基因芯片技术在辐射生物学领域的应用

基因芯片技术在辐射生物学领域的应用 () ()满其航 张超 杜丽 尹金玲 综述崔玉芳 审校 巴结免疫组织淋巴细胞凋亡指数增高的同时 ,bcl2X蛋白表达 L 【关键词】 辐射 ;寡核苷酸序列分析 ;细胞凋亡 ;细胞周期 [7 ] 明显下降 ,照射后 1d 分别降至对照组的 27 %、43 %和 45 %。【中国图书资料分类号】 R3921 12 【文献标识码】 A 此研究还发现在 6,12 Gy 剂量范围内 ,随凋亡率的增加 ,bcl2X L() 057727402 20091121382203 【文章编号】 表达呈剂量依赖性降低 ,这种量效关系比 bcl22 更为明显 ,显示 辐射能引起机体分子水平的复杂调控 ,不同组织细胞 、同一 了该基因在淋巴细胞的凋亡调控中至关重要 。 组织来源不同性状的细胞 ,其基因对不同剂量的辐射反应各异 。 有关 Bax 、p53 等促凋亡蛋白的研究显示 ,用 1 Gy X 线单次 不同剂量辐射后可引起细胞或组织多种差异基因表达上调或下 照射健康成人外周血分离纯化的淋巴细胞后 8h ,基因芯片技术 调 。本文综述了其中某些与细胞凋亡 、DNA 损伤修复和应激 、 发现 Bax 和 TNFRS F10B 促凋亡基因表达明显上调 ,实时 [8 ] [9 ] 细胞周期 、信号转导 、免疫反应和防御等相关的重要基因的最新 定量 PCR 技术验证与芯片检测结果一致。Cui 等用不同剂 γ 量射线照射小鼠后 ,发现免疫组织淋巴细胞凋亡率呈剂量依研究进展 。 赖性增加 ,Bax 基因和蛋白也呈相同变化趋势 。照射后在淋巴 1 细胞凋亡相关基因 组织和外周血中 Bax 蛋白阳性淋巴细胞持续增加 ,分别于照射 [1 ] 2 后 1 、3 、7d 达到高峰 ,与淋巴细胞凋亡率呈现较好的相关性 。 Zhang 等用 40J / m、波长 254nm 的紫外线照射凋亡抗性() ( ) UACC903和凋亡敏感[ UACC903 + 6]的恶性黑色素瘤细胞 Bax 蛋白的定量分析也证实 ,Bax 在辐射诱导的淋巴细胞凋亡调 株后 ,用 hMitChip3 基因芯片技术检测其基因表达谱 ,结果发现 控中起重要促进作用 。在所检测出的 154 个差异基因中 ,促凋亡基因 FDX1 、BAD 和 2 DNA 修复和应激基因 ( ) BID 在 UACC903 + 6细胞中明显上调 ,而 FDXR、BA KR、FAS、 CASP6 、CASP3 和 APAF1 等在 UACC903 细胞中明显下调 ,抗凋 [1 ] ( ) Zhang 等用基因芯片技术检测凋亡敏感 UACC903 + 6( ) 亡基因 MCL1 、BCL2L1 在 UACC903 + 6细胞中明显下调 ,而在 和凋亡抗性 UACC903 两种人恶性黑色素瘤细胞株后发现 ,照射 UACC903 细胞中显著上调 。实时定量 PCR 和 Western blotting 前所检测的 5 种 DNA 修复基因在两种细胞株中未见差别 ,而照 技术验证结果与芯片检测结果基本一致 ,如照射前后促凋亡基 射后 FANCD2 、APEX1 和 APEX2 DNA 修复基因在凋亡抗性( ) 因 BA K1 和 FAS 在 UACC903 + 6中表 达 水 平 均 明 显 高 于 UACC903 细胞中明显上调 ,增加了该细胞株的辐射抗性 ,从另 UACC903 细胞 。作者还应用 Fas 配体蛋白诱导的细胞凋亡和 一角度解释了两种细胞株辐射敏感性差异的分子基础 。另外 , γ用基因芯片技术检测 2 Gy 和 10 Gy射线单次照射的 A H H21 细 ( ) BA K1 蛋白的 siRNA 基因沉默技术证实了 UACC903 + 6和 胞后发现 ,DNA 修复基因 PIG3 分别上调 61 9 和 51 5 倍 ,XPC 上 UACC903 两种细胞辐射敏感性差异的内在分子机制 ,为临床治 调 21 9 和 317 倍 。PIG3 和 XPC 均依赖 p53 的激活而激活 ,因为 疗提供了新的候选靶标 。 p53 能与其启动子区域的 5′端核苷酸微卫星序列结合 ,诱导基因 (半胱2天冬氨酸级联蛋白酶家族 cysteine aspartate specific 表达 。PIG3 蛋 白可使损伤细胞阻滞在 G期 或 引 起 细 胞 凋 1 [1 ] [10 ] ) proteinase , Caspase是细胞凋亡的核心成分 , Zhang 等用基因 亡。XPC 蛋白作为一个进化保守的 DNA 修复酶 ,能迅速识别 受损 DNA ,与 H HR23B 形成复合物 ,参与核苷酸切除修复的启 芯片证实 Caspase23 、6 均为重要的级联蛋白酶分子 ,在线粒体和 [11212 ] [8 ] [2 ] [3 ] 动 ,利于 p53 等 DNA 修复基因参与 DNA 修复。Mori 等死亡受体介导的细胞凋亡途径中居于枢纽位置。Samuni 等报(还应用基因芯片技术发现 DNA 损伤结合蛋白 2 DNA damage () 道 6 、10 Gy 电离辐射可诱导人成纤维细胞 T K6 凋亡 24h 后, 同) binding p rotein 2 ,DDB2基因和 XPC 的表达水平增加 3 倍以上 , [4 ] γ时 Caspase23 及 p53 水平增高 ;Zhang 等用 2 、5 、10 Gy射线 照实时定量 PCR 技术验证与芯片结果一致 。DDB2 是核苷酸切除 射人非小细胞肺癌 A549 细胞后发现 ,Caspase23 表达水平明 显() 修复 nucleotide excision repair ,N ER通路中重要的修复基因 ,其 升高 ,并伴有 S 期细胞减少 。有研究应用平均功率密度为 2 、 蛋白产物 p48 可与 p127 相互作用 ,生成一种紫外线损伤 DNA 2 结合复合体 ,后者可与各种类型的损伤 DNA 结合并参与所有的 ( ) 10、50mW/ cm的 S 波段高功率微波 HPM辐射大鼠 ,1d 后心肌 核苷酸切除修复 。该结果提示 DDB2 可能在核苷酸切除修复中 细胞 Caspase23 表达增强 ,至 7d 时仍有较强表达 ,28d 后恢复 ,表 起重要作用 。 明 Caspase23 是辐射致凋亡过程中的一个重要调节分子 ,参与了 [5 ] 电离及 HPM 等非电离辐射所致机体损伤的病理生理过程。 BCL2L1 是 bc122 家族的重要成员 。bc122 家族是重要的凋 (亡调控基因家族 ,可分为促凋亡基因 Bax 、BAD 、BA K1 和 BID ) () 等和抗凋亡基因 bcl22 、bcl2X等两大类 。bcl22 家族编码的促 L 3 细胞周期相关基因 凋亡和抗凋亡蛋白可形成同/ 异型二聚体 ,它们之间的比例决定 [13 ] [6 ] Kumaraswamy 等用 2 Gy X 线照 射肿瘤细胞和正常细 了 Caspase 活化与否 ,并最终决定细胞凋亡或存活 。Cui 等用 4 () 2,12×10kV/ m 电磁脉冲辐射诱发犬淋巴细胞亚群凋亡 ,结 【作者单位】 100850 北京 军事医学科学院放射与辐射医学研究所 果显示 ,当免疫组织和外周血淋巴细胞凋亡率呈剂量依赖性增 () (满其航、杜丽 、崔玉芳;辽宁医学院校外培养基地航天中心医院 满其 加时 ,淋巴细胞 bc122 基因和蛋白则呈持续下降趋势 ,甚至无阳 )航、张超、尹金玲 γ性表达 。另有研究发现 ,6 Gy射线照射后 ,小鼠胸腺 、脾脏和淋 【通讯作者】 崔玉芳 , E2mail : yufangc @vip1 sina1com + γ6h 用基因芯片技术检测发现 ,在两种细胞中均出现上调的 胞后 使 CD8 T 细胞的 IFN2分泌增加 ,并可促进 TCR 介导的 IL22有 7 种基因 ,其中细胞周期相关基因 myc 下调明显 。myc 基因 的激活 。另外 ,在淋巴结中上调的 IL215 与 IL22 具有同源性 ,且 (家族属核蛋白类 ,目前已知的 myc 家族成员有 3 个 :C2myc cell2 生物学功能相似 ,均可以激活 N K 细胞 ,刺激外周血 T 淋巴细 ( ) ) ( ) ( myc、N2myc human neurohlastomas和 L2myc small cell lung 胞 、肿瘤浸润淋巴细胞 TIL s和 B 细胞的生长 。 ) carcinomas。myc 是一类“快速早期反应基因”的细胞内信使 ,在 6 细胞骨架相关基因 细胞由 G期进入 G期 ,即由静息状态进入增殖状态前就可因 0 1 有丝分裂原刺激而出现高表达 。在大多数生长刺激因素的作用 γ研究表明 ,用 20c Gy射线照射 A H H21 细胞后 4h ,基因芯 [20 ] 下 ,在 G期的前 2h myc 即被强烈诱导并在连续增殖细胞的整 0 ( ) 片技术即可检测到着丝粒蛋白基因 CENPF下调。CENPF 个周期中保持高表达 。myc 蛋白被认为对促进细胞进入 S 期完 是一种细胞骨架和运动相关蛋白 ,在细胞分裂间期是激活转录 [21 ] 成 DNA 合成具有关键作用 。myc 家族基因在多种类型的肺癌 因子 ATF 4 的负调控蛋白。在细胞有丝分裂期 ,CENPF 与外 中过表达可使细胞提前进入 S 期 ,导致细胞周期阻滞的丧失和 部动力板短暂结合 ,促进着丝粒黏附 ,在染色体排列中起着重要 [14 ] 生长失控 。田梅等用 0, 10 Gy X 线照射稳定转 染 PTEN作用 。CENPF 过早缺失可诱导染色体去凝集 ,引起细胞凋亡 。 [10 ]() pho sphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten基 因此 CENPF 在细胞凋亡和分化中发挥双重作用 。龙贤辉等因的人脑胶质瘤 SH G244 细胞后 ,发现 PTEN 蛋白的相对表达 γ用 5c Gy射线照射 A H H21 细胞后 4h ,基因芯片技术检测可发 量明显增高 ,推测 PTEN 基因转录水平上调 。在 0,5 Gy 照射剂 现细胞骨架基因 CCT5 明显下调 。CCT5 属于 TCP1 复合体的 量内 PTEN 蛋白的相对表达量随剂量增加而增加 , PTEN 基因 () 分子伴侣 chaperonin containing TCP1 complex , CCT家族成员 稳定转染联合辐射可诱导肿瘤细胞 G期阻滞 ,并与 p27 表达上 1 () 之一 ,编码蛋白主要与细胞骨架蛋白 肌动蛋白 、微管蛋白相互作用并形成复杂的分子结构 ,对维持细胞膜的稳定性及信号转 调有关 。P TEN 是除 p53 基因之外的又一个在细胞凋亡及生长 [22 ] γ导非常重要 。宋立华等用 41 56 Gy射线照射昆明种小鼠 ,用 中发挥重要调节作用的抑癌基因 。Bio Star2M40S 芯片检测肝组织发现 ,下调基因中较多的是细胞 ( ) ( ) βα骨架基因 ,如2肌动蛋白 M0103f10、2肌动蛋白 M0138e07基 4 信号转导相关基因 因等 。由于肌动蛋白 、肌球蛋白等细胞骨架蛋白对于维持细胞 的形态和正常的生理功能具有重要意义 ,所以此类基因的下调 相邻细胞之间的信息和物质能量交换过程主要通过细胞间 () 隙连接通讯 gap junction intercellular communication , GJ IC完成 , 提示辐射可导致细胞基本结构损伤和功能异常 。 () GJ IC 主要由间隙连接蛋白 connexin ,Cx组成的间隙连接通道 () αβγgap junction , GJ 构成 。Cx 家族有 21 种同系物 ,分为、、三 个 α亚型 。Cx43 为亚型 ,在细胞之间的通讯中发挥重要作用 。 7 小 结 [1 ] Zhang 等用基因芯片技术检测发现 ,Cx43 基因在 UACC903 和 ( ) UACC903 + 6中均出现下调 。有证据表明 ,Cx 家族具有抑癌 作由于基因芯片技术具有快速 、高效和高通量的特点 ,故近年 用 ,紫外线下调该基因的表达 ,可为紫外线致癌提供分子水平 的依来在辐射分子生物学领域得到广泛关注和应用 ,并取得了重要 [15 ] [16 ] 据。在众多人类肿瘤中 Cx43 基因表达明显下调,也 从另一[17 ] 进展 。然而辐射对生物体的作用是一系列复杂的连锁过程 ,该 角度证实该基因具有抑癌作用 。Glover 等研究表明 , 正常人纤 γ技术也存有明显不足 ,如由于灵敏度的限制 ,采用现有的 DNA 维上皮细胞经 01 5 Gy 低剂量射线照射后 ,Cx43 在转 录水平和翻 译水平均明显升高 ,证实 Cx43 为辐射诱导表达基 因 。微阵列芯片难以检测到表达水平很低的基因 。由于基因表达的 [13 ] Kumaraswamy 等用基因芯片技术检测发现在肿瘤和正 常细胞调控可发生在多种层次和多个水平上 ,基因的功能具有多样性 、 ββ( () ) 中2连环蛋白 2catenin基因上调明显 。连环蛋白 cate2 nin ,Cat s[23 ] 复杂性的特点,因此 ,mRNA 水平的变化有时不能完全反映αβγ是一组具有相似结构的胞内糖蛋白家族 ,最早被分为 、、三 实际情况 ,还需要从蛋白水平 、转录调控等多个角度进行验证 。() 类 。Cat s 与跨膜糖蛋白钙黏蛋白 cadherin ,Cad的胞内 肽段结合 , 参与上皮细胞黏附和信号转导 。近期研究发现 ,许多 肿瘤细胞都【参考文献】 β出现2Cat 的基因突变 、表达异常 、转位等 ,因而已将 其定为一种新 的癌基因 。 1 Molecular mechanism underly2 Zhang Q Y , Wu J , Nguyen AT , et al[ 1 ] ing differential apoptosis bet ween human melanoma cell lines ( ) UACC903 and UACC903 + 6 revealed by mitochondria2focused () cDNA microarrays1 Apoptosis , 2008 , 13 8:993 [ 2 ] Wang ZB , Liu YQ , Cui YF1 Pat hways to caspase activation1 Cell Bi2 5 免疫相关基因 () ol Int , 2005 , 29 7:489 Samuni AM , Kasid U , Chuang EY , et a11 Effect s of hypoxia on ra2 [ 3 ] 2 有学者用 10mW/ cmHPM 辐照 129 小鼠 ,用含 14 112 个靶diation2responsive st ress2activated protein kinase , P53 , and caspase 3 基因的小鼠 cDNA 基因芯片进行检测发现 ,照射后 14d 淋巴结 () signals in T K6 human lymp hoblastoid cells. Cancer Res , 2005 ,65 2: 和胸腺组织中免疫反应和防御相关基因出现明显改变 ,其中 () Pap 基因 pancreatitis2associated protein是淋巴结中上调幅度最 579 [18 ] ( ) 大的基因,该基因属 Reg regenerating gene家族 。研究表明 [ 4 ] Zhang F , Zhang T , Gu ZP , et a11 Enhancement of radiosensitivit y by Pap1 是一种抗炎因子 ,能够抑制巨噬细胞和 AR42J 胰腺细胞系 roscovitine pret reat ment in human non2small cell lung cancer A549 [19 ] κ(中 NF2B 的激活。L y6c lymp hocyte antigen 6 complex ,locus () cell s1 J Radiat Res , 2008 , 49 5:541 + ) C是造血祖细胞的细胞分化抗原 ,最早在外周 CD8 T 细胞的一 [ 5 ] 潘敏鸿 , 彭瑞云 , 高亚兵 ,等 1 高功率微波辐射对大鼠心肌超微结 个亚群中被发现 ,其主要的生物学功能是免疫反应和防御 ,能够 构和 caspase23 表达的影响 1 中华物理医学与康复杂志 , 2005 , 27 () 8:460 [ 6 ] Cui YF , Yang H , Gao Y , et al1 Effect and mechanism of elect ronic 徐娅蓓 ,陈国强. 间隙连接蛋白 43 的表达调控及其功能. 国际病 [ 15 ] () 理科学与临床杂志 , 2005 , 25 6: 477 ( ) pulse on perip heral lymp hocytes in dogs1 Chin Med J Engl, 2001 , [ 16 ] Zhang YW , Morita I , Ikeda M , et al . Connexin43 suppresses prolif2 () 114 10: 1019 [ 7 ] 崔玉芳 ,丁彦青 ,杜雪梅1 细胞凋亡与辐射免疫损伤研究进展 1 国 eration of osteosarcoma U2OS cells t hrough post2t ranscriptional regu2 () 外医学 ?放射医学核医学分册 , 2002 , 26 6: 271 () lation of p27. Oncogene , 2001 , 20 31: 4138 [ 8 ] Mori M , Benot mane MA , Tirone I , et al1 Transcriptional response to [ 17 ] Glover D , Little JB , Lavin MF , et al1 Low dose ionizing radiation2in2 ionizing radiation in lymp hocyte subset s1 Cell Mol Life Sci , 2005 , 62 duced activation of connexin43 expression1 Int J Radiat Biol , 2003 , 79 () 13: 1489 () 12:955 [ 9 ] Cui YF , Gao YB , Yang H , et al1 Apoptosis of circulating lympho2 [ 18 ] 崔玉芳 , 杨姝雅 , 徐菡 ,等1 高功率微波辐照小鼠免疫组织基因表 () 达谱初步分析 1 感染 、炎症、修复 , 2005 ,9 6:141 cytes induced by whole body gamma2irradiation and it s mechanism1 J () [ 19 ] Vasseur S , Folch2Puy E , Hlouschek V , et al1 p8 improves pancreatic Environ Pat hol Toxicol Oncol , 1999 , 18 3:185 γresponse to acute pancreatitis by enhancing t he expression of t he anti2 [ 10 ] 龙贤辉 ,徐勤枝 ,贺性鹏 ,等 1 2 Gy 和 10 Gy射线照射正常人淋巴 母细胞基因表达转录谱的比较1 中华放射医学与防护杂志 , 2006 , inflammatory protein pancreatitis2associated protein I1 J Biol Chem , () 4 26:110 () 2004 , 279 8:7199 [ 11 ] Nicholl s CD , Shields MA , Lee PW , et al1 UV2dependent alternative γ[ 20 ] 王会平 , 龙贤辉 , 徐勤枝 , 等1 基因芯片技术分析 20c Gy射线照射 splicing uncouples p53 activit y and PI G3 gene f unction t hrough rapid () 人淋巴母细胞中差异表达的基因谱1 辐射防护 , 2006 , 263:151 () proteolytic degradation1 J Biol Chem , 2004 , 279 23:24171 [ 21 ] Zhou X , Wang R , Fan L , et al1 Mitosin/ CENP2F as a negative regu2 [ 12 ] Wang Q E , Zhu Q , Wani MA , et al1 Tumor suppressor p53 depend2 lator of activating t ranscription factor241 J Biol Chem , 2005 , 280 ent recruit ment of nucleotide excision repair factor s XPC and TFII H () 14:13973 () () to DNA damage1 DNA Repair Amst, 2003 , 2 5:483 60 γ[ 22 ] 宋立华 , 颜宏利 , 蔡东联 1 Co2照射后早期小鼠肝组织基因表 () 达谱1 第二军医大学学报 , 2006 , 27 4:386 [ 13 ] Kumaraswamy S , Chinnaiyan P , Shankavaram U T , et al1 Radiation2 γinduced gene t ranslation profiles reveal t umor t ype and cancer2specific [ 23 ] 崔玉芳 ,姜竺君 ,杜丽 ,等12射线照射小鼠胸腺组织基因表达转录 () () component s1 Cancer Res , 2008 , 68 10:3819 谱分析 1 中华放射医学与防护杂志 , 2009 , 29 4: 355 () [ 14 ] 田梅 ,吴丛梅 ,刘林林 ,等 1 P TEN 基因稳定转染联合辐射对肿瘤 2009206211 收稿 2009208217 修回kip1 细胞周期进程及 G期激酶抑制蛋白 P27表达的影响 1 吉林大 1 ()责任编辑 李恩江() 学学报 ,2007 ,32 2:195 Regist ry of Acute Aortic Dissection experience1 J Thorac Cardiovasc ()上接第 1375 页 () Surg , 2005 , 129 1:112 管通透性增加 、深低温停循环 、术前即存在心功能不全 Miller DC , Lansman SL , Cameron DE , et al1 Aortic surgery sympo2 [ 3 ] 或肺水肿 、术后主动脉远端仍存在夹层且假腔大于真 sium ?discussion : section 32Dissecion1 Ann Thorac Surg , 2002 , 74 腔导致左室后负荷增高 、大量使用血液制品等因素有 () 5:S1751 Pompilio G , Spirito R , Alamanni F , et al1 Determinant s of early and [ 4 ] 关 。我们认为 ,术后发生低氧血症时应延长呼吸机辅 late outcome after surgery for t ype A aortic dissection1 World J Surg , 助通气时间 ,常规使用 PEEP ,不应急于停用呼吸机或 () 2001 , 25 12:1500 拔除气管插管 。在患者肺部无明显炎症和水肿 、动脉 Hirst A EJ , Johns VJ , Kime SWJ1 Dissecting aneurysm of t he aorta : [ 5 ] 血气满意的情况下才考虑停机拔管 。另外 ,应积极使 a review of 505 cases1 Medicine , 1958 , 37 :217 用强效 、广谱抗生素 ,必要时联合用药 ,预防和控制肺 Hagan P G , Nienaber CA , Isselbacher EM , et al1 The international [ 6 ] ( ) Regist ry of Acute Aortic Dissection IRAD: new insight s into an old 部感染 ,加强脱水利尿 ,适当维持液体负平衡 ,适当应 () disease1 J AMA , 2000 , 283 7:897 用多巴胺等血管活性药物 ,避免心源性肺水肿 。 Kapustin AJ , Litt HL1 Diagnostic imaging for aortic dissection1 Se2 [ 7 ] 总之 ,DeBakey I 型主动脉夹层病情凶险 ,围术期() min Thoracvasc Surg , 2005 , 17 3:214 处理难度大 ,死亡率和并发症发生率很高 。术前应力 Kawahito K , Adachi H , Yamaguchi A , et al1 Preoperative risk fac2 [ 8 ] 争在最短时间内完成病情评估和必要的手术准备 ,术 tors for hospital mortalit y in acute t ype A aortic dissection1 Ann () Thorac Surg , 2001 , 71 4:1239 中根据病变情况决定手术 ,术后加强综合性治疗 Suzuki T , Ito T , Kashima I , et al1 Continuous perf usion of pulmo2 [ 9 ] 特别是呼吸机治疗 ,这些精细完善的围术期处理措施 nary arteries during total cardiopul monary bypass favorably affect s 是手术成功的重要保证 。 levels of circulating adhesion molecules and lung f unction1 J Thorac () Cardiovasc Surg , 2001 , 122 2:242 【参考文献】 [ 10 ] Nakajima T , Kawazoe K , Izumoto H , et al1 Risk factors for hypox2 [ 1 ] Bavaria J E , Pochettino A , Brinster DR , et al1 New paradigms and emia after surgery for acute t ype A aortic dissection1 Surg Today , improved result s for t he surgical t reat ment of acute t ype A dissection1 () 2006 , 36 8:680 ()2009203225 收稿 2009209230 修回 () Ann Surg , 2001 , 234 3: 336 [ 2 ] Trimarchi S , Nienaber CA , Rampoldi V , et al1 Contempporary re2 ()责任编辑 胡全兵 sult s of surgery in acute t ype A aortic dissection : The International