微生物细菌分离培养实验报告

微生物细菌分离培养实验 土壤微生物的分离培养技术实验报告 重庆大学研究生专业实验教学 实验报告 实验课程名称: 实验指导教师: 学 院: 专业及类别: 学 号: 姓 名: 实验日期: 成 绩: 重庆大学研究生院制 一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法; 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术;; 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能; 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基;根据物理状态的不同又可分为液体培养基和 固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。 接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 三点接种是把少量的微生物接种在平板表面，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察研究它们的形态。研究霉菌形态时就常用此法。 穿刺接种是用针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。该法常用于厌氧菌种的保藏或微生物的动力研究。 混浇接种是先将待接的微生物放入培养皿中再倒入冷却至45?左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就被稀释了。待平 板凝固后，置于适宜温度下培养，就可以长出单个菌落的微生物。 涂布接种是将菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可以长出单个菌落的微生物。 本实验采用的是划线接种。为了防止接种时引入其它微生物，整个操作过程均需在无菌操作台上进行，还需对操作员的双手进行酒精消毒，每次划线前都需灼烧接种环，接种时才打开培养皿且不能全部打开，接种完马上关上。 三、实验器材 1、仪器 培养皿、 量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、15ml离心管、试管架、镊子、电磁炉、锅、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、酒精灯、天平、滤纸等。 2、材料 土豆、琼脂、蒸馏水、酒精、土壤样品 四、实验步骤 1、土壤稀释液的配制 ? 在菜地用九点取样法取适量土壤样品，具体操作为:在菜地选取九个取样点，在每个取样点取相同量的表层土壤(10cm左右)，然后将其混合均匀; ? 称取1g土壤样品与99ml蒸馏水，将其配制成100ml的土壤溶液; ? 用移液管取9ml蒸馏水于15ml离心管中，再用移液枪取1ml 前一步已配制的土壤溶液于离心管中，摇匀，即为10-3的土壤溶液; ? 重复前一步，将土壤溶液稀释为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8一系列稀释液。 2、土豆培养基的制备 ? 用天平称取200g土豆，清洗干净后去皮切丁; ? 用量筒量取1000ml蒸馏水与电磁炉锅中，再加入已准备好的土豆，将其煮烂; ? 从锅中取出已煮烂的土豆，用纱布过滤，滤液待用; ? 称取20g琼脂与滤液中，再用蒸馏水定容至1000ml; ? 在制备好的滤液中加入0.1ml菌液，然后放入高温灭菌锅中，在121?下灭菌20min; ? 取出已灭菌的土豆培养基，待其熔化后冷却至60?，倒入每付平板约15-20ml，待其凝固后便可使用。 3、微生物的接种与分离 ? 将接种需要的所有器材均放置于无菌操作台上; ? 用浸泡在酒精里棉花给双手灭菌，点燃酒精灯，右手拿接种环，左手拿培养基; ? 将接种环放在火焰上烧灼，待其冷却后在10-6土壤稀释液中蘸取少量液体，打开培养基的一部分，采用划线接种，使之形成单菌落，一共划线3-4次，每划线一次就需在火焰上烧灼一次; ? 重复上步，接种10-7、10-8的土壤稀释液的微生物; ? 接种完的培养基放在恒温培养箱中倒置培养48h，取出观察。 五、结果与思考 1、实验结果 图 1 实验结果如图1所示。由图1可知，采用划线接种土壤微生物的培养皿里有单菌落出现，这说明划线接种能达到分离培养的目的。 学习过微生物这门课程的同学都知道，真菌的菌落较大且疏松，菌丝细长，呈绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，无固定大小，多有光泽，不易挑，孢子会呈现红色、褐色、绿色、黑色、黄色等不同的颜色;细菌的菌落较小，形状表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多为白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有细菌。 2、思考题 ?在平板划线法中，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉, 答:这么做的主要目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，以使下次划线的菌种直接来自于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少，从而达到分离菌株的目的。 ?为什么要把培养皿倒置培养, 答:?操作时培养皿盖上可能粘有水珠或者细菌，倒着培养可以避免培养皿盖上的水珠或者微生物落在培养皿上; ?培养过程中，细菌在代谢繁殖过程中会产生一些有害于细菌生长繁殖的代谢物，释放热量及有水排出，如果不倒着培养会有水珠滴落到培养基中，影响菌落的生长; ?如果培养目标是收集细菌代谢物，而且代谢物易溶于水，倒着培养可能会方便收集。 六、实验总结 篇二:南医微生物实验报告 脓汁和粪便标本中病原菌的 [摘要] 脓汁和粪便标本中有不同的病原菌。为了探究两种标本中病原菌的种类、特性和生化反应等，本实验将对脓汁和粪便中的病原菌进行分离培养、革兰染色、生化反应、血清学反应、细菌药物敏感性试验等操作。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等操作方法。从而达到掌握各种微生物实验的操作方法，培养对微生物实验的兴趣，反思微生物实验中所遇到的问题并总结探讨如何解决优化的目的。 [引言] 常见的化脓性病原菌有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌等。 临床上，脓汁标本在做细菌分离培养的同时，须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽孢有无，为临床提供最初的诊治 依据;粪便和经离心的尿沉淀物等则直接接种与指定的培养基中。 粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、大肠埃希菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基(如SS琼脂、伊红-美蓝平板等)，选择培养基时应根据需要尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。 本实验通过常规的病原菌检测方法从脓汁标本中分离出黄白两种细菌，均为革兰氏阳性球菌，其中黄色是致病菌—金黄色葡萄球菌，白色是白色葡萄球菌;从粪便标本中分离到紫黑色和粉红色的细菌，均为革兰氏阴性杆菌，其中紫黑色的是大肠埃希菌，粉红色的是痢疾志贺菌。 1.实验材料 1.1器材 酒精灯、接种环、接种针、打火机、试管、棉塞、油性笔、污物盘、普通冰 柜、奥林巴斯 CX21型生物显微镜、拭镜纸、称量纸、药勺、牛皮纸、电炉、橡皮筋、锥形瓶、刻度尺、镊子、玻片、吸水纸、培养皿、高压蒸汽灭菌器、隔水式电热恒温培养箱等。 1.2 试剂药品 脓汁标本、粪便标本、营养琼脂、营养肉汤、半固体琼脂、普通营养琼脂培养基、伊红-美蓝培养基、斜面琼脂、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释品红、香柏油、拭镜油、葡萄糖微量发酵管 (2支)、乳糖微量发酵管(2支)、青霉素抗菌素纸片、先锋霉素?抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、蒸馏水、生理盐水、兔血浆、福氏志贺菌诊断血清等。 2.实验方法与步骤 实验的总流程: 培养基的制备?细菌的分离培养?细菌的纯培养?细菌的形态学检查?细菌的生化试验等?细菌的血清学试验、结果 2.1培养基制备 (1)营养琼脂培养基 营养琼脂干粉与蒸馏水按适当比例充分混合均匀?加热溶化?高压蒸汽灭菌?倒平板分装?琼脂完全凝固后，平板倒放?4?冰箱保存备用 (2)斜面培养基 营养琼脂干粉与蒸馏水按适当比例充分混合均匀?加热溶化?高压蒸汽灭菌?倒试管分装?培养基趁热斜放?琼脂凝固以后，4?冰箱保存备用 2.2空气与人体体表细菌学检查 2.2.1空气的细菌学检查 2.2.1.1实验方法 自然沉降法:根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位( Colony-Forming Units， CFU)，可了解空气的污染情况。 2.2.1.2实验步骤 每组1个营养琼脂平板，选择采样地点(实验室、卫生间、走廊等)?将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边?平板暴露于空气中15分钟?平板倒扣盖上?作标记?37?温箱培养24小时?观察结果 2.2.2人体体表的细菌学检查 2.2.2.1实验步骤 甲常规洗手，乙标准洗手，甲和乙共用1个平板。按下图在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。 2.3 细菌的分离培养 2.3.1实验方法 平板划线法:借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团(单菌落)。 2.3.2实验步骤 接种环烧灼灭菌?分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和伊红美蓝平板上，各做两份?烧掉接种环上多余的脓汁或粪便标本?冷却后，使用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板(2份)，粪便标本接种于伊红美蓝平板(2 份) ?接种环烧灼灭菌?将平板倒置37?培养18,24h?观察结果 2.4细菌的群体生长特性观察和纯化培养 2.4.1实验方法 斜面接种法:是一种从已经生长好的菌种中挑取少量菌种移植到另一个斜面培养基的饭方法。该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。用灭菌的接种环取单个菌落或少许细菌，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端。 2.4.2实验步骤 接种环烧灼灭菌?挑选平板上典型的四种单菌落(白色、金黄色、紫黑色、粉红色)进行斜面接种纯培养?做好标记?接种环烧灼灭菌?斜面培养基置于37?培养过夜?保存备用 2.5细菌的个体形态特征的观察 2.5.1实验方法:革兰氏染色法和肉汤接种法 2.5.2实验原理 革兰氏染色法:G，菌的细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。Gˉ菌的肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，稀释品红复染后呈红色。 2.5.3实验步骤 革兰氏染色法:涂片 ? 干燥 ? 固定? 染色 具体步骤如下: 取洁净玻片?用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上?挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀?待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合?结晶紫 ? 初染1分钟?水洗 ? 卢戈碘液?媒染1分钟?水洗 ? 95,乙醇?脱色约20秒钟?水洗 ? 稀释品红?复染1分钟?水洗 ? 吸干,镜检。 2.5.4肉汤接种法 接种环烧灼灭菌?分别在斜面培养物中挑取菌苔少许?立即移入肉汤培养基管中?在接近液面的管壁上轻轻研磨?沾取少量肉汤调和?混匀?试管口通过火焰2-3次灭菌?塞好棉塞?35?培养4-6小时 2.6 药敏试验 2.6.1实验方法 纸片扩散法:将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长 受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈。 2.6.2实验步骤 接种环烧灼灭菌?分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布?接 篇三:微生物实验报告 脓汁和粪便标本中病原菌的检测 专业: 学号: 姓名: 一、实验目的 探究检测其病原菌的类型并通过一系列的观察与鉴定从而确定其病原菌的名称和性质。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等技巧。从而掌握微生物实验的各种操作方法，培养对微生物实验的兴趣。 二、实验材料 器材 打火机、油性笔、酒精灯、接种 环、接种针、污物盘、普通冰柜、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯CX21型生物显微镜、电炉、试管(带棉塞)、称量纸、药勺、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、尺子、锥形瓶、高压蒸汽灭菌器、镊子、玻片、吸水纸、拭镜纸 试剂药品 普通营养琼脂培养基、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、石蜡油、 生理盐水、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红、葡萄糖微量发酵管(2支)、乳糖微量发酵管(2支)、青霉素抗菌素纸片、链霉素抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、血浆、福氏志贺菌诊断血清 三、方法与步骤 干粉培养基?蒸馏水?加热溶化?分装?集中放在试管筐里?罩上硫酸纸、牛皮纸? 用橡皮筋扎好 ?放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内?送到高压蒸汽灭菌室(洗刷室)?灭菌? (1)平板培养基:倾注平板10ml?琼脂完全凝固后，平板倒放?4?冰箱保存备用。 (2)斜面培养基:培养基趁热斜放?琼脂凝固以后，4?冰箱保存备用。 ?贴上标签后灭菌使用。 ?空气的细菌学检查 每组1个营养琼脂平板，选择采样地点(实验室、卫生间或任选地点)?将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边?平板暴露于空气中15min?平板倒扣盖上?作标记?37?温箱培养24h?观察结果。 ?人体体表的细菌学检查 甲乙常规洗手，丙丁标准洗手。甲和乙、丙和丁共用1个平板 按规定在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。 接种环烧灼灭菌?分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份，?烧掉接种环上多余的标本?冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板(2份)，粪便标本接种于伊红美蓝平板(2份)?接种环烧灼灭菌?将平板倒置37?培养18,24h?观察结果 。 接种环烧灼灭菌?挑选平板上典型的四种单菌落(白色、黄色、紫黑色、粉红色)进行斜面接种纯培养?做好标记?接种环烧灼灭菌?斜面培养基置于37?培养过夜?保存备用 ?革兰氏染色: 取洁净载玻片?用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上?挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀?待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合?结晶紫初染1min?水洗?卢戈碘液媒染1min?水洗?95,乙醇脱色约20s?水洗?稀释品红?复染1min?水洗?吸干,镜检。 ?肉汤接种法: 接种环烧灼灭菌?分别在斜面培养物中挑取菌苔少许?立即移入肉汤培养基管中?在接近液面的管壁上轻轻研磨?沾取少量肉汤调和?混匀?试管口通过火焰2-3次灭菌?塞好棉塞?35?培养4~6h 接种环烧灼灭菌?分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布?接种环烧灼灭菌? 标记:青、链、庆 ?镊子火焰消毒?贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片? 按压?镊子消毒?倒 置37?培养18,24h? 观察结果 取干净玻片一张?在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴，生理盐水1滴?接种环烧灼灭菌?冷却?分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(2,3个菌落的菌量)与血浆研磨混合?边混匀边观察结果?接种环烧灼灭菌?稍等片刻，观察结果 接种针烧灼灭菌?用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔?分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内?接种环烧灼灭菌?将微量管平放在平板内?37?培养过夜后?观察结果。 接种针烧灼灭菌?分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌?从半固体培养基中心垂直刺入，可刺达近底管处，但不要到达管底?循原来的路线退出接种针?试管口迅速通过火焰2-3次灭菌?塞好棉塞?烧灼灭菌接种针?37?培养24h?观察结果 取洁净的载玻片一张?将磨面近端设为对照区?滴加生理盐水15ul?远端设为试验区?滴加福氏志贺菌诊断血清15ul?接种环烧灼灭菌?用接种环分别取粉红色菌苔?研磨于盐水或血清内，混合均匀?接种环烧灼灭菌?载玻片来回倾侧?观察结果 四、结果与讨论 对脓汁中细菌的分析讨论 1、用普通平板，从脓汁标本中分离出金黄色和白色两种菌落。 2、在显微镜下观察时，这两种细菌均为G+球菌，排列不，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。 3、结合菌落的颜色，可以初步断定，这是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。 4、通过血浆凝固酶试验，观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明为凝固酶阳性;白色菌落则没有凝集反应，说明其为凝固酶阴性。 5、最后进行的是药敏试验，从培养基上可以观察到，不同的抗生素所形成的抑菌圈不同。其中青霉素对金黄色葡萄球菌最敏感。 对粪便中细菌的分析讨论 1、用伊红美蓝平板分离菌落时，可以从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落。 2、在显微镜下观察时，这两种菌均为G-杆菌，排列不规则，从形态上不能鉴别是什么细菌。 3、经糖发酵试验，可以观察到，紫黑色的细菌能使葡萄糖和乳糖的试管变色和产生气体;粉红色的细菌只能使葡萄糖的试管变色。 4、经半固体动力试验，观察到紫黑色的细菌使半固体培养基成浑浊状态，粉红色的细菌只在接种针插入的方向聚集。 5、综上所述，紫黑色的细菌为大肠埃希菌，粉红色的细菌为志贺菌。 6、最后进行药敏试验时，发现大肠埃希菌对青霉素不敏感，对庆大霉素和链霉素都敏感。 综上所述，脓汁标本中分离得黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白 色菌落为白色葡萄球菌，致病菌为金黄色葡萄球菌;粪便标本中 分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌，粉红菌落为福氏志贺菌，致病 菌为福氏志贺菌。