因cDNA的GenBank号:NM_004972, JAK2V617F突变基因是将野生型基因自5端第617 位的缬氨酸的密码子GTC突变为苯丙氨酸的密码 子TI'C)及其反向互补序列用PrimerExpress Software2.0软件分别设计一对PCR引物,同时根 据野生型JAK2激酶基因及JAK2激酶JAK2V617F 突变基因的反向互补序列设计2条TaqMan—MGB探 针,将2条TaqMan—MGB探针的5端分别标记报告 荧光基团FAM(蓝色荧光)和VIC(绿色荧光),3端 标记不发光的淬灭基团,并连接二氢环化吲哚卟啉一 三肽(DPI3),引物,TaqMan—MGB探针序列及其解链 温度和GC含量见
1.2.
表1检测JAK2V617F突变的引物,探针序列及其
解链温度和GC含量(DNA)
引物和探针序列长度解
(T
链
mG手
表2检测JAK2V617F突变的引物,探针序列及其 解链温度和GC含量(cDNA)
引物和探针序列长度解
(T
链
m
c,c
(%
~
)
i
以提取的DNA或cDNA为
,在相应引物及 探针的引导下,用ABI7500实时荧光定量PCR仪 (美国应用生物系统公司)进行PCR扩增,并按等位 基因鉴别实验操作步骤(具体方法参见美国应用生 物系统公司7300/7500实时定量PCR仪人门指南) 完成并分析.其中,PCR反应体系为:1×TaqMan@ 通用PCR扩增预混试剂(购自美国应用生物系统公 司),上,下游引物各400nmol/L,荧光标记的2条 TaqMan—MGB探针各200nmol/L,150ngDNA.PCR
反应条件为:先50oC2min;然后95?10min;最后 95?15S,60oC1min,共40个循环.
3.等位基因特异引物定性PCR检测:参见文献 [1].突变基因特异上游引物:5AGCATIq'GGTI'IT
AAATI'ATGGAGTATAITr3;上游弓I物:5ATCTAT AGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG3;]游弓I物:5
中华医学杂志2007年9月l1日第87卷第34期
NatlMedJChina,Septemberl1.2007.Vol87.No.34
CTGAATAGTCCTACAGTI'I'I'rCAG,I'I'I'CA3,扩增 产物按本室常规进行电泳,银染.部分标本扩增产 物由上海基康生物技术有限公司在ABI3700DNA 分析仪上完成测序工作.
4.用于定量检测JAK2V617F突变的标准曲线 的制备J:阳性对照HEL细胞的DNA依次用野生 基因型K562细胞的DNA稀释为80%,40%,20%, 10%,5%的比例,每梯度重复3—5管进行扩增,以 其相应的平均ACt(CtJAK2V617F突变一CtJAK2野 生)做6次标准曲线,测试样本的平均ACt代入标 准曲线方程可计算出测试样本的突变基因百分比 (JAK2V617F突变/JAK2总),相关系数均大于
0.99.
5.检测JAK2V617F突变方法的灵敏度测定:
将纯合突变基因型HEL细胞的DNA用野生基因型 K562细胞的DNA依次稀释为2.5%,1.25%, 0.6%,0.3%,0.16%,0.0001%【T/(G+T)l的比
例,按上述相同方法进行检测.
结果
1.JAK2V617F突变在MPD患者的检出率:76 例PV,115例ET,19例MF患者中JAK2V617F突变 bp
JAK2V617F
203
12
24O3
表3JAK2V617F突变在各型恶性血液病和正常供者 骨髓中的检出情况(DNA+cDNA)
的检出率分别为70%,51%及58%(表3).其中
168份DNA标本用等位基因特异引物同时进行定
性PCR检测,检测结果的一致率达100%.图1显
示了其中17例的电泳结果.对其中8例标本测序
的结果,与以上两种方法的检测结果一致,图2A一
2F显示了其中6例的测序图.此外,对其中38例
MPD患者的DNA及cDNA标本同时用本方法进行 检测,检测结果一致.上述检测结果表明用实时定
量TaqMan—MGB探针方法可对JAK2V617F突变进 行检测,结果准确.
2.定量PCR检测JAK2V617F突变:定量检测
JAK2V617F突变的标准曲线方程为Y=一0.083x+ M567891011M12131415161718M1920 髫一-_一---;
图1等位基因特异引物定性PCR检测方法验证JAK2V617F突变泳道M为
100,200,300,40O,500,600,700,800,900,1000,1500bp
的DNA标准参考物,泳道18为空白对照,泳道1,2,4,5,7,14,15,16,17,19为扩增出的
203bp的含JAK2V617F突变的条带,其中19,
20分别是阳性对照HEL细胞及阴性对照K562细胞 cc^c^
'.
^c?c^T^cT.cc^c^G^':.^c^T^cTcc^c1^3.G^^^c^T^c1T4.c^c^G^i.?c^T^cTc
({T0?
cc^c^6^c^c:oT^cTcc^c:oG^c^c?T^c}o
@@
图2A,2F测序方法验证JAK2V617F突变2A,
2D.JAK2V617F突变阳性标本,在自氨基端第617位氨基酸残 基处可见硷基G及T双峰;2E,2F.JAK2野生型基因型GG,即 阴性标本
避
,
警?
医堂盍7年9月11日第87卷第34期
NatlMedJChina.September11.2007.V0187.N0.34
0.1295,相关系数r=0.999,其中y代表不同的突变
基因百分比,x代表平均ACt(CtJAK2V617F突变一 CtJAK2野生),对上述JAK2V617F突变阳性的MPD 患者的结果根据上述标准曲线计算其突变基因百分 比(JAK2V617F突变/JAK2总),结果平均值为
20.58%?19.33%.
3.定量PCR检测JAK2V617F突变的方法可信
性分析:同一批PCR实验中不同稀释度(阳性对照
HEL细胞的DNA依次用野生基因型K562细胞的 DNA分别稀释为40%,5%,2.5%)做5个平行管,
突变基因T扩增的平均ct值分别为23.57,26.61, 27.60,变异系数分别为1.89%,2.10%,1.93%,野
生基因G扩增的平均ct值分别为26.94,25.43, 25.05,变异系数分别为2.29%,3.60%,1.74%. 不同批PCR实验中不同稀释度(分别为40%,
5%,2.5%)做10批PCR实验,突变基因T扩增的
平均ct值分别为23.17,26.76,27.91,变异系数分
别为2.64%,2.53%,2.69%,野生基因G扩增的平
均ct值分别为26.51,25.76,25.19,变异系数分别
为3.87%,4.17%,1.22%.TaqMan—MGB探针检测
JAK2V617F突变的灵敏度测定结果,在2.5%, 1.25%,0.6%梯度均可检出基因型G和T的扩增 曲线,表明本方法的检测灵敏度可达0.6%. 讨论
虽然发现MPD这种疾病有近100年的历史,但 其病因仍然不十分清楚,I临床没有可称为金标准的 诊断方法,也没有公认的最佳治疗
.近一年 来,有关MPD发病机理研究的主要进展是发现 80%左右PV,50%左右IMF和50%左右ET患者 JAK2基因中存在一个点突变,导致617位氨基酸残 基由缬氨酸(V)变为苯丙氨酸(F).我们利用 TaqMan—MGB探针对374份(其中MPD患者248 例)骨髓或外周血标本进行了检测,该突变的检出 率,与国外文献报道的西方患者的结果相近.其中 168份DNA标本用等位基因特异引物同时进行定性 PCR检测,检测结果的一致率达100%,对其中8例标 本测序的结果,与以上两种方法的检测结果一致. 我们根据野生型JAK2激酶基因及其
JAK2V617F突变基因的反向互补序列设计2条 TaqMan—MGB探针,探针的5端分别标记报告荧光 基团FAM(蓝色荧光)和VIC(绿色荧光),这对探 针可分别与我们设计的JAK2的基因组基因及 eDNA上的引物对一起在一管中完成对野生型 JAK2激酶基因及其JAK2V617F突变基因的扩增鉴 定.本组对38例患者的DNA及其eDNA标本同时 进行了检测,定性检测结果是一致的.
利用报告荧光基团FAM和VIC分别标记野生 型及突变型JAK2激酶基因,实现2条TaqMan—MGB探 针在一管中分别扩增仅一个硷基差别的野生型及突变
型JAK2激酶基因,充分利用了TaqMan—MGB探针更强
的序列特异性的特点,简化了实验步骤,实验结果准
确,且既能对DNA也能对eDNA标本进行检测.
我们进一步检测JAK2V617F突变基因百分比
(JAK2V617F突变/JAK2总),结果平均值为
20.58%?19.33%.重复做上述标准曲线6次,每
次相关系数均大于0.99.同一批及不同批PCR实
验中不同稀释度的突变基因及野生基因扩增的平均
ct值的变异系数均小于5%.这说明利用TaqMan—
MGB探针检测JAK2V617F突变是一种快速,可靠
的方法,且可进一步提供突变基因与野生基因的比
值,为疗效观察,微小残留病的动态观察提供依据,
将在MPD诊断及白血病鉴别诊断中发挥重要作用.
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(收稿日期:2007-02-13)
(本文编辑:苗蔚)