脓毒症小鼠肝窦内皮细胞细胞因子的基因表达

脓毒症小鼠肝窦内皮细胞细胞因子的基因表达 脓毒症小鼠肝窦内皮细胞细胞因子的基因 表达 z,一5 第9卷第1期 2000年1月 中国普通外科杂志 CkamseJournal0fGeneralSurgery .934o.1 JBn2000 文章编号:lOO5-(~7(2o0o)o]一0032-03 脓毒症小鼠肝窦内皮细胞细胞因子的 基因表达 苎墨,堂,宋旭华,孟宪钧 '解放军总医院普外科研宽所,北京100853) I}/ 摘要:目的探讨肝窦内皮细胞细胞因子表达在脓毒症小鼠肝损伤中的作用.方涪 采用盲肠结扎穿孔(cLP)制造小鼠脓毒症模型,假手术组(Sham)接受同样的手术操作但不 行cLP.分别在致伤后3,12h分离肝窦内皮细胞,用RT—PcR的方法定量检测肝窦内皮细 胞中肿瘤坏死因子a(TRF.a),白细胞介紊1p(IL.1P)及l白细胞介紊6(IL-'6)的基因表达.结 果肝窦内皮细胞TNF.d,IL.1日基因表达在cLP后3h即明显增高,至12h时虽有所降低但 仍明显高于Sham组;IL.6基因的表达在cLP后3h明显增高,至cLP后12h仍维持在高水 平 紊6 结论肝窦内皮细胞是脓毒症时肝组织中细胞因子的重要来源之一. 关键词:!喜至墨焦兰;荸嵝苎里于;白细胞介素1.白细胞介 删荔』….,;文献标识 Cytokinegenesexpressionofhepaticsinusoidaiendothelialinmice withsepsis wuRong—qi?,xuYh1g—xin,SONGXu—busmadMENG)(i??j (Int~ge盈,臌甲P/A,&曙100853,Odna) At瑚d:ObJeonveToinve~llgatetherole0fyt0嘲genesleBBi?ofliv口8ir.1】s0id日lendothelial cellsinliver由m日ebyBe】.Methodswaeemodels9,rCl~establishedwithcecalh?andpeso- raedca~(CLP),-~dlileBl1aII.opemticaa卿receivedthesemaep10cedIexclusiveCLP.Theexpressloo ofT[~FR,IL.1日aI.dIL.6inliversirm0idend~helialcellsIe~ssessedbyRT—PcR.ResultsA日删一 icsmincrease0f隅,IL一1口genes既舯wasol~rveda【3h,andadeclinea【12h面erol~ra一 ,butstill响6cylg}thanthst缸theBl1aII.ro;whileIL一6gene~pressions}唧肥dsig~eamly hi?at3handrefinedatthehighlevelat12h.cbndI葛I啷Liversinmoidslendothelial.e?isartiIn— p.TlaIltsourc~0fcyhIlepix~duetleninn南ewith啦 K町wot'ds:9trl~ssYND鼢正,gem;c盹DE鼢0N;~UMORNE黜FACIOR;L'ClERIZ'UKIN.I;lN. m一6:n? CIA2number:R593211R730.3:R39212Documentcode:A 脓毒症及其并发的多器官功能不全 收稿日期:1999.1I.04;修订日期:l999一l2-2l 基金项目:国家自然科学基金资助f39870796) 作者简介:黑荣谦(1971.),男,湖北武汉^,解放军总医 院普通外科研究所助理研究员,博士.从事脓毒血症,MOD5等 方面研究. ? 基础研究? (MODS)一直是外科ICU的首要死因.目前对 其发病机制尚未完全清楚,但一般认为它的发 生与机体免疫炎症反应密切相关,是过度炎症 反应与代偿性抗炎症反应之间对比失衡的结 果.在对炎症反应的启动者细菌内毒素,炎 症效应细胞(粒细胞,巨噬细胞)进行了大量的 第1期吴荣谦,等:腋毒症小鼠肝宴内皮细胞细胞因子的基因表造 研究之后,内皮细胞作为炎症反应的另一重要 参与者,近年来颇受重视.内皮细胞已不再 被认为仅仅是MODS发生时受损的靶细胞,而是 炎症反应和继发器官损伤的积极参与者.目前 对内皮细胞的研究多是通过体外培养方法进 行,但体外与体内毕竟存在差异.本研究采用 制造小鼠脓毒症模型后直接分离肝窦内皮细 胞,在不同时相对肝窦内皮细胞促炎细胞因子 TNF.a,IL,1B和IL.6的基因表达进行动态观察 和比较,以期为MODS的防治提出可能的新途 径. 1材料与方法 1.1脓毒症模型制作 选用雄性昆明小鼠.体重18,22g,由解放 军总医院实验动物中心提供.随机分为2组: 盲肠结扎穿孔组(cecalligationandperforation,CLP 组)和假手术组(Shmn组),每组各12只.设2个时 间点(3,12h)取肝组织标本,每时间点6只. 1.2肝窦内皮细胞分离 按Bract等的方法稍加修改分离肝窦内皮 细胞,主要步骤如下:肝脏经门静脉灌注,胶原 酶消化后,以percoll梯度离心及选择性贴壁纯 化肝窦内皮细胞.细胞计数,调整细胞浓度至1 x1/ml.分离所得的细胞经台盼兰染色检测 其存活率,并经?因子相关抗原染色,流式细胞 仪检测,测定其纯度. 1.3细胞因子表达检测 采用异硫氰酸胍,步法提取肝窦内皮细胞 中的总RNA,紫外分光光度计定量,取1vgRNA 在逆转录酶的作用下台成cDNA.以Baetin或 岛.MG为内对照基因扩增细胞因子基因.所用 引物序列如下:B.in(478hp):5'AGGGAAATC GIGCGTGACA1,CAAA3'.5'ACTCT'^CGTACT cCTGcrTGCTGA3';岛.MG(300bp):5'C,C,C T?GCI?CGTGACCCTAGTCrrT3',5' GCAGGCGTAT凹【?AGTCTCA3';TNF一时(349 bD):5'T1CTGTCCCT1Tc^C3EACTGG3',5 'TIGGTGGTY3T,CTACGACGTGG3';IL.1B (441bp):5'ATrAGACAGC'TGCACTACAGG CrC3'.5'AGATrcCATG研GAb.CTcAATTAT 3';IL一6(156bp):5'TGGAGTCACAGAAGGAGT C,C,CTAAG3'.5'TCTGACCACAGTGAGGAA TGTCCAC3'.PCR反应体系为25,反应条 件:95?变性5min后,按94?30s,55?30s, 72?90s,扩增30个循环,最后72?延伸 10rain.取PCR反应产物10在1.5%琼脂糖 凝胶中电泳,用pBR322/HI做分子量来 判断PCR产物片断大小,EB染色,紫外灯下观 察并照相.底片在密度扫描仪上定量,以目的 基因扩增量,内对照基因扩增量表示所要检测 基因的表达量. 1.4统计学处理 所有数据均以平均值?标准差(i?s)表 示,用t检验进行统计学分析,以P<0.05为 统计学差异显着. 2结果 2.1肝窦内皮细胞鉴定,纯度及存活率 分离所得的肝窦内皮细胞经台盼兰染色显 示其存活率大于90%,经?因子相关抗原染色,流式细胞仪检测,显示?因子相关抗原阳性细 胞比例大于85%. 2.2肝窦内皮细胞细胞因子基因表达 TNF—a,IL.1B基因表达在CLP后3h即明显 增高,至12h时虽有所降低但仍明显高于Sham 组;IL一6基因的表达在CLP后3h明显增高,至 CLP后12h仍维持在高水平(附表). 附表肝窦内皮细胞细胞因子基因表达(?s) 中国普通外科杂志第9卷 3讨论 在脓毒症并发的多器官损伤中,肝脏常受 累.我们早在20世纪80年代就发现在低灌 流,脓毒症等状态下,肝脏的能量代谢障碍发生 最早,程度最重,并且与MODS时肺,肾等器官的 功能衰竭密切相关.因此研究脓毒症并发肝 损伤的机制具有十分重要的意义. 细胞因子是一类由活化的免疫细胞和某些 基质细胞分泌的小分子多肽.确立细胞因子在 MODS发生中的作用是对MODS发生机制1次认 识的深化和观念的更新,它将人们的注意力由 外源性的刺激因素转移至机体自身的反应.各 种急慢性疾病,多种原因均可导致机体细胞因 子的产生.细胞因子本是机体正常防御反应的 重要参与成分,但当刺激过于强烈细胞因子产 生过度时,它们又可产生广泛的损伤作用,是 脓毒症并发远隔器官损伤的重要参与者. 关于MOLDS时细胞因子的来源,一般认为主 要是来自过度激活的巨噬细胞.近年来随着 对内皮细胞免疫功能研究的深人,发现内皮细 胞也可以分泌多种细胞因子,但少有研究涉及 内皮细胞源性细胞因子在MODS中的作用.本 研究在制作小鼠脓毒症模型后,直接分离肝窦 内皮细胞,用RT.PCR的方法检测内皮细胞中多 种细胞因子的基因表达,结果发现:CLP后,肝 窦内皮细胞T啊.n,IL.1口,IL.6的表达均明显增 高.从功能上讲,TNF.a,IL.1日和IL6同属促炎 症细胞因子,它们表达的升高可以促进一氧化 氨,花生四烯酸代谢产物,缓激肽和组,织胺等血 管话性物质的产生,激话补体及中性粒细胞,促 进中性粒细胞穿越血管内皮向组织中聚集,同 时它们还可相互作用形成许多正反馈环,导致 所谓"炎症级联效应"的发生.这些反应的结果 是炎症反应的持续和加重. 由于内皮细胞分广泛,数量庞大,尤其是它 分泌的炎症介质可在局部与血液中的炎性细胞 和组织中的实质细胞直接接触,故内皮细胞源 性细胞因子在MOLDS时机体免疫失衡中的作用 不容忽视,在以细胞因子为靶标对MODS进行干 预时也应充分考虑内皮细胞这个靶细胞,积极 调节内皮细胞细胞因子的产生. 参考文献: [1]BaueAE,DurhamR,FaistE.Systemicjnnl|II岫se n由加(SIRS).multipleorgandysfunctionsyadrome (MODS).r~tiVl~organfaflm~(MOF):arewewinnthe battle?[JStock.199:g,10(2):79—89 [2]B呻eRC.1nu~nolcdia$tlaan~:acontinuingevolutioninour tmderstar~ngthe劬inflamtr~oryT|Id删 (SIRS)andIhe?lt由(MODS) [J]^rmIttte~r^.1996,l25(8):680,69l [3]MeGillSN,AtunedNA,d?NV.Flfiolhelimlcel1日:ein infectionandintlammation[J].WcddJsuIg.1998.22(2): 171—178 [4]BraetF,Dez叭R,SmaddT,eta1.^tB ,neth~ofisatalim.purltietalm.andeultivafionn0fratlivea-画. mdend~thelimlceils[JjLabInvest,l994.70(6):944 一o:52 [5]盂宪钧,王平,张平.肝脏在多器官功能衰竭中的作用 [J].中华外科杂志.1988.26(1):13—15 [6jBmeRc.TowardatheoryregartSngthepalhogen~isorthesys- temielmma招耳respoase日帆:wh皿他doanddonot knowdb邮tey~inelm[J]C,itCareMd,I996,24 (I):l63一l72 [7]GII1IoAdG.In删0forgandysfun~onol-failure 【j].~/orid】.su,1996,20(4):430—436 第十二届全国普通外科学术研讨会征文通知 由中国普通外科杂志社与湖南省医学会昔通外科专业委员会联台主办的第P_-N4H~普通外科学术会议拟定于2ooo年 5—6月在辽宁省大连市举行.征文主要内容:?普外基础实验,临床研究;?普外领域新进展,前瞻性研究;?临床经验,技术 改进,经验教训与误诊分析;?内窥镜在普外领域的应用.截稿日期:2OOO年2-月28日. 请将未正式发表过的论文(3060字左右)和摘要(800字左右)打印或抄写整洁加盖公章后,寄:湖南省长沙市湘雅路l41 号中国普通外科杂志编辑部收邮编:4100~信封左下请注明"会议征文"字样. 中国普通外科杂志社 湖南省医学会普通外科专业委员套 I999年11月20日