7 第七章 外源化学物致突变作用

第七章  外源化学物致突变作用 【教学目的】 在掌握突变的概念、类型和后果的基础上，学习化学致突变的发生机理和机体的反应，学习如何检测化学致突变作用，怎样评价遗传危害。 【教学】 1．掌握：基本概念(突变、自发突变与诱发突变、致突变作用与致突变物)；化学毒物致突变类型(基因突变、染色体畸变)；致突变试验的遗传性终点和试验组合的选择；Ames试验；微核试验；姐妹染色单体交换试验。 2．熟悉：化学毒物致突变机制(直接以DNA为靶的突变、不以DNA为靶的突变)；突变的不良后果(体细胞突变的不良后果、生殖细胞突变的不良后果)；哺乳动物细胞正向突变试验、染色体畸变分析、显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验、程序外DNA合成试验。 3．了解：非整倍体和多倍体突变 【教学内容】 1．基本概念和遗传学基础：突变、自发突变与诱发突变；致突变作用与致突变物。 2．化学毒物致突变的类型：基因突变、染色体畸变、非整倍体和多倍体。 3．化学毒物致突变作用的机制及后果：直接以DNA为靶的突变；不以DNA为靶的突变；突变的后果。 4．机体对致突变作用的影响：DNA损伤的修复；遗传因素对致突变作用的影响。 5．观察化学毒物致突变作用的基本方法：观察项目的选择；常用的致突变试验（Ames试验、微核试验、姐妹染色单体交换试验）；致突变试验中的一些问题。 第一节  概述 一、基本概念（掌握） 生物在世代繁衍中存在着遗传与变异，它是普遍存在于生物界的生命现象。生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续，这个过程称为遗传。遗传是保持生物种族特性的根本。遗传的稳定是相对的，一方面生物的遗传物质在自我复制过程中有可能发生改变；另一方面生物个体发育在受到复杂变化的内外环境条件影响下，性状的发育可能有所不同。于是在亲子之间或于代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为变异（variation）。变异是生物物种推陈出新的来源。 造成生物变异的原因有： ①亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生； ②由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源； ③由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。 1．突变（mutation） ：遗传结构本身的变化及其引起的变异称为，突变实际上是遗传物质的一种可遗传的变异。 ①自发突变（spontaneous mutation） ②诱发突变（induced mutation） 举例：有益的突变：花，情人节，蓝色妖姬 杂交水稻；大铃棉 另一方面，突变也会引起人类键康的危害． 有害的突变：物理因素（如X射线） 化学因素（如亚硝酸盐） 遗传毒理学：研究化学性和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物可能引起的健康效应。 主要研究致突变的作用机制，应用检测系统发现和探究致突变物，提出致突变物健康危害的方法。 2．致突变作用（mutagenesis）：广义概念是外来因素，特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。 3．基因突变（gene mutation）一个或几个DNA碱基对的改变。 4．染色体畸变（chromosome aberration）：到染色体的结构及数目改变。 5．致突变物（mutagen ）：能够引起突变的物质。 遗传毒性：对基因组的损害能力，包括对基因组的毒作用引起的致突变性及其他各种不同效应。包括致突变性。可能转变为突变，也可能被修复。 致突变性：引起遗传物质发生突变的能力，在一个实验群体中突变率可以定量检测。 二、遗传学基础（了解） 1．DNA与基因 （1）基因（gene）：是DNA分子中最小的完整功能单位。 （2）基因组（genosome）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质称。 2．染色质与染色体在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质（chromatin） 。它由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量的RNA组成，形似串珠状的复合体。在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并折叠成染色体（chromosome） 。 （提问：故染色质与染色体是由相同物质组成的吗？） 3．体细胞和生殖细胞 4．基因型与型基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。 5．细胞周期、有丝分裂与减数分裂 第二节  化学毒物致突变的类型 遗传毒理学家主要关注三类遗传学损伤，即基因突变、染色体畸变及染色体数目改变。 一、基因突变 基因突变指基因核苷酸序列或数目的改变。 1．碱基置换 （base substitution ） 指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。 转换（transition）：嘌呤置换另一嘌吟，或者是嘧啶置换另一嘧啶。 颠换（transversion）：嘧啶换成嘌吟，或者嘌呤换成嘧啶。 二、染色体畸变 染色体畸变（chromosome aberration）指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。细胞学检测可发现染色体断裂及由断裂所致的各种重排。畸变涉及复制染色体中两条染色单体中的一条，称为染色单体型畸变（chromatid-type aberration），而涉及两条染色单体，称为染色体型畸变（chromosome-type aberration）。 染色体结构异常的类型： ① 无着丝粒断片和缺失（acentric fragment and deletion）：一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，且这些断裂的节段远远分开会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有丝粒的异常染色体。细胞再次分裂时会形成微核或微小体。 缺失：染色体上丢失了一个片段。 ② 环状染色体（ring chromosome）：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接成一个环，称之为环状染色体。 ③插入和重复（insertion and duplication） 一条染色体的某一节段插入另一染色体中称为插入（insertion，用ins表示）。 染色体上个别区段多出一份，称为重复（duplication，用dup表示）。 ④ 倒位（inversion ）：一个染色体片段被颠倒了，如颠倒的片段包括着丝点，称为臂间倒位（pericentric inversion）；如不包括着丝点则称为臂内倒位（perecentric inversion）。 ⑤ 裂隙和断裂（gap and brake）：都是指染色体上狭窄的非染色带，其所分割的两个节段保持线状连接为裂隙，否则为断裂。 ⑥ 易位（translocation）：一个染色体片段的位置发生改变。 三、非整倍体和多倍体 （aneuploidy）and （polyloid） 非整倍体指增加或减少一条或几条染色体； 例如，Down氏综合征。 多倍体指染色体数目成倍增加。 例如，人类体细胞正常为二倍体（2n），有46条染色体。如果有69条染色体，则定义为多倍体，此为三倍体。 第三节  化学毒物致突变作用的机制及后果 一、引起突变的DNA变化 （一）碱基损伤 1．碱基错配 2．平面大分子嵌入DNA链 3．碱基类似物取代 4. 碱基的化学结构改变或破坏 （二） DNA链受损 1．二聚体的形成 2．DNA加合物（DNA bulky adducts）形成 3．DNA-蛋白质交联物（DNA-Protein crosslinks，DPC）形成 二、引起突变的细胞分裂过程的改变 非整倍体和多倍体的产生不同于其他致突变作用，因为它们涉及不同的细胞靶分子。非整倍体和多倍体是由于染色体分离异常而产生的。主要涉及细胞分裂过程的改变如纺锤体，微管蛋白的合成与聚合，微管结合蛋白合成与功能发挥，细胞分裂纺锤纤维的功能发挥，着丝粒与之有关的蛋白质作用，极体复制与分离，减数分裂时同源染色体联合配对和重组等。 非整倍体细胞由正常细胞未分裂而产生，其原因有同源染色体减数分裂I期不能适当分离，或者姐妹染色体在减数分裂Ⅱ期，或有丝分裂期不能适当分离。不分裂的结果是纺锤体的一极接受了同源或两个染色单体，而另一极则没有。假定只有一条染色体或一对染色体不分离，在于细胞中将多出一条或一对染色体，而在另一于细胞中将少一条或一对染色体。 与非整倍体不同，多倍体涉及整个染色体有三种情况： ①在细胞增殖过程，细胞周期正常染色体复制，但在接下来的有丝分裂期，染色体分裂时，染色体单体不能分离，即产生一个4倍体细胞。 ②由于接受分裂错误，配子为2倍体，而不是单倍体，所以会产生一个多倍体的受精卵。 ③如一个卵子被一个以上精于授精，也将产生多倍体。 非整倍体与多倍体产生机制是相似的，可能有程度上不同。例如，对纺锤体形成的干扰，如完全阻止，即形成多倍体，如部分阻止，则形成非整倍体。当然，对于它们产生的生化机制已有一定研究，主要是有关纺团体的，现介绍如下： 1．与微管蛋白二聚体结合 2．与微管上的巯基结合 3．已组装好的微管的破坏 4．中心粒移动受阻 5．其他作用 三、其他的改变 对DNA合成和修复有关的酶系统作用可间接导致DNA损伤，诱发基因突变或染色体畸变。 1．DNA的高保真复制需多种酶类的参与，并且在基因调控下进行，其过程中的任何一个环节损伤，将影响DNA复制的高保真性，有可能引起突变。 2．修复 四、突变的后果 突变的后果，取决于化学毒物所作用的靶细胞，是生殖细胞，还是体细胞。如是体细胞，其影内仅能在宜接接触该物质的个体身上表现出来，而不可能遗传到下一代；如是生殖细胞，其影响才有可能遗传到下一代。图7-1显示两类细胞发生突变的可能后果。 基因突变和染色体畸变对于人类健康的重要意义在于其在遗传性疾病和肿瘤中所起的作用，这里将重点讨论。 1．生殖细胞突变基因突变对于健康的意义在于与许多按孟德尔定律遗传的疾病有关。 （1）基因突变除了引起按孟德尔遗传规律遗传的疾病外，在人类许多复杂病因的疾病中，遗传因素也起着部分作用。即增加下一代基因库（gene pool）的遗传负荷（genetic load）。基因库指某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。遗传负荷指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。 例如，在婴儿中，约有3％～6％受到先天性畸形的影响，在人群中，那些发病较晚的疾病．如心脏病，高血压及糖尿病．遗传因素影响的比例可高达60％。 （2）在遗传性疾病中，还有一个原因是染色体异常。 （3）突变除引起遗传病外，还可造成生殖毒性，表现为胚胎死亡、畸胎、胚胎功能不全及生长迟缓。生殖毒性可由亲代生殖细胞突变所致，也可由胚胎细胞突变所致。 2．体细胞突变 体细胞突变后果有肿瘤、衰老、动脉粥样硬化及致畸等，最受注意的是肿瘤。突变与癌发生过程有关的重要证据是来自于癌基因和抑癌基因的分子生物学研究。当原癌基因突变为癌基因后，可刺激细胞异常增殖，而抑癌基因的突变，可导致细胞增殖失去抑制作用。 癌基因作用在遗传学上有优势，当同细胞内正常的等位基因存在时，有一个单一活化的癌基因即可表达。原癌基因可经点突变和染色体畸变转变为活化的癌基因。 许多肿瘤涉及癌基因的活化和抑癌基因的失活。所观察到多基因改变将支持癌起源于遗传变化积累的观点，说明致癌作用是一多阶段、多步骤的过程。它包括引发（initiation） ，促癌（pro-motion，促长）和进展（progression）三个阶段。突变在引发和进展阶段中均有作用。 机体对致突变作用的影响 目前研究表明，个体对致突变物敏感性差异的原因有：代谢酶的遗传多态性；修复能力差异以及宿主因素等。机体对致突变作用的影响相当复杂，本节就机体修复机制、代谢酶遗传多态性等进行论述。 一、DNA损伤的修复 对于化学致突变作用的模式应为损伤-修复-突变模式。 1．光复活（photoreactivation） 2．“适应性”（adaptability） 3．切除修复（excision repair） 1）核苷酸切除修复 2）碱基切除修复 3）误配修复 （mismatch repair） 4．复制后修复 （post replication repair，PRR） 5．呼救性修复（SOS repair） 二、遗传因素对致突变作用的影响 前述已知，机体对DNA损伤至少有5类修复机制，化学致突变作用的模式为损伤-修复-突变，只有修复功能饱和或能力不足时才会引起突变。 （一）代谢酶遗传多态性 （二）修复功能的个体差异 1．O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT） 2．聚（二磷酸腺苷－核糖）多聚酶（PARP） 观察化学毒物致突变作用的基本方法 观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来进行。试验方法的研究发展很快，包括新方法的建立．原有方法的日益完善。目前已有200多种试验，但重要的和作为常规使用的约20种。 一、观察项目的选择 1．观察效应终点的类型 基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性惟一可取的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点（genetic endpoint）。 国际环境致突变物致癌物防护委员会（[CPEMC]于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类： ①DNA完整性的改变（形成加合物、断裂、交联）； ②DNA重排或交换； ③DNA碱基序列改变； ④染色体完整性改变； ⑤染色体分高改变。 其中③实际上指基因突变，④指染色体畸变。表7-1是较常见的致突变试验所反映的遗传学终点。 上述遗传学终点，并不能反映所有的致突变试验，例如，细胞转化试验，它的最终产物是形态、生长形式和生化反应变化了的细胞团。不能归于上述5类遗传学终点。 2．成套的观察项目由于一种致突变试验通常只能反映一个或两个遗传学终点。实际工作中，没有一种致突变试验能涵盖所有的遗传学终点，故需用一组试验配套进行检测。 遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。 那么是为什么呢？ ①化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，或生殖细胞，或两者兼而有之。故在成套观察项目小既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。 ②致突变物中仅少数具有直接致突变作用，体内试验具有完整的话化系统，而体外试验则通过加入模拟代谢系统，如S9来弥补缺乏活化系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。在选择体内、体外试验时．还需要对其方方面面深入了解。 ③化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物．而在另一系统中可能是弱的致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。 所以，对每一化学毒物都需要一组试验或成套试验，来评价其遗传毒性。 关于遗传毒理学成套观察项目中哪些试验可入选的原则有： ①已知遗传毒性主要有基因突变、染色体畸变、染色体分离异常及原发性DNA损伤。一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。选择细胞回复突变试验、微核试验、细菌DNA修复试验和SCE等四种致突变试验，即可满足要求。所以，选择的遗传毒性试验应包括5种类型的遗传学终点。 ②通常的实验材料有病毒、细菌、真茵、培养的哨乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。一般认为配套实验应包括多种进化程度不同的物种，如原核细胞、低等和高等真核细胞，这样观察化学毒物在不同系统发育的多种生物体的致突变性，更具说服力。 ③体内试验与体外试验配合。体内试验接近实际情况，但由于毒性动力学或其他原因，有时会漏检致突变物。且在时间、经费、人力及物力均比体外试验花费大。而体外试验简使易行．通常检出率大大优于体内试验。它的明显不足在于生物转化及解毒等方面与体内不同。 故在配套试验中，依据试验目的，选择体内和体外试验，取长补短，综合考虑。 目前．已确认的哺乳动物生殖细胞致突变物都在体细胞致突变试验中得到阳性结果。一般认为，当体内体细胞致突变试验得到阳性结果，并有生殖细胞接触证据时，再进行哺乳动物生殖细胞致突变试验。 通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，必要时再选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。 二、常用的致突变试验（熟悉） 1．细菌回复突变试验（Ames试验）细菌回复突变试验是利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，判断其致突变性。常用的菌株有鼠伤寒沙门氏茵（Salmonella typhimurium）和大肠杆菌（E.Coli）。 鼠伤寒沙门菌突变试验是应用最广泛的检测基因突变的方法。它是由Ames BN于1979年建立，常称Ames试验。 原理：是人工诱变的突变株在组氨酸操纵子中有一个突变，突变的菌株必需依赖外源性组氨酸才能生长，而在无组氨酸的选择性培养基上不能存活，致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸的培养基上也能生长。 正向突变指野生型基因失活的突变。 2．微核试验微核（Micronucleus） 与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核试验（Micronucleus test，MNT）是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。 3．染色体畸变分析 4．姐妹染色单体交换试验（sister-chromatid，SCE） 5．果蝇伴性隐性致死试验（Sex-linked recessive lethal test，SLRL） 6．显性致死试验 7．程序外DNA合成试验 8．单细胞凝胶电泳（3CGE）试验又称彗星试验（comet assay） 三、致突变试验中的一些问题 1．阴性、阳性对照的设立 （1）阴性对照（negative control）： （2）阳性对照（positive control）： 2．体外试验的活化系统 （1）哺乳动物细胞介导 （2）S9：S9 （3）纯化酶和基因工程 3．致突变试验与致癌试验的关系 4．试验结果在毒理学安全性评价中的作用 目前，致突变试验的质量控制通过以下来实现： ①设立阴性对照和阳性对照，其意义前已述及。 ②盲法观察，指观察人员不了解观察标本的染毒剂量或组别，以免除观察人员对实验数据产生主观影响。 ③资料的统计学分析，它是检验各处理组与对照组之间的差异，研究剂量—反应关系和定量强度。 ④试验结果的重现性，即重复试验所得到的相同结果。重复试验指在不同时间完成的试验，而并非试验中的平行样本。 阴性结果判定条件： ①最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大，毒性低的化学物，在细茵试验中可以5000μg/皿作为最高剂量。 ②各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。 阳性结果应具有剂量反应关系，即随剂量增加致突变作用增加；在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA修复的实际后果尚不明确。