满汉合璧朱子家训

口蹄疫病毒对树突状细胞感染能力的研究(1.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062;2.中国疾病预防控制中心病毒病所，北京10005)0+S852.659.6中图分类号文献标识码A文章编号1672-9692(2009)06-001602-[摘要]树突状细胞(dendriticcell，DC)是重要的抗原递呈细胞，本研究发现，通过口蹄疫病毒(footandmouhtdiseasevirus，FMDV)感染DC细胞后可以有效感染小鼠骨髓来源DC，而且在感染后48h，FMDV对未成熟DC(imDC)的感染能力稍高于成熟DC(mDC)。[关键词]口蹄疫病毒;树突状细胞;感染口蹄疫(Footandmouthdiseas，eFMD)是由口1640培养液冲洗骨髓细胞，1500r/m5min离心蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus，FMDV)洗涤，加5ml无菌Tris-NHCl溶液悬浮细胞，室4引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性温静置2min裂解红细胞，再次离心5min。以61×10个/ml细胞密度接种于6孔培养板，培养液传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报中含有rmGM-CSF(10ng/ml、)rmIL-4(2ng/ml)、传染病之一。在机体中，树突状细胞(dendritic5cell，DC)是重要的专职抗原提呈细胞，在免疫10%胎牛血清、青霉素(1×10U/L)、链霉素应答中起关键作用。本研究探讨FMDV感染DC(100mg/L，)37?、5%CO、饱和湿度条件下培2的能力及DC中细胞因子转录水平的影响。养培养48h，弃悬浮细胞。第3天半量换液，补1材料足细胞因子。第6天收集未成熟树突状细胞1.1主要试剂rmGM-CSF、rmIL-4(Biovision;)(imDC)，同样细胞密度接种于6或24孔培养板细菌脂多糖(LPS);异硫氰酸荧光素(FITC)标记山中。其中一部分细胞添加含LPS的RPMI-1640羊抗鼠?抗;RPMI-1640培养液、MEM培养液培养液(LPS浓度为20ng/ml)，补足相应细胞因子及胎牛血清;口蹄疫标准阳性血清(购于兰州兽及血清，继续培养2d，获取成熟树突状细胞医研究所);Trizol;各种荧光定量酶。(mDC)。试验前用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮1.2毒株及细胞FMDVWFL株(TypeO，Gen,细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(bonemarrowderiveddendriticcel，BMDC)。经-lBankNO:EF175732;)BHK21细胞为本实验室-保存，试验前检测无其他微生物污染。流式细胞仪鉴定后可作下一步试验使用。2.3FMDV感染试验将TCD为100的FMDVI502方法6分别滴加于1×10个/ml的imDC和mDC中，37?BHK-21细胞在含5%FMDV病毒株培养2.1培养箱孵育2h，PBS洗涤3次，换新鲜培养液胎牛血清的MEM培养液、5%CO、饱和湿度、237?培养箱中培养。FMDV在细胞内多次增殖传继续培养(含完全生长因子及血清等)，在24h、代以增加病毒毒力，病毒悬液-80?保存备用。48h分别进行检测。按病毒致细胞病变作用(CPE)，采用终点稀释法2.4间接免疫荧光检测将FMDV分别接种于在96孔培养板滴定半数组织培养感染量24孔板中imDC和mDC培养24h，70%冷丙酮(TCID)。50固定30min，加入口蹄疫标准阳性血清，37?2.2DC培养依照参考文献，并经本实验室稍温育30min，PBS冲洗3次，加入1?50倍稀释的FITC标记的羊抗鼠gG，37?温育30min，I微改进培养DC。具体方法为:无菌分离C57bl/6PBS冲洗后甘油封片，于荧光显微镜下观察小鼠胫骨及股骨，使用1ml注射器吸取RPMI-FMDV感染情况。[收稿日期]2009-04-152009.62.5RT-PCR检测受染细胞内2BmRNA达采用光变化的差异，而荧光照片显示病毒在细胞内的感染部位主要存在胞浆区。Trizol法提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定总RNA的纯度(A260/A280，)进行RNA定量。采3.2感染FMDV的DC中2B基因的mRNA表达结果用RTPCR试剂盒进行反转录。对2B基因进行见表2。-表2比较阈值法检测FMDV感染DC后2B基因的相对定量荧光定量PCR扩增，检测FMDV中2B基因的表GroupCTCTΔCTΔΔCT2BgeneamoDuCntofm达情况;同时，以βactin作为内参照，分别--ΔΔCT2Bgeneβ-actin2BgenerelativetoimDC(2)设24hDmC计并合成了引物及TaqMan探针(上海基康公司)，7.30?2.1242.99?2.442.31?2.18-0.04?2.181.0(30.2269~4.658)92Average24himDC表1引物设计基因引物序列?1.5261.25?0.752.35?1.640.0?1.641.0(00.3209~3.1167)28.60Average2B2B-TAMRA-FP5′-CGAAACACGGACCCGA-3′CTT48hDmC2B-TAMRA-RP5′-CGGTCCTGATGGCCTGA-3′T2.26?1.60?4.3257.84?1.8-44.35?1.600.21(0.0689~0.6329)23.49Average5′-FAM-CTCAAACGCGGACACCAGTCGGT-TAMRA-T2B-TAMRA-FAM48himDC3′β-actinTAMRA-PF5′-CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC3′-0.0?2.52?3.5294.41?1.5-06.61?2.521.00(0.1~7543.7583)22.81Average5′-TAGAGGTCTACGGATTTGTACGTCCA-TAMRAPR-TAMRA-FAM5′-FTCCTTCTATGGATGGGTATCCTGT-GGCP3′3′由表2可知，24h检测时mDC中2B的表达略高于imDC，高3%;48h检测mDC中2B见表1。的表达仅是imDC的21%。用灭菌四蒸水将引物和探针稀释为100μmol/L，各取5μl，引物稀释为20μmol/L、探4讨论DC是机体重要的专职抗原递呈细胞，在针针稀释为对病毒的免疫应答中发挥重要作用。本研究建立10μmol/L。反应条件:94?预变性10min，94?了FMDV感染DC的实验模型，采用多种检测手15s、54?1min，40个循环。然后，用比较阈段证实，FMDV可有效感染DC，且对不同分化值法分析不同样品中FMDV基因的相对表达量，阶段DC的感染效率差异并不明显，这可能是由计算方法为:?ΔCT试验组=处理样品2B基因于不同分化状态DC膜表面某些受体表达差异影扩增CT值-处理样品β-actin扩增CT值;Δ响感染效率。有资料显示，口蹄疫病毒在感染细CT对照组=对照组样品2B基因扩增CT值-对照胞后，对MHCI的抗原肽的表达有所下调，很有组可能导致了FMDV在宿主体内的持续性存活，特样品β-actin扩增CT值。?ΔΔCT=ΔCT试2.6统计学处理统计数据应用SPSS10软件别是感染2:3h后，由FMDV介导的宿主细胞的ΔΔCT-验组-ΔCT对照组。?以2评估处理组分析。以均数?标准差(x?s)表示，统计方法比较蛋白质合成系统不被关闭。因此，在FMDV感染FMDV宿主后，就不能迅速地向T淋巴细胞递呈抗原，用t检验分析。基因的相对于对照样本的倍数。刺激免疫应答。但这种感染imDC后影响DC功3结果能的机制是否是因为感染后细胞表面分子表达的FMDV可以有效感染imDC和mDC3.1光镜下，改变或其他原因抑制其成熟，从而影响T细胞应FMDV感染DC后无明显细胞病变，由间接免疫答启动阶段信号，使感染对DC吞噬、处理抗原荧光检测可知:FMDV在感染DC24h后荧光强能力具有影响的原因并不是很清楚。许多感染的度达到最强，见图1。其后荧光显微镜下未见荧发生与持续是由于DCs的数量和功能的缺失，导致DCs无法诱导初次免疫应答和激活特异性CTL，同时也可能导致记忆性T细胞、B细胞的缺失，使机体无法对病原体产生再次免疫应答。所以，进一步研究FMDV感染DC后对其递呈能力的影响以及抗病毒免疫过程中病毒对DC功能影响的研究对该病的预防及治疗具有一定的理论图1FMDV在imDC和mDC中感染情况指导意义。(1:FMDV-imDC;2:FMDV-mDC)2009.6