CTL细胞毒作用的颗粒依赖性途径

CTL细胞毒作用的颗粒依赖性途径 第22卷第lO期 2000年l0月 第三军医大学 AC1ACADEMnEMED]CI,AEMIUT圳SrER11AE Vd.22.l0 Oct.200o981 6hngS,DarmwTIl-SeiglerHFGenerationofprimarytunlor- speeificcylotoxlcTlymph,x?tesfromautotogtmsandhmtmnlyre— pl1eeyteantigenclass1一matchedallogenek.peripheralbledlyre— ph?mbyI玎gene—modifiednl~laootrlacellslJ(~lcerRes, 199757(8):l561一l568 7UgurelS.SeiterS.Rapp]G,.Heter~erroussu.~'eptibility toCD95一inducedapoptosisinmelanmnacellscorrelates】thh】一2 andbcl—Xexpressionandissett~itivetonaMulafionbyinteffeoJt~qt J]l?lJCancer.1999.82(5):727—736 8JINumionDJ,C)~nskiAL,TuckerVcela/Humanantigen— presentingcel1]tumo.rcellhybrids~mulatestrongallogencic— spensesandpresent【mjaedantigenstocytatoxicTcells in~ro[J]lmmundo~,1999.98(4):541—550 9JBerdD,n~,ireHC,SchuchierLM.et.Auto]ogoushapten— n~lifiedmelanonmvaeei.eWsLsut#calau~aatIreatmeatafter resef'tionofllodaln~astatascs[J]JClinOnco1.1997.15(6): 2359—2370 10TsangKY,ZarembaS.NierodaCA.etalGenerationofhu— ll~,at'lc)~otoxJcTcellsspecificforhtm~lcarcitmeR~ryonicanti— geneiptopesfrompatientsimmunizedIhrecvtt~itmrttvacciaia- CEAvaoclae[J.JNat]CancerImt1995.87(13):982 990. 11]s0M,Etu'aM,KalsuraF,a/AnewlyidentifiedMAGE- 3-derivedepitogerecognizedbyHIA—A24一re~etedcy~otoxieT l~nphocytes[J.1n【JCaJqcer.19998】(3):387—394 他一 ThumerB,HaendleI,Roder(:,a1.Vaccinationwithtttage- 3A1gepfidu-pl】】set[/natttre,m?.y-nvddendriticcell~ex— pan&specificc)totoxicTcellsandinducesregrvss[onofsome melaatasesinadvancedstage?inel~ffloma.J.JExpMed, 1999190(1j):l669一】678 l3A)youbM,MazarguilH,Mon..arratB.a/Astructure-b&~ed approachtodesigning11811一naturalgeptide~thatCallactivateatlt[一 melanomacvtotoxicToells[J]JBiolChem,1999.274(151: 10227—10234. 14]ReytmldsSR,OratzR,ShapiroRL,Stifilulation0f C1)8TcellresponsestoIVLa,GE一3andMelan,~dIVLa.RT-1byim- munizationto.pol~-alentmelatmmavaccine【JJIn【JCancer, 1997.72(6):972—976 【15ParkhurstMR,Salr.alle~ML.SouthwoodS,etalImproved inductionofmelanoma-rear,liveCTLwithpedesfromtheme]a- mmaantigengp]O0modifiedatHL^一A*0201?bindingresidues [J]Jhmsunol,1996,157(61:2539—2548 【】6JRoserd~rgSA,YangJC.Schwartze.truberDJ,.Impact ofc)~okineaduait~tmJononthegenerationofantitumorreaetM— tyinpatientswi.thmetastaticmalan~,mreceivingagepfidevac— cine~J]JInmluno1.I999.163(3):l690—1695. 117JBuelerH,MtdligenRCI,duc6onofm~tigen-specifictumorim— muaitybygeneticandcellularvaocines~i.stM^eE:eft- hancedtm~mrprotectionbycoexpre~sionofgrasulocyte-macmph— agecolony. ? stimulatingfactorandB7.儿JJMed.1996,2 (5):545—555 —18]TutingT.DeLeoAB,LotzeMT.elGeneticallymodified he,~emalwow—deriveddendritictellsexpressingtumor-associated v0r"seIf''annsinduceantlmmorimmurfitvin[J] EurJImtnut~l,1997,27(10):2702—2707. 19]MarlinBK.FrellngerJG,_?ngJP,ela/.Combinatione therap)'withCD86andtheMI-ICclass?transaelivatorinthe costrofoflmlgtumorlJ]JImmm~ol,1999,162(11): 6,663—6670 一如]TutingT,WilsonCC,MartinDM,.Autologeushuman monoe)ie-derlveddendriticcellsgeneticallymodifiedtoexpress rr-dan0maanfigertselicitmarycylotoxicTcellresponsesin vitro:enharweme.thyco~ansfectionofgenesencodingtheri'hl— biasingc'aokine~lL-12and?--. 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(编辑汪勤俭) Granule-dependentpathwayofCTLcytotoxicity 鼋耋塑,墨至(第三军医大学基础医学部全军免疫学研究所,重庆4OOO38) 作者简介:营孝鞠c19一).女,安徽省马鞍山市^.博士,讲师,主耍从 事药学方面的研究,发表沱文?篇.电蓿:l吐)622l* 收稿日期;??—啤一04;修回日期2OOO-09-21 ?J 细胞毒T淋巴细胞(crL)是机体防御细胞内感染的主要成 员之一.分为CD86TL%,CD4一CTLs和双阴性CD4CD8CIk (DN6TL~)几个砸群:CTL细胞毒性通过两条接触依赖性途径 982第二军医大学第22卷 杀伤靶细胞:Fas配基(L)一Fas介导的细胞凋亡作用和颗粒一 胞吐途径介导的溶细胞作用研究表明.在Lq'IJ中起主要作用 的CD8C3Ls通过颗粒依赖性途径识别和杀伤靶细胞和病 体.并可通过分泌细胞因子I一7等补充CD4T细胞的作用, 也是杀伤某些细胞内病原体(如弓形体,利什曼原虫J的卡要武 器.DNcn的细胞毒性是FasL-1'~相互作用介导的,对疬原体 活力无影响;而CD4CTLs可通过任一途径系伤靶细胞 1cIL细胞毒性的颗粒依赖性途径在抗细胞内感染 中的作用 关键基因剔除的穿孔素缺陷小鼠的产生第一次为颗粒依 赖性途径在体内外病毒感染清除中的作用提供了具有说服 的资料,也由此发现和确定Fas途径为CFL.细胞毒性产生的机 制之一,研究显示穿孔素缺陷小鼠的CILs可溶解hs表达靶细 胞但不能溶解Fas缺陷靶细胞或突变Fas分子表达的靶细胞. 就靶细胞限制性选择的溶解作用而言,估计穿孔素机制的作用 约占杀伤活性的2/3,余下1/3是Fas的作用,前者基于溶觯性 蛋白的分泌;后者取决于细胞一表面配基一受体的相互作用= 细胞毒性的这两条途径的区别不仅在于是否依赖于钙以 及CTL和靶细胞之间接触区分子的相互作用而且表现在对靶 细胞不同下游事件的启动.研究已表明快速靶细胞中蛋日水 解酶是由颗粒胞吐和Fm#F~配基途径污导的.n等证实r 这一观点,他们用蛋白水解酶抑制剂对两条途径引起的凋亡型 核损伤均有阻断作用,但是两条途径靶细胞溶解对蛋白水解酶 的要求不同.只有F缸介导的溶细胞作用依赖于蛋白水解酶的 蛋白分解作用,而颗粒胞吐作片j并不需要蛋白水解酶两条 (m建径可启动靶细胞分子事件的研究结果可能对于以下微 生物病原体的宿主应答中一些由Fas/Fas配基和穿孔素介导溶 细胞的不同作用有关. 在过去几年中,穿孔素,颗粒酶A或B及F鼬受体或其配 基功能缺陷小鼠突变模型的建立,为C'E.细胞毒作用机制的深 入研究提供了有力手段.穿孔素缺陷小鼠生长和发育正常,T 细胞亚群或T细胞镦活能力无明显改变:颗粒酶A或B缺陷小 鼠的情况类似..J研究表明,穿孔素在淋巴细胞脉络丛脑膜炎 病毒(LFmphoecehonometfignltisvirus,LCMVJ,李斯特菌和锥 虫(mpanosomes)清除中发挥作用一动物模型的研究也显示, 细胞毒胜的颗粒胞吐途径不是细胞内病原体感染急性期免疫 产生的原因,但是在急性感染之后的无症状慢性期的疾病中, 含穿孔素的细胞毒颗粒可能是控制疾病所必需的: 穿孔素缺陷小鼠中毒力结核杆菌的感染过程由两个实验 室分别进行了研究,穿孔素缺陷并不影响静脉内感染或气雾剂 攻击引起的疾病早期过程中细菌负荷或器官的组织学形态:同 样,另外缺乏一颗粒组分粒酶B.后者是靶细胞DNA片段化快 速诱导中多余成分——在整个观察期间未见对疾病的影响: 是,感染晚期穿孔素缺乏小鼠的肝,肺和脾内细菌数目显着 高于同窝对照组动物,因此.c?可能在感染慢眭期持续性细 菌的控制发挥重要作用.但颗粒胞吐途径可能并不参与ll_ma一 的免疫过程,不表达颗粒胞吐途径重要效应分子穿孔素的基 因靶向剔际小鼠在感染L.mor后并不改变其感染过程,说明 此途径并不在所有抗细胞内感染免疫中起重要作用.David 鼬印等认为,颗粒依赖性途径对于非细胞病变性病原体感染如 LCMY的保护性免疫应答是必需的,将加速病原体的清除,而对 于细胞病变性病原体感染如vv(Vesicularstomatifisviras,vsv) tSettdikiForeslvirus.s)和流感病毒可能并不是必要的,提示 对于某些娄型的细胞内感染.颗粒胞吐途径可能促进组织破坏 而不是提供保护胜免疫: 综上所述,可见细胞毒性的颗粒胞吐途径并不在所有细胞 内感染或感染的所有阶段中起主导作用,在除Lmajor以外的 细胞内病原体感染中发挥重要作用.可能与感染急性期细胞内 病原体的免疫产生并不相关,而是控制弓形体病和结核(均是 原型疾病,急眭感染后出现无症状期,病原体可能终身持续存 在的慢性期)等感染眭疾病所必需的: 那么,穿孔素/粒酶途径和Fas途径在CTL细胞毒性中的作 用叉如何呢?GrauberlTA等利用Sprenl和Kumgold模型,对依 赖于MHCI类或U类途径的急眭移植对宿主疾病(Acute. vemus-h~stdis~ases)进行了评价,结果表明CD8cIk可表达穿 孔素mRNA和分泌颗粒酶,其介导的细胞毒性几乎完全依赖于 穿孔素/颗粒酶系统,而DNCTLs可表达FasL的tmqNA,通过 FasL途径介导的细胞凋亡系伤靶细胞CD4CTLs可通过任一 途径杀伤靶细胞,但绝大多数?类模型的细胞毒眭并不依赖于 穿孔素或Fas途径,说明还存在它途径(如1n和IFN-7的分 泌)可能在CD4CTLs的细胞毒性中起重要作用. 此外,穿孔素和Fas系统可能作用于CTL细胞毒胜的不同 阶段早期主要是穿孔素途径的作用,而晚期来自穿孔素非依 赖性,FasUFa~依赖性相互作用.单向混合淋巴细胞反应(One- waylymphocyter~actiotts,MLRs)产生的CTLs主要是CD8细胞 也有一些是CD4效应细胞=中生成的穿孔素缺陷的 完全丧失其在孵育2,4h后诱导靶细胞释放Cr的能力, 因此穿孔素是产生膜损伤.使早期cr标记蛋白从靶细胞中 释出的原因;同样地,穿孔素缺陷的cl1不能诱导任何I. 碘化脱氧尿苷(IUdR)标记的D3,A在孵育2,4h后从靶细胞的 释放;瑙I-IUdR检测法对靶细胞中细胞倜亡相关DNA片段化的 测定结果显示,穿孔素缺陷的c?不能很快诱导靶细胞的凋 亡而延长孵育时间后,穿孔素缺陷cl1可恢复其介导岱J一?』一 dR和0释放的能力,这依赖于靶细胞,因此"晚期"细胞毒眭 是穿孔素非依赖性成分作用的结果,此晚期,穿孔素非依赖眭 细胞毒性来自F缸配基系统,因为穿孔素和Fas配基均缺陷的 几乎无诱导I-IUdR和cr释放的自E力.即使是在延长孵 育时问之后:由此可见,穿孔素,颗粒途径是CTL主要亚群 CDg'T细胞依赖的细胞毒作用机制,不仅在CTL抗微生物免 疫中起重要作用,而且可能与FasL/Fas介导途径协同作用.引 起宿主防御细胞内感染的特异性细胞毒效应一 第l0期管孝鞠,等细胞毒作用的颗粒依赖性途径983 2CTL颗粒依赖性途径中的效应分子及作用 CTL颗粒及其组成蛋白在TCR刺激24,48h后合成.新生 成的穿孔素,颗粒酶及其它组成颗粒的蛋白向细胞毒颗粒移 动.活化的CTL识别靶细胞后,在效应细胞和靶细胞之间形成 紧密连接,CTL颗粒顺流而下到达接触部位,在此部位.颗粒与 效应细胞膜融合,颗粒内古物直接与靶细胞膜接触,颗粒酶,颗 粒溶素通过穿孔素孔进入细胞内,在这里它们可作用于特异 底物,最终导致细胞死亡,和/或转动到桉内,直接分解和激; 死亡底物,溶解和杀伤靶细胞. 2.1穿孔素 穿孔素是CTL颗粒中发现的一分子量为68×103的蛋白 质,是c『1l细胞毒颗粒依赖性途径中的关键分子之一,与补体 级联反应的一些终端成分相似.活化的CTL识别靶细胞舌,在 效应细胞和靶细胞之间形成紧密连接,钙存在条件下,它可发 生聚合,在靶细胞膜上形成槽状(通道样)结构,颗粒酶,颗粒溶 素等颗粒内含物可通过此通道进入细胞内,见图1.进^靶细 胞后,颗粒酶可进入细胞质,在这里它们可作用于特异性底物, 最终导致细胞死亡.和/或转动到核内.直接分解和激活死亡底 物 图1CTL细胞毒作用的颗粒胞吐途径 2.2颗粒酶 细胞毒颗粒的另一关键分子是颗粒酶,它是可激活靶细胞 死亡机制的神经丝氨酸蛋白酶.颗粒酶A和B位于两个不I-3 的染色体上,但两个基因均是多基固簇的一部分.颗粒酶A位 于小鼠第13位染色体颗粒酶K的65kb内,颗粒酶B位于小鼠 第14位染色体一个多基因簇的5'末端,这簇基因包括编码(从 5'到3')颗粒酶B,C,F,G,D和E的基因,组织蛋白酶G基因, 以及鼠肥大细胞蛋白酶2(MMCP-2)基固和其它编码肥大细胞 胃促胰酶的基困.研究发现,颗粒酶A和B在?1且来源CTLs 中是表达水平最高的颗粒酶,而LAK和NK细胞中颗粒酶AB, C,D和F均高水平表达.c?s在体内产生颗粒酶基困表达的确 切模式目前尚不清楚,由于缺乏区分颗粒酶B簇颗粒酶的抗 体,现在还无法知道颗粒酶B缺陷的c?中细胞凋亡缺陷与 失去颗粒酶B或簇中与颗粒酶B紧密相连的其它蛋白酶是否 有关. 颗粒酶B是一种天冬氨酸酶(即可在天冬氨酸残基后进行 酶切),但颗粒酶B簇中绝大多数蛋白酶的特异性尚未定义,颗 粒酶A和D是类胰蛋白酶.颗粒酶C和F的特异性尚不明确. 最近重组颗粒酶的构建将有希望很快弄清楚其它颗粒酶B簇 白酶的特异性.与穿孔素缺陷小鼠相似的是,颗粒酶A或B 敞陷小鼠具有正常的淋巴隔室和产生活化CTLs的正常能力, 此外.颗粒A和B均缺陷而含有正常量穿孔素的cTk功能完 全=但是,颗粒酶B缺陷小鼠来源的CTLs完全丧失其在孵育 的前2,4h从同种异基固靶细胞释放I-IUdR的能力,这些 CTLs可引起与野生型cTk相似程度的膜损伤(Cr的释放), 这些结果表明,细胞凋亡的早期诱导取决于颗粒酶B,即使穿 孔素在这些效应细胞中具有完全的活性.延长孵育时间,颗粒 酶B缺陷的可诱导与正常水平几乎相同的I.1udH释放 提示,存在一种晚期的,颗粒酶B非依赖性的细胞凋亡诱导途 径. 颗粒酶如何进入靶细胞而诱导细胞凋亡?在上述简化模 型中,钙存在条件下穿孔素发生聚合,在靶细胞膜上形成小孔, 然后颗粒酶通过这些小孔进^靶细胞的细胞浆中裂解相关的 底物,见图1.最新研究显示,此途径可能更为复杂,靶细胞 与纯化的自然颗粒酶B一起孵育时,一些酶可通过穿孔素非依 赖性途径进入靶细胞'.进入靶细胞后,颗粒酶B似乎位于细 胞浆隔室中.在这里它显然对靶细胞无损害,但是,加入纯化的 穿孔素后或接受到腺病毒的信号后,颗粒酶B可以释放和转运 到细胞浆和/或核内.裂解底物.此"无孔途径的相对重要性 目前还很难评估,固为颗粒酶一般通过递送到靶细胞,通 常是在活性穿孔素存在条件下递送的.颗粒酶B"摄取"与颗 粒酶B通过穿孔素通道进A靶细胞的相对重要性,可能要通过 确定颗粒酶B在穿孔素缺陷c?递送时是否可有效进入靶细 胞来定.此类研究也很难进行,因为要从细胞株中获得大量绝 对纯化穿孔素和各颗粒酶还困难重重最近,重组颗粒酶的生 成和纯化成功为体外研究提供了新的希望. 23颗粒溶素(Grazlulvsin) 颗蹄素最早于1987年由斯坦福大学的AlanKrensky教授 等发观L称为519,是由人C1Z和NK细胞释放的一种新型 抗微生物生曰,与NK溶素和阿米巴孔(Amoebapores)同源.为脂 结合蛋白saposin样蛋白(~a.rap)家族的成员之一,此分子对许 多革兰氏阳性和革兰氏阴眭细菌和真菌等显示有效的杀伤活 性,可使其数目在体外减少几个数量级;与穿孔素,颗粒酶一 样.存在于溶细胞颗粒中,在T细胞激活晚期诱导表达.颗粒 溶素的广泛抗微生物作用与防卫素(Defensins)不同,颗粒溶素 是在抗原激活CI)8c?s时分泌的,因此是特异性免疫应答的 武器,而防卫素由多形核白细胞的胞浆颗粒非特异性释放而杀 伤被吞噬的病原体.在两种CD1限制性,结核杆菌特异眭和一 984第大学第22卷 种MHCl类分子限制流感病毒肽特异n0CD8c11中椅 测到嗣粒溶素,但3种CDI限制性,结核杆特异性I),兀 中未见颗粒溶素的表达重组的颓牲溶素通过政变细胞膜兑 擎町直接杀伤细胞外结桉杆茼,培养72h内清除的结核杆菌 达90%;但能杀伤结接杆菌感染的靶细胞,与穿L素台用 溶解船细胞铜时.可见细胞内结棱杆菌卜长抑制,提示在T 纲胞颗粒中的穿L素或其它孔形成分子提供进入细胞内的通 道,预粒溶素也可杀伤细胞内结核扦萧此发现"第一次 示了分离的r细胞分子可直接杀火微生物显示(杀伤细胞 内结核杆菌的能力依赖于细胞毒颗粒L}|颗粒溶素的作用 由斯坦福大学教授~renskv,Dermisnn,肺结核专家 kCL&皮肤病学救授RoberlMtlin等I1亿研究人员组成的同际 性科研小组埘颗粒溶素的作用展r了较深人的研究,研究表 明",颗粒溶素可通过神经酰胺和,卜胱氧酸蛋白酶依赖和非依 赖两种途径诱导靶细胞捌亡杀伤件r细胞发现靶细胞后. 它将颗粒溶素射向敌人,方面通过变形件破坏对方的细胞 膜,蓖接杀伤细胞外病原体在电子显馓镜卜观察,可被颗 粒溶素攻击过的细胞表面布满了水疱掸的"弹坑另方面, 存穿孔素帮助下.颗粒溶素可进人细胞内,将躲藏存那l逃 避免疫系统监视作用的病原体清除 3结语与展望 细胞内病原体.如结核杆菌,存与宿卡K期共存与址化以 来,形成了许多逃避免疫防御机制的,困此,依靠传统化疗 和抗体治疗已不足以控制和清除这有害病原体这就需要 找们没计新犁的能够号I起有效特异性细胞免疫,特别足具有 C3"1.杀伤活性的抗感染药物,以将这些蜂臧在细胞内的病件 消火干净抗生索通常来自微生物产物,阿此为其存活提供r 比j它1鼬牛物更有利的环境,而颗粒溶素作为aL细胞毒作用 的是谜武器和免症系统的重要效应分子,足凡藩细胞性r细胞 的细胞毒颗粒中天然存在的蛋白,具有广谱抗菌作川,与颗粒 形成蛋白穿孔索聪合使用可直接系伤细胞内细雨,口r能成为一 种理想的抗莆剂 综【所述通过颗粒依赖机制清除细胞内病原体. 粒胞?L途径在CTL抗肿瘤和抗细胞内感染中起主要作用,它通 过释放的穿孔素的"架桥肝道"作l咐,将细胞毒颗粒中自々颗粒 酶,粒溶素等效应分子递送到细胞内.而发挥其溶胞车n 杀伤细胞内病原体的作用释艘出来的病原体还可以被新瀚 活千【l新迁移来的巨噬细胞捕获干们系灭,此该途径小仪可能识 别和杀伤靶细胞.而且可以通过多种效应分子的协同作用.直 接杀伤细胞内病原体c?l细胞毒作用硬其免疫学机制特别 是颗粒溶素杀伤作用及相关分于机制的的阐明.必将对于靶向 和特异性抗细胞内感染疾病的疫苗和佐剂的计和研究1:作 起到积极的推动作用. 关键词:细胞毒T淋巴细胞;颗粒胞叶途径;穿孔素:颗粒 酶:颗粒溶索 中图法分类号:R392I文献标识码:A 参考文献: IIwin?DMBemerllTT,XuJ,Humanpurifiedpro- leinderivativel胁CIM.1cusebothCD95一deper~deot andCD95一indepel~lenteytoly~ieroeehanismsJJJI.wnuno1. 1998,160(51:2374—2379 2JSh陀staS.GndaP.WesselsclmfidtR,dResiduale)qotoxici— tyandgnnl~/meKexpre~ioningl-anz~neA-deficientcytotoxic IympIl0esJJBiolChem,1997,272(32):加236一加244 [3KmnarS.Tarleto~aRI.Therelativecontributionofantibodypm— ductionandCD8TcMlfanetion1oinkqlLmeeontmlofTr)panoso一 肋craziJ]ParasiteIrmnund,1998.20(5):207—216 4:CooperAM,D's0C,FrankAA,et.Thef.Olll~ofMy- o~bruWriuultuber,-~sisinfectionJnthehmgsoftrficelacking一 pre~ionofeJfllerperfodnorgrattzyme-mediated.y【nzee~la— nisn~,JInfectbs~nun,I997,65(4):】317一I320. 5JGrauheCtTA,DiPersioJF,RussellJH,da/Perfofin, 卸Tne—depetv.1entandthdet~ndentmecharfsmsarebothimper- lanlf[.rthedevelopmentofgrJt-vemu,~-hostdise~..:eaftermurit~e boneRt,~JTOWtrarr~plaatation[J].JClJn[nvesl,1997,100(4):904 — 9l_ [6]FroeliehCJDixilVM.YangxLymphocytegTantde—mediated apot~osis:mattersofviralminlic~'anddeadlyproteases[JJ.In)一 murlo【Today,I998,I9(1):30—36. 7JslI,MS,Isr~IsS,et.cTanTBautonomouslymss thecellmembraneand出面~nifiatesap~ptosisandgr. anzya~eB nuclearlocalization[J]JKxpMed,1997,185(5):855—866. 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