【doc】两个薄荷品种叶片愈伤组织的诱导及增殖

【doc】两个薄荷品种叶片愈伤组织的诱导及增殖 两个薄荷品种叶片愈伤组织的诱导及增殖 植物资源与环境2009,lS(2):84-88 JournalofPlantResourcesandEnvironment 两个薄荷品种叶片愈伤组织的诱导及增殖 y-盱,李维林?,梁呈元,刘艳 [江苏省?中国科学院植物研究所(南京中山植物园),江苏南京210014] 摘要:采用正交实验设计,研究了诱导培养基中6一BA,NAA和V浓度及基本培养基类型4个因素对薄荷(Mentha haplocalyxBriq.)品种'687'和'沪39'叶片愈伤组织诱导的影响,并研究了增殖培养基中6一BA,NAA,IBA和 2,4一D浓度对愈伤组织增殖的影响,筛选出适宜于品种'687'和'沪39'叶片愈伤组织诱导和增殖的最适培养基. 结果明,培养基中6一BA,NAA和V浓度及基本培养基类型对品种'687'和'沪39'叶片愈伤组织的诱导率和褐 化率均有一定的影响,但不同品种适宜的培养基配比有一定的差异;NAA浓度对品种'687'愈伤组织诱导的影响 作用显着,影响品种'沪39'愈伤组织诱导的主要因素是V浓度和基本培养基类型.适宜于品种'687'叶片愈伤 组织诱导的培养基为含0.5mg?L,6一BA和1.5mg?LNAA的B培养基,适宜于品种'沪39'愈伤组织诱导 的培养基为含1.5mg?L6一BA,1.5mg?LNAA和100mg?LVc的1/2MS培养基,均含5.5g?L 琼脂和30g?L蔗糖(pH5.5,pH5.8).2个品种叶片愈伤组织增殖所需的生长调节剂浓度及比例也有一定 的差异,较高浓度的细胞分裂素有利于愈伤组织的增殖,品种'687'和'沪39'叶片愈伤组织增殖的适宜培养基分 别为B培养基和1/2MS培养基,均含2.0mg?L,6一BA和1.5mg?LNAA以及 5.5g?L琼脂和30g?L 蔗糖(pH5.5,pH5.8). 关键词:薄荷;愈伤组织;诱导;增殖;培养基 中图分类号:$567.235;Q943.1文献标志码:A文章编号:1004—0978(2009)02—0084 —05 InductionandmultiplicationofleafcallusfromtwocuitivarsofMenthahaplocalyxYUXu.LI Wei.1in? ,LIANGCheng—yuan,LIUYan(InstituteofBotany,JiangsuProvinceandtheChinese AcademyofSciences,Nanjing210014,China),PlantResour.&Environ.2009,18(2):84—88 Abstract:Effectsofconcentrationsof6一 BA,NAA,VrandtypeofbasicmediumininductionmediumOil inductionofleafcallusfromtwocuhivars'687'and'HU39'ofMenthahaplocalyxBriq.werestudied byorthogonalexperimentandeffectsofconcentrationsof6一BA,NAA.IBAand2.4一 Dinmuhiplication mediumOlqmultiplicationofthecalluswerealsoresearched,andthebestmediaforinductionand multiplicationofleafcallusfrom'687'and'HU39'wereselected.Theresultsshowthatthe concentrationsof6.BA.NAA.Vrandtypeofbasicmediumhaveacertaininfluenceoninductionrate andbrowningrateofleafcallus.butthesuitableproportionofmediumforthetwocuhivarsisnotthe same.TheeffectofNAAconcentrationoncallusinductionfrom'687'leafissignificant.andVr concentrationandbasicmediumtypearethemainfactorsaffectingcallusinductionfrom'HU39'leaf. Thebestmediumforcallusinductionof'687'leafisBmediumcontaining0.5mg?L6一 BAand1.5 mg?LNAA.thebestmediumforthatof'HU39'leafis1/2MSmediumcontaining1.5mg?L6 一 BA,1.5mg?LNAAand100mg-L—Vr,bothofthetwomediahave5.5g?LI1agarand30 g?L一sucrose(pH5.5一 pH5.8).Amountofgrowthregulatorsneededformultiplicationofleaf callusofthetwocuhivarsisdifferentandahigherconcentrationofcytokininisfavorableforth e multiplicationofleafcallus.Thebestcallusmultiplicationmediumfor'687'and'HU39'leafis B mediumand1/2MSmedium,respectively,andbothofthetwomediacontain2.0mg?L6.BA. 1.5 mg?L一NAA,5.5g?L一agarand30g?L一sucrose(pH5.5一pH5.8). 收稿日期:2009—01—05 基金项目:"十一五"国家科技支撑计划项目(2006BA106A12—12);江苏省高技术 研究项目(BG2005317) 作者简介:于盱(1984,),女,江苏南京人,硕士研究生,主要从事药用植物资源和育 种研究. ?通讯作者E-mail:1wlcnbg@mail.cnbg.net 第2期于盱等:两个薄荷品种叶片愈伤组织的诱导及增殖85 Keywords:MenthahaplocalyxBriq.;callus;induction;multiplication;culturemedium 薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)为唇形科 (Labiatae)薄荷属(MenthaL.)多年生草本植物,是 重要的香料植物和中药材.薄荷以干燥的地上部分 入药,常用于治疗风热感冒,目赤,喉痹及风疹等 症.薄荷在世界各地广泛分布,中国的主产区为 江苏省和安徽省.中国的薄荷产品以香气纯正,异 味少而享誉世界,但由于长期连作栽培,品种退化严 重,品质下降,国际市场多被印度和巴西等国抢 占,因此,急需对国内现有薄荷品种进行改良和 选育. 利用组织培养技术对薄荷属植物进行新品种的 选育,既可以保持薄荷优良性状的稳定遗传,防止 品种退化,也可为薄荷属资源的遗传转化和微型种 质资源库的建立创造条件J.有关薄荷属植物组 织培养技术的研究在国内外已有较多报道J,但 在实际应用过程中还存在外植体的污染,褐变及组 培苗玻璃化等问题,使其应用推广受到一定的限制. 愈伤组织培养是优良品种选育的有效生物技术 手段之一,通过愈伤组织培养可以产生染色体加倍, 耐盐和耐旱等突变体植株,也是转基因和体细胞杂 交等技术的重要环节,因而,愈伤组织培养也是目前 薄荷组织培养研究中亟待篇决的关键技术之一.薄 荷组织中含有大量的多酚类成分,诱导出的愈伤组 织存在易褐化和再生率低等问题,通过培养条件的 优化可以解决以上问题,而目前国内对薄荷愈伤组 织诱导和增殖培养条件优选的研究较少J.作者 以薄荷品种'687'和'沪39'('HU39')叶片为外植 体,对愈伤组织的诱导及增殖培养条件进行了筛选, 以期为薄荷叶片愈伤组织诱导率的提高和褐化率的 降低提供实验基础,也为薄荷的生物技术育种提供 技术支撑. 1材料和 1.1材料 供试薄荷品种为'687'和'沪39',其中'687' 于2003年5月引自浙江杭州,'沪39'于2003年4 月引自安徽太和.在第2年早春尚未萌发之前选择 白色粗壮,节问短,无病害的根茎作种根,扩大繁殖, 在出苗后进行2,3次去杂,适时浇水追肥. 1.2方法 1.2.1愈伤组织诱导培养基筛选的正交实验愈 伤组织诱导培养基的筛选采用L9(4)正交实验设 计,设置6一BA浓度,NAA浓度,V浓度及基本培 养基类型4个因素,其中,6一BA浓度为0.5,1.0 和1.5mg?L,;NAA浓度为0.5,1.0和1.5 mg?L,;Vc浓度为0,100和200mg?L,;基本培 养基类型为1/2MS,MS和B,共9组处理.各培养 基均含5.5g?L.琼脂和30g?L蔗糖,pH5.5, pH5.8,于121?灭菌20min. 于2008年春季分别采集薄荷品种'687'和'沪 39'最靠近顶芽的全展叶片,先用洗衣粉溶液浸泡 15min后,用自来水冲洗干净,接种前用体积分数 75%乙醇浸泡40S,最后用质量体积分数0.1% HgC1:溶液灭菌7rain,无菌水冲洗3,4次.将叶片 切成边长0.5cm的小方块,叶背面朝下接种在按上 述实验设计配制的固体培养基上,每瓶接种1个外 植体,每处理30瓶,于温度25?,黑暗条件下培养, 30d后统计愈伤组织的诱导率及褐化率. 1.2.2愈伤组织增殖培养基的筛选实验分别以 B和1/2MS培养基为品种'687'和'沪39'叶片愈 伤组织增殖的基本培养基,均含5.5g?L琼脂和 30g?L蔗糖,pH5.5,pH5.8,于121oC灭菌20 min.调整培养基中的6一BA,NAA,IBA和2,4一D 浓度,配制成l5组愈伤组织增殖培养基.其中, 6一BA浓度分别为0.5,1.0,1.5和2.0mg?L,; NAA浓度分别为0,0.5,1.0,1.5和2.0mg?L,; IBA浓度分别为0,1.5和2.0mg?L,;2,4一D浓 度分别为0和0.2mg?L,.将培养15d的'687' 和'沪39'叶片愈伤组织分别转入上述增殖培养基 中,在温度25?,每天光照8,10h,光照度1500, 2000lx条件下培养.每种培养基接种20瓶,每瓶 接种1块愈伤组织,2次重复.30d后观察愈伤组 织的生长及褐化状况,计算愈伤组织增殖率. 1.3评价指标及数据 愈伤组织的诱导率,褐化率和增殖率按下列公 式计算:诱导率=(诱导出愈伤组织的叶片数/接种 叶片数)×100%;褐化率=(褐化的愈伤组织数/接 种愈伤组织数)×100%;增殖率=(培养结束时愈 伤组织鲜质量/接种时愈伤组织鲜质量)×100%. 86植物资源与环境第18卷 实验数据采用SPSS10.0软件进行方差分析和 差异显着性分析. 2结果和分析 2.1薄荷叶片愈伤组织诱导培养基筛选的正交实 验结果 培养基中添加的激素类型及浓度,V浓度和基 本培养基类型对品种'687'叶片愈伤组织的诱导率 和褐化率均有一定的影响(表1).由值可以看 出,4个因素对品种'687'叶片愈伤组织诱导率和褐 化率的影响效应由大至小依次为:NAA浓度,基本 培养基类型,6一BA浓度,V浓度.由K值可以看 出,在添加了0.5mg?L,6一BA和1.5mg?L.. NAA的B培养基中,'687'叶片愈伤组织的诱导率 最高;在添加了0.5nag?L,6一BA和1.5mg-L NAA的1/2MS培养基中,'687'叶片愈伤组织的褐 化率最低.方差分析结果表明,除了NAA浓度对 '687'叶片愈伤组织诱导率有显着影响外,其他 因素对其愈伤组织诱导率的影响均不显着;4个因素 表1薄荷品种'687'叶片愈伤组织诱导培养基筛选的正交实验结 果 Table1Resultoforthogon~experimentOUmediumselectionfor callusinductionfromMenthahaplocalyx'687'leaf A:6一BA浓度Concentrationof6-BA(mg?L一);B:NAA浓度 ConcentrationofNAA(mg-L一);C:Vc浓度ConcentrationofVc (mg?L);D:基本培养基类型Typeofbasicmedium. 对其愈伤组织褐化率的影响均不显着.由于在B 和1/2MS培养基中褐化率均较低,且培养基类型对 褐化率的影响不显着,因此选择B为'687'愈伤组 织诱导的基本培养基.综合以上结果,选择添加 0.5mg?L,6一BA和1.5nag?LNAA的B5培养 基(含5.5g?L琼脂和30g?L蔗糖,pH5.5, pH5.8)为'687'愈伤组织诱导的最佳培养基. 培养基中的NAA浓度,6一BA浓度,V浓度及 基本培养基类型对品种'沪39'叶片愈伤组织的诱 导率和褐化率均有一定的影响(表2).4个因素对 '沪39'叶片愈伤组织诱导率的影响效应由大至小 依次为:V浓度,基本培养基类型,NAA浓度,6一 BA浓度,对褐化率的影响效应由大至小依次为:V 浓度,NAA浓度,基本培养基类型,6一BA浓度.由 K值可以看出,在添加了1.5nag?L,6一BA,1.5 nag?L..NAA和100mg?LV的1/2MS培养基 中,'沪39'叶片愈伤组织的诱导率最高;在添加了 1.0mg?L,6一BA,1.5mg?LNAA和100 mg?LV的1/2MS培养基中,'沪39'叶片愈伤 组织的褐化率最低.方差分析结果表明,6一BA, 表2薄荷品种'沪39'叶片愈伤组织诱导培养基筛选的正交实验 结果 Table2ResultoforthogonalexperimentOilmediumselectionfor callusinductionfromMenthahaplocalyx'HU39'leaf A:6一BA浓度Concentrationof6-BA(mg?LI1);B:NAA浓度 ConcentrationofNAA(nag?L一);C:Vc浓度ConcentrationofVc (mg?L);D:基本培养基类型Typeofbasicmedium. 第2期于盱等:两个薄荷品种叶片愈伤组织的诱导及增殖87 NAA和V浓度及基本培养基类型对'沪39'叶片 愈伤组织诱导率和褐化率的影响均不显着.综合以 上实验结果,确定添加了1.5mg?L,6一BA,1.5 mg?LNAA和100mg?LV的1/2MS培养基 (含有5.5g?L琼脂和30g?L蔗糖,pH5.5, pH5.8)为'沪39'叶片愈伤组织诱导的最佳培养 基,在该培养基上,'沪39'叶片愈伤组织的诱导率 和褐化率分别为94.7%和36.8%. 在实验中还观察到,薄荷叶片在适宜的培养基 上一般培养7d开始出现膨大卷曲现象,10d后叶 片边缘切口及叶脉处最先出现黄色颗粒状的致密愈 伤组织.在各自的最适培养基上,品种'687'和'沪 39'叶片愈伤组织的诱导率都可达到90%以上,并 且愈伤组织的出现时间,颜色及质地都相似;在品种 '687'叶片愈伤组织的诱导过程中需要较高浓度的 生长素及较低浓度的细胞分裂素,而在品种'沪39' 叶片愈伤组织的诱导过程中两者的浓度都较高;添 加抗氧化剂V对于防止'687'叶片愈伤组织褐化的 作用不明显,但对品种'沪39'有一定的防褐化作 用;B培养基比MS培养基更适合'687'叶片愈伤组 织的诱导,而1/2MS培养基对'沪39'叶片愈伤组 织的诱导效果更好. 2.2不同培养基对薄荷叶片愈伤组织增殖的影响 薄荷属于芳香类植物,细胞内含有大量的酚类 物质,因此愈伤组织在后期生长过程中易褐化,且不 能正常增殖生长.在增殖培养基中添加适量的植物 生长调节剂可以降低愈伤组织的褐化程度,使愈伤 组织能正常增殖.根据不同培养基中薄荷品种 '687'和'沪39'愈伤组织增殖状况可知(表3),添 力口2.0mg?L一6一BA和1.5mg?L一NAA的B 培养基和1/2MS培养基(均含5.5g?L琼脂和 30g?L蔗糖,pH5.5,pH5.8)分别最有利于 '687'和'沪39'叶片愈伤组织的增殖生长. 在实验中还观察到,在不添加任何生长调节剂 的增殖培养基上,愈伤组织褐化死亡;在添加了0.5 mg?L,6一BA的增殖培养基上,大部分愈伤组织 外观呈黄褐色,且增殖率较低;在添加了1.0,2.0 mg?L,6一BA的增殖培养基上,愈伤组织呈黄绿 色,当6一BA浓度大于1.5mg?L时愈伤组织增 殖率较高;在添加了IBA和2,4一D的培养基上愈 伤组织增殖率较低,前者易褐化,后者愈伤组织的颜 色和质地发生较大改变,呈白色松软状.在增殖培 养过程中,2个品种叶片愈伤组织对不同生长调节 剂的反应相似,都需要较高浓度的细胞分裂素. 表3增殖培养基中添加不同浓度植物生长调节剂对薄荷叶片愈伤组织增殖生长的影响 Table3Effectofmultiplicationculturemediaaddingplantgrowthregulatorswithdifferentco ncentrationsonmultiplicationgrowthofcallus fromMen~ahaplocalyxBriq.1eaf 数据为3次重复的平均值Thedatumsaretheaverageofthreereplications;同列中不同的字母表示差异显着(P<0.05)Thedifferentlettersin thesamec0lumnindicatethesignificantdifference(P<0.05);用于品种'687'和'沪39'叶片愈伤组织增殖培养的基本培养基分别为B5培 养基和1/2MS培养基(均含5.5g?L琼脂和30g?L蔗糖,pH5.5, pH5.8)Thebasicmediumusedforcallusmultiplicationof'687' and'HU39'leafisBmediumand1/2MSmedium.respectively,bothcontaining5.5g?L一 agarand30g?L,sucrose,pH5.5一pH5.8. 88植物资源与环境第l8卷 3讨论和结论 在离体条件下植物细胞全能性的实现受到植物 内在遗传因素,所处发育阶段及外界环境的共同影 响,外源激素通过内源激素发挥传递开启遗传物 质进行脱分化和再分化等发育表达信号的作用, 因此,外源激素的种类及浓度合适与否是愈伤组织 诱导,增殖及分化成败的关键.师素云等的研究结 果显示【8j,以茎尖为外植体,添加了1.0mg?L NAA和0.4mg?L,6一BA的B培养基适合薄荷 品种'738'愈伤组织的诱导;周伟香等在诱导培养 基中添加6一BA和NAA的同时附加了0.5mg?L 2,4一D,也成功地诱导出了薄荷叶片愈伤组织. 降低培养基中的铵态氮和硝态氮浓度以及加入 抗氧化剂V在一定程度上均能降低愈伤组织的褐 化率和推迟褐化时间.本实验结果显示,在 1/2MS培养基中添加100mg?LV可以降低品种 '沪39'叶片愈伤组织的褐化率. 薄荷品种'687'和'沪39'叶片愈伤组织诱导所 需的激素种类及浓度均有一定的差异,品种'687'需 要较高浓度的生长素,而品种'沪39'则需生长素与 细胞分裂素维持1:1的浓度比例,推测可能与这2 个品种具有不同的遗传背景和代谢特点有关.根据 正交实验结果,确定薄荷品种'687'叶片愈伤组织诱 导的最适培养基为添加了0.5mg?L,6一BA和 1.5mg?LNAA的B培养基,品种'沪39'叶片愈 伤组织诱导的最适培养基为添加了1.5mg?L 6一BA,1.5mg?L一NAA和100mg?L一V的 1/2MS培养基,均含有5.5g?L琼脂和30g?L 蔗糖,pH5.5,pH5.8.在愈伤组织增殖阶段,2个 品种所需的激素浓度及比例也有一定差异,但较高 的细胞分裂素水平有利于叶片愈伤组织的增殖,因 而,品种'687'和'沪39'叶片愈伤组织增殖的 适宜培养基分别为添加2.0mg?L..6一BA和1.5 mg-LNAA的B培养基和1/2MS培养基,均含5.5 g?L..琼脂和30g?L蔗糖,pH5.5,pH5.8. 在本实验中作者还观察到,在叶片愈伤组织增 殖过程中,个别处理的培养基上可分化出芽,这些芽 从原叶片中间的叶脉处长出,因此不能完全判断是 否实现了脱分化和再分化的过程,且已有研究表 明[8,14-17],薄荷属植物的愈伤组织较难分化.因此, 要实现薄荷愈伤组织再分化和建立高效再生体系, 需要进行进一步的摸索和实验研究. 参考文献: [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版(一部) [M].北京:化学工业出版社,2005:310. 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