EN 10139

水杨酸经无毛小鼠皮肤的扩散试验 学号： 132********  姓名： 冯兴业  导师：陈钧 1．实验目的与要求 通过水杨酸经无毛小鼠全皮及去角质层皮的扩散试验，掌握体外经皮扩散试验的以及药物透皮参数的计算方法。学习无毛小鼠全皮玻璃和去角质层皮的制备方法。 2．实验指导 药物通过皮肤的扩散为被动扩散。皮肤对各种药物的透皮特性在体外可用扩散池（diffusion cell）进行研究，以人或动物的离体皮肤（全皮或分离的各层皮肤）作为皮肤模型。本实验采用K-C垂直扩散池。离体皮肤固定于两个半池的结合部，角质层朝向供给池。供给池内的的药物在一定条件下不断通过皮肤向接受池扩散。 3．实验内容 1. 全批处理：取无毛小鼠，断颈处死或水合氯醛麻醉后，用手术剪剪取背部或腹部皮肤，然后小心剔除皮下肌肉组织，取得离体全皮。将处理好的离体皮肤置于载玻片间，用游标卡尺测量皮肤的厚度。 2. 去角质层皮肤的处理：首先将无毛小鼠四肢固定，用封胶带均匀贴在欲除去角质层的皮肤上，然后揭去胶带，反复操作30-50次，即可除去角质层。测定去角质层皮肤的厚度。 3. 用游标卡尺测量接收池口至少三个方向的直径，计算扩散面积。接受池中加入一粒搅拌子。 4. 剪取适当大小的皮肤，将真皮层对着接受池，夹于两池接口处，用固定器固定，以免渗透溶液。将各对扩散池置于透皮扩散试验仪（TK-20A)中，调整水域温度为37±0.5℃，搅拌转速控制为200rpm。 5. 在扩散池的的接受池内加入蒸馏水至于皮肤界面平齐，装置加水前后称重，重量相差值即为接收介质的真实体积。然后，供给池中加入饱和水杨酸溶液2.2ml，适当添加水杨酸晶体若干以维持试验过程中供给液的包和浓度，池口用Parafilm密封。 6. 装置平衡10分钟后开始时间，分别于1、2、3、4和5h自接受池内取样1ml，并立即补入同温蒸馏水1ml。另分别于0h和5h从供给池中取样200ul。精密吸取接受池样品0.8ml，用蒸馏水稀释至5ml，用紫外分光光度计于303nm处测定溶液的吸收度；供给池样品用蒸馏水稀释至50ml，同样测定浓度，取两个时间点供给池浓度的平均值作为Cd。 7. 进行去角质层皮夫的经皮透皮实验时，加液后应立即计时，接受池的取样时间点为0.5、1、1.5、2、3h取样2ml，并立即补入同温蒸馏水2ml。精取接受液1ml用蒸馏水稀释至8ml，紫外测定。供给池于0h和3h取样200ul，样品用蒸馏水稀释至50ml，同法测定。 4．数据处理 用曲线计算水杨酸的浓度，并用下式校正取样损失： Cn校=Cn实+V/VrΣcCn-1实 其中Cn实：各取样点实测浓度；Cn校：各取样点累积透皮浓度；V:每次取样体积；Vr：接受液体积。 计算单位扩散面积的累积透皮量Q=Cn校 X Vr/A(Vr-接受液体积，A-扩散面积） 以扩散达稳态时的累积透皮量（Q）对时间（t）作图并回归得方程：Q=Kt+B,其中k为斜率,B为截距。 根据下列公式分别求算药物的透皮参数：J（流通量，flux，ug/cm2h）、P（透皮系数，permeation，coefficient，cm/h)、tlag（时滞，lag time，h）、D（扩散系数，cm2/h) J=K, P=J/Cd, tlag=|-B/K|, D=h2/6tlag 其中Cd：供给池中药物浓度（ug/ml); h: 皮肤厚度（mm） 标准曲线方程：C（ug/ml)=48.41A+0.0025(r=0.9999) 浓度（ug/ml)  41.12  20.56  10.28  4.112  1.028 吸光度A      0.8519  0.4182  0.2141  0.0866  0.0216 5．实验数据记录及处理(见附页） 6．讨论（见附页） 附页 实验数据记录及处理 部位：腹部皮肤 ； 肤厚度：0.32mm ； V：1ml ；  Vr：17.6ml 接受池直径r（cm） 扩散面积（cm2） 1 2 3 平均值 2.020 1.992 1.994 2.002 2.002           供给池浓度Cd（μg/ml） 第1次取样浓度 最后取样浓度 5.6107985 0.24455 10.977047       取样时间t （h） 吸光度 A 实测浓度Cn （μg/ml） 校正浓度Cn校（μg/ml） 累计透皮量 （μg/cm2） 1 0.036 1.74526 1.751826148 15.40066943 2 0.045 2.18095 2.187534986 19.23107680 3 0.921 44.58811 44.5972463 392.0637038 4 0.89 43.0874 43.09641273 378.8695625 5 0.9262 44.839842 44.84899936 394.2769175           回归方程：y=111.74x-95.249 P 19.91694589 J 111.74 td 0.852416324 D 0.020021516     实验讨论 此次实验所得数据线性关系较差，从实验结果可以看出实验过程有很多值得反思的地方： 1. 对皮肤的处理未达到理想状态，出现皱褶情况，并在第一次取样点时，发现皮肤破裂，直接导致实验失败。 ：皮肤敷上扩散口时，可能绷得太紧而导致破裂； 处理：向其他组借得多余装置继续实验。 2. 在用注射器取样时，发现有溶液滞于橡皮管内，造成第一次取样产生误差。 处理：接下来的取样更换成移液枪取样。 3. 所测得数据线性关系比较差，R2较小，可信度不高，与其他组对比分析发现，本组实验数据明显偏高。 分析：取样结束后，经仔细检查，未发现皮肤有破损情况，查看每次取样体积，稀释倍数等实验记录，也未发现异常，其具体原因有待进一步分析讨论。