草莓活性物质的提取及抗氧化性研究

草莓活性物质的提取及抗氧化性研究 草莓中总酚的提取及抗氧化性研究 一 背景介绍 草毒属于蔷薇科(Rosaceae)草毒属(Fragaria) 多年生草本植物，在园艺学上属于浆果类果树。我国从南到北蕴藏着种类和数量丰富的野生草毒。我国对草毒的分类研究较晚。《中国果树分类学》记载草葛属植物约有50种，我国产约7种，《中国植物志》认为草幕属约20余种，我国产8种。 草莓果实鲜嫩多汁、郁香酸甜、风味独特，含糖5-12%，含酸0.6-1.6%，含蛋白质0.4-0.6%，还含有维生素B、C和铁、钙、磷等多种营养成分，是老幼皆宜的上乘水果。草莓不但鲜食可口，也可以加工成多种食品，是人们生活中日益青睐的保健、营养、适口佳品。草莓在药理上性味平、酸、甘，功效清肺化痰、补虚补血、健胃降脂、润肠通便。食用草莓能促进人体细胞的形成，维持牙齿、骨、血管、肌肉的正常功能和促进伤口愈合，能促使抗体的形成，增强人体抵抗力，并且还有解毒作用。草莓中含有抗癌的异蛋白物质，能阻止致癌物质亚硝胺的合成。草莓含有多种有机酸、果酸和果胶类物质，能分解食物中的脂肪，促进食欲，帮助消化，促进消化液分泌和胃肠蠕动，排除多余的胆固醇和有害重金属。食用草莓对冠心病、高血压、高血脂、动脉硬化、便泌、贫血、肺结核、气虚、消化不良、暑热烦渴、糖尿病、小便频数、遗精遗尿等多种病症有治疗作用。草莓及其制品更是孕妇和老年人不可多得的保健食品。 草莓的食法比较多，常见的是将草莓冲洗干净，直接食用，或将洗净的草莓拌以白糖或甜牛奶食用，风味独特，别具一格。随着食品工业的发展，草莓已制成各种果酱、果冻、果脯、糖水罐头、果汁等，市场前景十分可观。 草莓的营养成分容易被人体消化、吸收，多吃也不会受凉或上火，是老少皆宜的健康食品。草莓中所含的胡萝卜素是合成维生素A的重要物质，具有明日养肝作用。它还含有果胶和丰富的膳食纤维，可以帮助消化、通畅大便。草莓对胃肠道和贫血均有一定的滋补调理作用。草莓除可以预防坏血病外，对防治动脉硬化、冠心病也有较好的功效。草莓是鞣酸含量丰富的植物，在体内可吸附和阻止致癌化学物质的吸收，具有防癌作用。美国把草莓列入十大美容食品。女性常吃草莓，对皮肤、头发均有保健作用。草莓在德国被誉为“神奇之果”。草莓还可以减肥，因为它含有一种叫天冬氨酸的物质，可以自然而平缓地除去体内的“矿渣”。中医学认为，草莓性味甘酸、凉。能润肺生津、健脾和胃、补血益气、凉血解毒，对动脉硬化、高血压、冠心病、坏血病、结肠癌等疾病有辅助疗效。 草莓的吃法多样化，直接吃，或淋上奶油、果糖皆宜，配合雪糕、芝士(乳酪)也是不错的选择。中国台湾、香港等地区大多将草莓称为士多啤梨(英文名Stawberry的音译)。进口草莓比国产草莓口味优胜，大小也较均匀。 草莓含有丰富的维生素和矿物质，每百克含维生素C高达80毫克，远远高于苹果和梨;还含有葡萄糖、果糖、柠檬酸、苹果酸、胡萝卜素、核黄素等。这些营养素对儿童的生长发育有很好的促进作用，对老年人的健康亦很有益。尤其丰富的维生素C可以防治牙龈出血，促进伤口愈合，并会使皮肤细腻而有弹性。祖国医学认为，草莓味甘、性凉，有润肺生津、健脾和胃等功效，饭后食几颗草莓，有助于消化开胃，健脾生津。近来医学家发现，经常食用草莓对防治动脉硬化和冠心病也有益处。据国外医学家研究，草莓中含有抗癌成分，可抑制肿瘤细胞的生长。在欧洲，草莓早就享有“水果皇后”的美称，并被作为儿童和老年人的保健食品。 吃草莓要注意两点:首先不买畸形草莓。正常生长的草莓外观呈心形，但有些草莓色鲜个大，颗粒上有畸形凸起，咬开后中间有空心。这种畸形莓往往是在种植过程中滥用激素造成的，长期大量食用这样的果实，有可能损害人体健康。特别是孕妇和儿童，不能食用畸形莓。另外，由于草莓是低矮的草茎植物，虽然是在地膜中培育生长，在生长过程中还是容易受到泥土和细菌的污染，所以草莓入口前一定要把好“清洗关”。 草莓植株矮小，呈平卧丛状生长，高度一般在30厘米左右。在世界小浆果生产中，草莓的产量及栽培面积一直居领先地位。目前世界上大多数国家都有草莓栽培。 二 中国草莓育种的回顾与展望 目前，世界草莓主要产于温带大多致国家和地区 美国是草莓生产最多的国家， 栽培总面积2(3万公顷， 年产草莓56(7万吨， 约占世界总产的28%其中， 加利福尼亚州的草莓栽培面积和产量分别约占全国的25, 。由于该州栽培草莓面积大、产量高， 加上从这里培育出的许多草莓优良品种已成为世界上大多数国家和地区的主要品种， 因此， 加利福尼亚在当今国际革莓业中占据着主导性地位。日本是世界草莓的第二太出产国。栽培总面积约1(1万公顷， 每年总产可达21(8万吨， 占世界产量的11%。欧洲也是世界草莓的主要产地， 年产量约占世界总产的50%， 以波兰、意大利、法国、西班牙、荷兰、苏联、南斯拉夫、比利蹦、罗马尼亚积英国栽培面积较大， 产量较高。近年来，由于受病毒病的影响，意大利和波兰的草莓生产正在下降， 其余国家则基本维持稳定。 主栽品种 根据应用方向可分为食用草莓、观赏草莓和野生草莓资源，其中食实色泽艳丽，大开硬度较软，耐贮运性差，甜度大，糖酸比高，口味香甜，最适亚洲人鲜食和老少皆宜。草莓生产史上人工育成的草莓栽培品种很多，目前世界草莓主栽品种2000多个，并且新优品种不断育成闻世，我国引进和自育也有几百个，这里主要介绍近几年中国草莓育种的回顾和展望. 1 我国草莓种质资源 1(1 草莓属植物种类 的草莓属约11个种(表1)。我国野生草莓种质资源丰富，主要分布在东北、分布在我国 西北和西南地区，天山山脉、长自山山脉、大兴安岭、小兴安岭、秦岭山脉、青藏高原、云贵高原是天然的野生草莓基因库，蕴藏着资源丰富的野生草莓，存在较多的种、变种和类型，其中许多为珍贵、珍稀的种质资源。1979年由中国农业科学院主持的西藏资源考察队在西藏考察发现，西藏的野生草莓资源极为丰富，经初步鉴定大约有7个种。林凤起对长白山区草莓资源进行考察，发现在海拔500,1800m处的林下、林缘、路旁和山坡等地，分布着抗寒性极强的东北草莓。晁无疾等 对秦巴山区野生草莓进行调查，发现在甘肃的文县和陕西的宁强野生资源分布最多，主要有五叶草莓、黄毛草莓、纤细草莓和伞房草莓。雷家军等对长白山区的野生草莓资源进行考察，共收集野生资源18份，经过植物分类学性状观察和RAPD技术鉴定证明，它们分属于二倍体种东北草莓(F(mandschurica Staudt)、四倍体种东方草莓(F(orientalis Lozinsk()和自然五倍体野生草莓。 1(2 种质圃的建立 从1981年开始，我国建立国家果树草莓种质资源圃，分别设在北京(北京市农林科学院林业果树研究所院内)和江苏南京(江苏农科院园艺研究所院内)，标志着我国草莓的引种、资源保存等方面步入了一个新阶段。同时，一些省级科研单位和大专院校也建立了草莓资源圃。如河北省农科院石家庄果树研究所保存200余份，上海市农业科学院林木果树研究所保存种质163份。我国一些地方研究所或私人单位也保存了一些草莓种质资源，如辽宁省东港市草莓研究所、河北省保定市草莓研究所、吉林省蛟河市草莓研究所都保存了100份以上的草莓资源。目前全国共收集保存野生草莓、地方品种、引进品种、国内各研究所新育成的品种(系)等种质资源1000余份。 2 我国草莓品种选育成就 2(1 引种 我国是野生草莓的起源地之一，但大果型栽培草莓品种全部从国外引进。20世纪50年代中后期，沈阳农学院、中国科学院植物研究所、中国农科院品资所等单位先后从苏联、东欧等引入一批草莓品种。迄今为止从国外引进草莓品种300余个。80年代初期，引进美国品种波卡洪塔斯(Pocahontas)和米德威(Midway)、荷兰品种戈雷拉(Gorella)、英国品种红岗特利德(Red gauntled);80年代中后期引进春香(Harunoka)、宝交早生(Hokowase)、因都卡(Induka)、早光(Earliglow)等，成为当时的主栽品种。90年代之后，随着设施草莓产业的 逐步发展，从日本弓I进的丰香(Toyonoka)和明宝(Meiho)在我国南方地区得到大面积发展，从美国引进的草莓品种全明星(Allstar)成为满城地区设施栽培的主栽品种，而从西班牙引进的弗吉尼亚(Virginia)、吐德拉(Tudla)等在丹东地区也得到大面积发展。近几年，从美国和日本引进大果型的草莓品种卡姆罗莎(Camarosa)、甜查理(Sweet Charlie)、枥乙女(T0一chiotome)、章姬(Akihiime)、红颜(Benihoppe)等在北京地区得到大面积发展，成为北京地区观光采摘农业设施栽培的主栽品种。 2(2 实生选种 我国草莓新品种选育起步较晚，是从国外引进品种的实生种子的选育工作开始。1948年中央农业实验所在国内最早开展了草莓实生选种工作，1953年选出紫晶、金红玛、五月香3个品种;沈阳农学院从1957年开始开展草莓实生选种工作，先后选出绿色种子、大四季、沈农102、明晶、明磊等品种 2(3 杂交育种 草莓新品种的选育主要采用常规杂交育种方法，1958年沈阳农学院在国内最早开始草莓品种间的杂交育种。20世纪70年代后尤其是进入80年代，我国草莓育种工作进入一个新的发展时期。国内许多单位先后开展了以早熟、大果、优质、抗旱(抗寒)为育种目标的杂交育种工作，先后育成了20余个草莓品种。 2(4 诱变育种 辐射诱变是创造新的种质资源的有效手段之一。辐射可以诱发基因突变，打破基因连锁促进基因重组，克服远缘杂交的不亲和性，实现基因的转移。邓永平等 利用茎尖组织培养60和Co-γ 射线相结合的方法进行草莓抗病性和浆果品质诱变研究，其中8KR和12KR照射量处理的草莓组培植株当代及其后代对皱缩病、叶斑病的抗性显著增强，浆果可溶性糖与维生素 60含量优变频率明显提高。石磊等利用Co-γ射线对四季草莓哈师85—1花药离体培养和茎尖 60组培植株进行辐射研究，研究表明低剂量(1000,1500R)的Co-γ射线处理能够增加草莓花药愈伤组织诱导率。组织培养与辐射诱变技术相结合，对于加快育种进程，提高选择机率有一定的实际应用价值，继代培养可以促进突变嵌合体的尽快分离。组织培养与化学诱变剂秋水仙素处理相结合为草莓多倍体育种提供了一条有效途径。雷家军等利用低倍性野生草莓资源、种间杂种的种子和茎尖进行染色体加倍处理，建立了利用秋水仙素进行草莓种子及茎尖染色体加倍的方法体系，在提高我国野生草莓的倍性、克服种问杂种不育性及种质创新等方面取得很大进展。 2(5 遗传规律研究 李英慧等 对9个草莓杂交组合的糖酸含量进行分析，发现含酸量由主效基因和微效多基因共同控制，含糖量由微效多基因控制，含糖量的遗传存在明显的正向非加性效应。石磊等以丰香(Toyonoka)、春香(Harunoka)、丽红(Reiko)、宝交早生(Hokowase)、女峰(Nyoho)为父本，赛奎亚(Sequoia)、全明星(A||star)、提奥加(Tioga)、盛岗-16(Morioka No(16)、因都卡(Induka)为母本，采用不完全双列杂交形成25个杂交组合，对果实硬度遗传规律进行研究，结果表明在遗传上，F 果实硬度的变异既受加性效应影响，也受显性效应影响，全1 明星(Allstar)、丰香(Toyonoka)、女峰(Nyoho)在果实硬度性状育种中是非常好的杂交亲本。祝朋芳等以国内一部分栽培品种的10个组合F杂种为试材，研究草莓果实最大果重、果实硬1 度遗传特性，发现最大果重遗传存在着负向非加性效应，杂交后代最大果重呈退化趋势，果实硬度遗传普遍存在着正向非加性效应，杂交后代中易选出硬度大的株系。 2(6 生物技术研究 草莓花药培养获得的单倍体植株是育种和遗传规律研究的极好材料。薛光荣等? 通过东方草莓的花药培养，首次获得了单倍体植株。侯喜林从草莓品种女峰(Nyoho)、宝交早生(Hokowase)的花药培养中获得多元单倍体植株。细胞悬浮培养可用于进行突变体筛选、原生 质体培养、细胞融合、基因转化等方面的研究。周春江利用草莓悬浮细胞分离出原生质体后进行较低密度液体浅层培养，获得了愈伤组织，为原生质体培养、分离筛选突变体奠定了基础。张洁等对草莓悬浮细胞系进行了愈伤组织的诱导，并成功获得细胞悬浮系再生植株。 从80年代末开始，国外一些实验室开展了草莓的转基因研究，我国在草莓遗传转化方面的研究起步较晚。但是近几年关于此方面研究进展较快n 。张志宏等以草莓品种吐德拉(Tudla)试管苗叶片为试材，建立起农杆菌介导的遗传转化体系，获得了转基因植株。金万梅等以草莓栽培品种哈尼(Ho(neoye)为试验材料，利用遗传转化技术，将CBFI基因导人草莓中，提高了草莓对低温胁迫的抵抗力。 3 问题与展望 近年来，我国在草莓育种方面取得了一些进展，育成了一些早熟、极早熟的草莓品种并在设施栽培中大面积推广。抗寒、耐贮运的草莓品种在我国北部寒冷地区有一定栽培面积，抗热、耐贮运的草莓品种在长江流域也有大面积栽培。然而我国有目的、有步骤的草莓新品种选育起步较晚，与发达国家如日本、美国等相比有很大的差距。随着我国加入WTO，果品市场与国际接轨，竞争将更加剧烈，因此我国草莓育种工作和种质资源评价工作还需进一步加强。 3(1 加强草莓种质资源深层鉴定 对种质资源进行收集、保存、鉴定和评价是进行草莓育种工作的基础。我国目前已保存各种草莓品种(系)1000余份，北京市农林科学院林业果树研究所和江苏农科院园艺研究所已对200余份草莓资源的植物学特征、生物学特性、果实经济性状、抗性等方面进行了较为系统的评价，筛选出许多优异的种质，已在生产和育种工作中发挥了重大的作用。然而我们对草莓资源的评价力度还远远不够，还需进一步加大对现有资源的鉴定评价，尤其是从分子方面对草莓品种的起源、品种的亲缘关系以及演化过程进行深入研究，为草莓品种的选育提供理论依据。 3(2 进一步开展早熟、极早熟草莓品种的选育 我国草莓栽培面积10余万hm ，年产草莓150余万t，栽培面积和产量均居世界第1位。其中85,为设施栽培，主栽品种以欧美和日本的早熟品种为主，欧美品种如卡姆罗莎(Camarosa)、甜查理(Sweet Charlie)，果个大、丰产、耐贮运、抗病性较强;日本品种丰香(Toyonoka)、枥乙女(To(chiotome)、章姬(Akihiime)、红颜(Benihoppe)，品质较好，是都市观光采摘的优选品种。我国草莓育种工作者虽已筛选出适合不同气候条件的草莓品种 ，然而这些品种在早熟性、丰产性等方面还存在不足，草莓遗传基础相对狭窄制约着草莓常规育种的进程。在今后的草莓育种中，要充分利用我国丰富的草莓资源，利用我国草莓地理分布的差异及草莓不同种间的适应特性，以优质、早熟、丰产、大果、抗病等为育种目标，继续开展适合设施栽培的草莓品种的选育工作。 3(3 加快开展加工型草莓品种的选育 入世以来，中国的草莓种植业在加工出口的带动下，有了突飞猛进的发展，对外出口草莓成倍增长，2006年出口草莓总量7万t，创汇达6O4O万美元，成为世界草莓加工出口大国。我国目前加工型草莓品种为哈尼(Honeoye)、森加?森加拉(Senga Sengana)、宝交早生(Hokowase)、卡姆罗莎(Camarosa)等，均主要为国外引进品种。我国农业部已于2005年把草莓列入第六批植物新品种保护名录。没有自主知识产权的加工型草莓品种，必将制约着我国对外出口产业的发展，所以加快加工型草莓品种的选育势在必行。 3(4 进一步开展四季草莓品种的选育 在四季草莓新品种选育方面，我国虽然选育出一些品种，但由于受区域性影响，未能大面积推广，品质差、匍匐茎繁殖能力差和高温天气下花芽分化困难是限制四季草莓新品种选育及其大面积推广的主 要因素。分子技术的发展可以对控制匍匐茎抽生及花芽分化的基因进行深入的研究，组织培养技术可以加快草莓苗木的快繁。现代分子技术和组织培养技术相结合为四季草莓育种提供了一条新的途径。 3(5 加快草莓育种进程 栽培草莓遗传背景复杂(八倍体)，常规育种费时费力、周期长、见效慢，远不能满足草莓发展的需要。随着生物技术的飞速发展，草莓育种工作者逐渐意识到应用转基因技术加速草莓品种改良的重要性，并已获得突破性进展。要加强草莓种质的深入鉴定，利用丰富的野生资源，开展草莓种间杂交，创造新的遗传材料;另一方面要加强草莓常规杂交育种技术与现代生物技术辅助育种有机结合，开展以 拓宽遗传基础为主要目的的种质创新，丰富草莓遗传多样性，加快我国草莓育种进程。 三 日本草莓种植生产现状及发展趋势 日本是草莓生产和消费大国, 近30 年来其年产量一直位居世界前2~ 3 位。在日本市场各类鲜果销售中, 草莓人均消费额仅次于柑橘和苹果, 居第3 位。无论是早熟品种的选育、促成栽培技术手段还是栽培作型、成花、休眠理论的研究都处于世界一流水平, 生产普及程度高, 鲜食消费量大 。草莓是一种经济价值较高的园艺作物, 介于水果与蔬菜之间, 所以又称为水果蔬菜。自20 世纪80 年代从日本引进优良品种和先进实用的栽培技术以来, 我国的草莓生产飞速发展, 草莓的品种选育及栽培技术等方面的研究工作也受到重视。日本作为我国的近邻, 农作物生产气候条件十分相似, 消费习惯接近。因此, 研究日本草莓生产的现状及发展趋向, 对进一步促进我国草莓产业的科研和生产具有十分重要的意义。 (一) 存在的问题 1. 2. 1生产者的老龄化和新增农业就业者不足 草莓促成栽培中的育苗、管理、收获、分级包装等全年劳动作业时间为2 万h/hm2 以上; 劳动密集型的草莓生产, 面临着生产者的老龄化和新增农业就业者不足的问题 。这些都将使草莓生产易产生波动和种植面积萎缩。 1. 2. 2 高架设施栽培系统成本高、效果不理想 各种高架设施栽培系统的开发和引进, 改善了作业方式, 达到了减轻劳动强度、节省劳动力的目的。但是产量没有得到增加, 初期搭建费用高达2 000~ 6 000 万日元/hm2 , 还不能作为经营上解决的手段 , 投入产出比偏低。 1. 2. 3 草莓品种大多不抗病虫害 主要推广的草莓品种, 大多不抗炭疽病、白粉病、黄萎病、红蜘蛛、蓟马等病虫害。生产上病虫害的防治仍是重点工作之一, 实际田间病虫害防治技术还不完善, 病虫害的频繁发生仍是草莓生产中存在的主要问题。 1. 2. 4 稳产性不够 为了确保年前高价格时的产量, 必须进行短日夜冷处理, 促进花芽分化的促成早熟栽培, 由于秋季的气温还比较高, 往往会造成顶果房和一级腋果房收获间隔期拉长, 未必能收到稳定的产量 。 1. 2. 5夏秋季栽培产量、品质有待进一步提高 由于夏秋季高温、强日照, 往往造成草莓连续开花的能力降低、果实集中成熟性差, 着色不良或着色过浓, 多形成畸形果、软果等, 致使果实小, 产量低, 产量不到20 t/hm2 , 减产10~ 20 t/hm2 。 (二)发展的趋势 2. 1 品种开发 2. 1. 1 特早熟品种 已经选育出早熟性、连续出蕾性、稳产性、口感、贮藏性均优秀的品种, 如章姬、佐贺清香等。要求采用普通营养钵育苗, 10 月份开始能收获的优良口味品种, 5 年后达到10 月下旬开始收获, 10 年后达到10 月中旬开始收获。 2. 1. 2 抗病性品种 已育成了对重要病害炭疽病、白粉病、黄萎病、疫病具有抗性的品种,计划5年后培育出炭疽病、白粉病复合抵抗性的品种; 10 年后培育出炭疽病、白粉病、黄萎 病复合抵抗性品种; 以耐病性为目标, 药剂喷洒次数削减到现在用药的1/2。 2. 1. 3 种子繁殖型品种 作为DNA 标记育种的准备, 强调植株外观形态及果实品质、色泽及抗病性强( 白粉病) 的纯系的选育。要求5 年后育成产量性状、果实经济性状均优良的品种; 10 年后育成早熟性、产量性、果实经济性状优良, 且具有抗病性的品种。 2. 1. 4 四季栽培性品种 无论是一季种植型品种还是四季栽培型品种, 利用自交培育出纯系亲本, 强调果形大、耐贮性好、食味优的品种的选育。5 年后, 选育出实用品种; 10 年后, 选育出炭疽病、白粉病综合抗性品种。 2. 1. 5 少量基质栽培适应型品种 少量基质适应性品种, 要求适合单株基质用量在1. 5 L 左右, 早熟性、口感均佳的品种。5 年后利用建立的少量基质适应性评价办法对优良体系进行选择, 10 年后选育出实用品种。 2. 1. 6低温生长型、果实整齐度高品种 要求培育出在无加温设施条件下栽培也能生长的低温适应的优良品种,10 年后选育出实用品种。对于适应省力化栽培的果实整齐度高的草莓果房形态进行详细的分析研究, 并育成实用性品种。 2. 2 育苗技术开发 2. 2. 1高产大苗培育 正在研究盆钵成型苗的长期大量生产技术、匍匐茎冷藏技术; 正在开展空中采苗以及母株利用、小型钵育苗等省力化技术、冷藏苗利用等技术的研发。5 年后开发出通过花芽分化的高产性良好的种苗周年供应技术。 2. 2. 2 高效育苗 正在开展利用腋芽扦插、砻糠基质育苗等种苗繁殖法以及子苗利用等研究, 要求开发高效率的育苗技术。5 年内, 主要开展新的育苗技术及其所育成的子苗的利用技术的研究, 并在生产上得到应用。 2. 2. 3 中继苗利用 开展高海拔寒冷地育苗中转到温暖地区利用技术的开发应用研究, 5 年后建立暖地、高海拔寒冷地间的中继苗生产技术体系。 2. 3 超高产栽培 2. 3. 1 少量基质栽培 每株草莓基质用量减少50%, 达到1. 5 L 左右并且使草莓生产稳定的基质材料的选择、开发以及养分、水分管理等少量基质栽培技术, 育苗时间和种苗费均减少50%的育苗技术。在少量基质适应性评价法的基础上, 5 年后开发出最适合的栽培槽、基质组成比例和养分、水分管理技术。 2. 3. 2 局部环境控制 为了促进花芽分化, 正在研究开发精确控制根茎部温度的装置, 使草莓根茎部在高温期能降温, 低温期能升温来提高草莓连续出蕾性; 正在开展代替短日夜冷处理和低温暗黑处理的省力化、低成本育苗技术及纸钵育苗技术的开发工作; 进行未花芽分化苗的定植技术开发。5 年后明确根茎部局部环境控制技术、果实成熟控制技术、低温期果实成熟调节技术; 10 年后利用果实成熟控制技术, 做到周年收获均衡上市。 2. 3. 3 立体栽培 为最大限度的利用设施内空间, 进行立体栽培装置的开发, 使定植密度是现在的4 倍左右。从栽培槽(座子、袋子、成型栽培槽) 、基质( 土壤、蛭石、有机质基质) 、基质用量( 每株在1. 0~ 11. 3 L、大多在2~ 5 L) 、基质加温方式( 暖风、热水、电热线) , 环境控制装置[ 二氧化碳气补给、根据日照长短自动调整的给液装置、综合环境控制装置( 换气扇、二氧化碳、电照、营养液等综合控制) ] 等方面着手, 进行各种高架 栽培技术体系开发。第5 年, 研制出半移动式栽培装置; 第10年,研制出移动式栽培装置。 2. 3. 4 病虫害管理 正在开展采用避雨栽培以及渗灌、滴灌等农业措施防治炭疽病的技术开发工作; 明确了利用天敌防治红蜘蛛技术; 正在开展利用天敌防治蓟马的技术开发及利用生物材料进行病虫害防治技术的开发工作。5 年后,全面研究开发出红蜘蛛类、蓟马类周年防治技术。 2. 3. 5 收获、分级包装、销售和流通 进行机器人收获、包装技术的开发。利用成像解析技术, 推进自动选果技术的开发。5年后实现机器人选果及自动搬运; 10年后收获、选果机 器人得到应用。利用对气体有选择透性的包装材料和环境温度控制技术, 使草莓贮藏期能够达到1 个月。5年后,开发应用激冷贮藏、MA 包装技术、无选择收获以及集装箱运输销售技术。 四 美国草莓种植及科学应用 由于美国气候条件有利，加上草莓种植面积增长了12, ，达到3l 639hm ，2004年美国草莓产量猛增，仅加利福尼亚州(简称加州)的草莓产量预计将达86(26万t，创历史纪录。随着产量快速增长，加州草莓出口量也将增长。加州草莓主要出口加拿大、墨西哥、日本、中国和英国，其出口比例依次为75, 、10, 、5, 、4, 和3,。2004年佛罗里达州的草莓种植面积下降，仅2876 hm ，但有利的气候条件使得该州草莓产量仍然比上年同期增长5,左右。 五 草莓中的活性物质 草葛果味美，热量低，人人皆知是Vc 的主要来源。除了基本的营养成分外，草毒果还含有几种生物活性物质。本文重点综述了酚类化合物，这类物质是由许多不同类型的植物次生代谢物质组成，它们也广泛存在于水果、蔬菜、茶叶和红酒等食品和饮料中，黄酮和酚酸是存在于食物中的两大类植物性酚类化合物，存在于浆果中的类黄酮和酚酸类的主要代谢物有花青昔、儿茶酸、黄酮醇、经基肉桂酸、水杨酸以及它们的聚合物(单宁)如靴花单宁和原花青素。 几种比较常见的植物多酚类物质的组成及其理化性质 1.1茶多酚 茶多酚是茶叶中一类主要的化学成分。它含量高(占总干物质的18,,36,)，分布广(植株各器官都有，但主要集中于嫩叶和芽)，变化大(受内外因的影响最大)，对茶叶品质的影响最显著，是茶叶生物化学研究最广泛、最深入的一类物质。 茶多酚又名茶单宁、茶鞣质，是茶叶所含的一类多羟基类化合物的总称。茶多酚为淡黄色至茶褐色的粉末或晶体，易溶于温水、乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯，微溶于油脂，不溶于氯仿及苯等有机溶剂，有吸湿性，耐热性好，在160?食用油中添加茶多酚，30min后茶多酚仅降减25,，食用油的过氧化值(PV值)几乎不变，而未添加茶多酚的食用油过氧化值则增大1倍。茶多酚有较好的耐酸性，在pH值2,7范围内均十分稳定，光照或pH大于8时易氧化聚合，遇铁离子生成绿黑色化合物。 1.1.1 黄烷醇类 茶叶中的黄烷-3-醇衍生物，俗称儿茶素类，大量存在于茶树新梢中，占茶叶干重的12,,24,，约为茶叶中多酚类总量的70,,80,。它们的结构至少包括A、B、C3个环核，酯化后，还有D环，是2-苯基苯并吡喃的衍生物。 1.1.2 花色素类 花色素的基本结构花色素苷元是羟基-4-黄烷醇，也是2-苯基苯并吡喃，环上的氢可被羟基或甲氧基取代，从而形成各种不同的花青素。 1.1.3 花黄素类 黄酮、黄酮醇及其衍生物统称花黄素类，是广泛分布于植物组织细胞中的一类水溶性色素。其母核结构是2-苯基苯并吡喃酮。 1.1.4 酚酸类 茶叶中含有多种酚酸和缩酚酸类化合物，后者多为没食子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸)、咖啡酸、鸡纳酸的缩合衍生物。 1.2 葡萄多酚 葡多酚是一种植物多酚类活性物质，能溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂中。它广泛存在于葡萄籽、葡萄皮与果汁中。这类多酚由表儿茶酸等酚酸类、黄烷醇类、花色苷类、黄酮醇类和缩聚单宁等物质组成，其中以原花色苷的含量最为丰富，可以达到80,,85,， 其他成分如儿茶素和表儿茶素的含量次之，大约为5,，葡多酚中各种成分含量的差异，使得它的颜色呈深玫瑰色至浅棕红色不等。在葡萄籽与葡萄皮中，葡多酚的含量较高，有资料表明，红葡萄的果皮中，多酚含量可达25,,50,，种籽中则可达50,,70,。所以现在国内外研究使用的葡多酚一般从葡萄籽中提取。 花色苷 1.2.1 花色苷配基或花色素为苯并吡洋的衍生物，具有阳离子的性质。花色素通常不太稳定，在葡萄中主要以糖苷形式存在。葡萄酒中的花色苷类化合物主要来源于葡萄皮，随发酵时间的延长，其含量会相应的增加。 1.2.2 黄酮醇以及黄烷酮醇类 以酮形式存在的类黄酮类有黄酮、黄烷酮、黄烷酮醇等4种。葡萄或葡萄酒除含有黄酮醇类外几乎不含黄酮和黄烷酮，由于此类化合物较容易水解，于是经常以配基形式存在。在黄酮醇类中，以槲皮酮糖苷含量最多，还含有少量的莰非醇和杨梅黄酮的糖苷化合物。此外，还含有微量的黄烷酮醇类，如3位结合鼠李糖苷的二氢莰非醇和二氢槲皮苷。 1.2.3 儿茶素类 -表儿茶素。此外，还含有少量的(+)- 葡萄中的儿茶素类主要为(+)-儿茶素和(-) 表儿茶素和(-)-表没食子儿茶素。儿茶素和表儿茶素的含量一般差不多，儿茶素有一定的苦味，但没有涩味。红葡萄酒中的儿茶素含量低于100mg/L，在白葡萄酒中更低。目前还没发现儿茶素有糖苷形式存在。 1.2.4 原花色素或缩和单宁类 原花色素化合物本身无色或有点茶褐色，在酸性以及加热条件下，其c-c键结合会开裂形成诸多红色花色苷色素，特别是矢车菊素。另外，也会产生大量的表儿茶素和少量的儿茶素。原花色素类化合物是葡萄籽及果皮中的主要成分物质。 1.2.5 白藜芦醇 白藜芦醇是主要的活性物质，它有2种异构体，即顺式白藜芦醇和反式白藜芦醇，红葡萄酒中以反式白藜芦醇为主。葡萄酒中的白藜芦醇受葡萄品种、葡萄生长环境、酿酒工艺以及葡萄被微生物感染程度等因素的影响。白藜芦醇主要存在于葡萄皮中，因此葡萄皮发酵时间长短是决定白藜芦醇含量的主要因素。 1.3 苹果多酚 苹果多酚为棕红色粉末，其20,的水溶液呈红褐色;液状及粉状苹果多酚产品均略带苹果的风味，稍带苦味，易溶于水和乙醇。苹果多酚中，以绿原酸为主的酚羧酸类约占25,，儿茶素、表儿茶素、没食子酸等单体约占15,，根皮苷、根皮素、对香豆酸、二氢查耳酮、槲皮苷等约占10,，原花色素类约占50,。 2 生物学活性及作用机理 2.1 茶多酚的生物学活性 2.1.1 抗氧化 茶多酚的抗氧化作用主要表现在:直接清除活性氧自由基，抑制脂质过氧化反应，整合金属离子，激活细胞内抗氧化防御系统。 2.1.2 抗肿瘤 据国内外文献报道，茶多酚在活体外表现为抗突变作用，能抑制啮齿类动物由致癌物引发的皮肤、肺、前胃、食道、十二指肠、结肠和直肠肿瘤等。茶多酚抑制肿瘤的机理主要有:抗氧化，清除自由基;阻断致癌物的形成和抑制机体内的代谢转化;抑制具有促癌作用的酶的活性;提高机体的免疫力;抑制肿瘤细胞DNA的生物合成。 2.1.3 抗菌 茶多酚作为一种广谱、强效、低毒的抗菌药物已被世界许多国家学者所公认。在众多的抗菌试验中，人们发现茶多酚对普通变形杆菌、金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等许多致病菌，尤其是对肠道致病菌具有不同程度的抑制和杀伤作用。茶多酚的抗菌机制，主要有以下3种方式:?破坏细菌细胞膜的脂质层，使细菌发生形态学改变;?抑制有害细菌分泌毒素的活性;?抑制有害细菌的侵染。茶多酚一方面对肠道内细菌有十分强大的杀伤和抑制作用，另一方面对肠道内有益菌却起着保护作用，如能促进肠道内双歧杆菌的生长和繁殖，改善机体肠道内微生物结构，提高肠道免疫功能，对增进健康有积极作用。 2.1.4 抗病毒 茶多酚不仅是一种较广谱的抗菌药物，同时对病毒也具有较强的对抗作用。日本岛村忠藤发现，绿茶和红茶的提取物具有抑制甲、乙型流感病毒的作用。瑞士也有研究表明儿茶素对人体呼吸系统合孢体病毒(RSV)有抑制作用。茶多酚对于胃肠炎病毒、A型肝炎病毒、植物病毒也有较强的对抗抑制作用。 2.2 葡萄多酚的生物学活性 2.2.1 抗氧化剂 具有较强的抗氧化性，能通过抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化而有助于防止冠心病、动脉粥样硬化的发生。由于多不饱和脂肪酸的氧化而导致LDL性质的改变是促进动脉粥样硬化的重要因素。氧化作用影响到LDL的载脂蛋白，改变了LDL的生理化学和生物活性性质，因此，被氧化的LDL失去了被特定的受纳体识别的性质，不能进行正常的分解代谢。葡萄酒中的多酚类物质，能够保护LDL颗粒不发生形态的改变，从而保证了LDL正常的代谢。更进一步的研究表明，这些物质能保护LDL上与细胞膜结合的特定位点上的氨基酸残基。因此，葡萄酒中的多酚类物质能够抑制LDL的氧化，从而防止动脉粥样硬化等疾病的发生。 2.2.2 抗癌 大量的流行病学研究与动物试验表明，多酚类物质能阻止和抑制癌症的发生。作为一种抗氧化剂和抗诱变因素，多酚类物质能使致癌物毒性降低或消失，它还能通过诱导细胞分化抑制癌症的发展，对癌症发展的3个阶段具有抑制作用。 2.2.3 抗发炎 炎症反应时，致炎物或炎症介质可诱导或增加局部NO的合成与释放，大量的NO会促进炎症反应。肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种重要的炎性细胞因子，参与炎症反应，当患有感染、创伤及免疫性疾病时，TNF-α有不同程度的升高。在巨噬细胞中，由脂多糖诱导的TNF-α和NO的过量合成可以被槲皮酮抑制。诱生型一氧化氮合酶可以在不同的细胞中得到表达，在巨噬细胞中，它可以被细菌内毒素脂多糖(LPS)等发炎因子诱导。前列腺素(PGs)作为调节剂在发炎过程中也起着重要的作用。环加氧酶(COX)能将花生四烯酸转变成PGs。在发炎和免疫应答中，COX和iNOS的异构体负责生产出大量的PGs和NO，细胞内过多的NO，会导致细胞毒性和组织的破坏。白藜芦醇能够抑制iNOS的活性，降低一氧化氮合酶的基因表达和酶活性，这种作用与白藜芦醇抗肿瘤和发炎的性质有关。 2.2.4 抗血小板凝聚 血小板的凝聚与花生四烯酸的代谢产物血栓素(T×A2)和前列腺环素(PGI2)密切相关。T×A2是目前发现的最强的收缩血管物质和最强的血小板聚集剂之一。PGI2则是最强的血小板聚集抑制剂之一。 2.3 苹果多酚的生物学活性 2.3.1 抗氧化 苹果多酚作为一类氧化还原电位很低的还原剂，具有很强的供氢能力，H+与羟基自由基(?OH)结合，能使之还原为惰性化合物或较稳定的自由基，从而清除体内过多的有害自由基。 2.3.2 抑菌 苹果提取物中的酚类物质主要为原花青素，此外，还含有酚酸、茶素、表儿茶素、黄酮类等物质。试验证明，苹果多酚提取物对芽孢杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌均有很强的抑制作用，且对革兰氏阴性菌的抑菌效果强于革兰氏阳性菌。但对实验用酵母，霉菌无抑制作用。苹果多酚提取物对芽孢杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞茵的最低抑制浓度均为0.1%。其抑菌活性热稳定性较强，且在pH值5,6及低于0.3mol/L的无机盐环境中抑菌效果最佳。 2.3.3 抗癌 苹果果肉的抗癌细胞增殖能力已经得到验证。但是，果肉的抗痛细胞增殖能力较差，在大多数情况下，如果在果肉提取物长期作用下也能慢慢地抑制癌细胞增殖。大量研究已经表明原花青素对癌细胞增殖有抑制作用。 所有植物性酚类物质的最基本结构是苯环上有OH取代基，类黄酮的基本化学结构是由一个杂环C把两个芳香环(A和B)联结在一起，在C环上发生氧化，由羚基和甲氧基取代，生成不同的次生物质，酚酸是苯甲酸和肉桂酸经基化衍生物，在植物体内，大多数酚类化合物束缚到糖、有机酸或细胞壁成分上。植物性酚类物质由于具有抗氧化和其他生物特性，因而 通常认为酚类物质对人体有益，由于草毒消费量大，关于草毒对人体健康的作用有特别重要的意义。 在过去10年中，类黄酮、酚酸和相关的植物酚类物质，越来越引起人们的注意，因为这些成分都是抗氧化剂，具有对人体有益的生物特性，在维持人体健康，防治癌症和心血管疾病方面具有公认的作用，虽然这方面的研究资料很多，但我们对这些化合物对人体健康的作用知之甚少。由于酚类物质具有较高的化学活性，它们可能与生物分子(酶、其他蛋白质、DNA )和金属离子结合，清除自由基，因此表现了一系列显著的生物活性。关于类黄酮和其他酚类化合物对健康的作用已有大量综述，如抗氧化剂、抗突变、抗癌和抗菌特性，以及对免疫和炎症的影响。人们把骤花酸看作是一种天然的可食用的抗突变和抗癌的成分。在用化学致癌剂处理的动物上试验表明，辄花酸能减少肿瘤的数量。 本实验主要是以总酚的提取以及总酚含量的测定为主要内容。 六 营养成分分析 水分、灰分、蛋白质、粗脂肪、粗纤维及碳水化合物含量测定 水分含量测定采用105度常压干燥法 灰分含量测定法采用550度高温灼烧氧化法 蛋白质含量测定法 凯氏定氮法 粗脂肪 :索氏抽提 碳水化合物按公式(%)=100-(水分+灰分+蛋白质+脂肪)计算 矿物质元素含量测定:称取2.0000样品，加入高氯酸:硝酸=1:3的消化液10ml，电热板上硝化至溶液透明无色，再用X-7型ICP-MS等离子质谱仪(美国产)测定矿物质含量，结果以mg/kg干重表示。 七 活性物质总酚的提取 一 A 单因素实验设计: 1.1 提取剂的选择 分别用纯乙醇、甲醇、丙酮、蒸馏水各30ml 在室温条件下避光浸提30min，抽滤、定容至200ml、520nm 下测定吸光度。结果表明:总酚酸溶于水，甲醇以及乙醇中，且乙醇的提取效果明显好于丙酮，由于要获得天然总酚，甲醇有毒性，因此选取乙醇溶液为草莓总酚的提取剂。 1.2 蓝莓总酚酸吸收光谱 根据草莓的总酚吸收光谱确定最佳吸收峰 1.3 提取剂浓度对色素提取率的影响 称取草莓浆液3g，分别加入不同浓度的pH 3 的乙醇溶液30ml，水浴30?，浸提30min，抽滤，定容至200ml，测定吸光度，确定最佳乙醇浓度 1.4 时间对色素提取率的影响 称取草莓浆液3g，加入浓度为80%的pH 3 的乙醇溶液30ml，水浴30?，浸提不同时间，抽滤，定容至200ml，测定吸光度，确定最佳浸提时间 1.5 提取温度对色素提取率的影响 称取草莓浆液3g，加入浓度为80%的pH 3 的乙醇溶液30ml，不同水浴温度，浸提30min，抽滤，定容至200ml，测定吸光度，确定最佳浸提温度 1.6 提取液提取次数对提取率的影响 称取草莓浆液3g，加入浓度为80%的乙醇溶液30ml，水浴30?，浸提30min，分别提取1次、2次、3次。抽滤，定容至200ml，测定吸光度，确定最佳提取次数。 1.7 料液比对提取率的影响 称取不同质量的草莓浆液，加入pH 2 的浓度为80%的乙醇溶液30ml，水浴30?，浸提30min，抽滤，定容至200ml，测定吸光度 B 草莓总酚提取的正交实验 根据单因素实验结果，选取L9(34)正交表。由于提取浓度、料液比、提取次数、时间等因素对实验结果影响显著，故选择乙醇浓度，料液比，提取次数，提取时间来进行正交试验。从而确定最佳提取工艺。 二 结果与讨论 提取总酚的影响因素的实验中表明, 正交实验响最大, 其次是提取时间, 再次是溶剂倍数, 乙的四个因素中, 温度对草莓中的总酚提取影响醇浓度影响最小表。最大, 其次是溶剂倍数, 再次是乙醇浓度。 八 总酚含量的测定 6.1 没食子酸标准曲线的绘制: 准确称取一水合没食子酸0.110 ? 0.001g，用水完全溶解后，转移到100ml 容量瓶中定容，配制成浓度为1000mg/L 的没食子酸标准溶液;用移液管吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0ml 标准溶液到100ml 容量瓶中，定容。分别吸取上述标准溶液1.0ml，加蒸馏水5ml、FC 显色剂1ml，7.5% 碳酸钠溶液3ml，混匀，45?水浴1.5h后，在765nm 波长下测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，求回归方程。 草莓浆液中总酚含量的测定:取样品溶液1.0ml，其他步骤同标准溶液测定方法，根据标准曲线求得其浓度，并计算出总酚含量。 6.2 最大吸收波长扫描 分别在没食子酸和草莓样品中添加FC 试剂制成显色检测液，检测波长从400nm 开始到900nm 进行扫描，确定总酚最大吸收峰对应下的波长。 6.3 回收率测定 取不同总酚浓度的草莓样品，分别加入1.00mg 的没食子酸，以蒸馏水作空白，分别测定总酚含量，计算回收率。 6.4 稳定性和精密度检测 分别在没食子酸和草莓样品中添加FC 试剂后，45?水浴放置，隔10min 测其吸光度， 计算稳定性。准确称取一定量的草莓样品5 份，按上述操作，测其吸光度，得出总酚含量，计算精密度 九 总酚的提纯纯化 以有机溶剂提取的总酚总会含有较多的杂蛋白、色素、低聚糖等等杂质。根据总酚的分子大小及性质，可以采用大孔吸附树脂纯化草莓中总酚。 7.1大孔吸附树脂背景介绍 大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，是20世纪60年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。 大孔吸附树脂是近代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，70年代末开始将其应用于中草药成分的提取分离。不同结构的大孔吸附树脂对亲水性酚类衍生物的吸附作用研究表明不同类型大孔吸附树脂均能从极稀水溶液中富集微量亲水性酚类衍生物，且易洗脱，吸附作用随吸附物质的结构不同而有所不同，同类吸附物质在各种树脂上的吸附容量均与其极性水溶性有关。 大孔吸附树脂的孔径与比表面积都比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。 N KA、D2101、HPD2100、AB28 为非极性或弱极性的大孔树脂, S28、N KA 29 为极性的大孔树脂。不同极性的大孔树脂对于有效成分和有效部位的吸附能力不同, 因此进行大孔树脂型号的选择很重要, 要选择吸附能力强、解吸附效果好的树脂。 7.2 大孔吸附树脂的选择 取一定量的草莓样品,按最佳工艺提取, 醇沉后, 将其分为8 等份, 其中1 份为空白样, 另外7 份加入已处理好的各种型号的大孔吸附树脂, 室温放置, 吸附24 h, 滤过多余药液, 测定残余药液中总酚的质量浓度。以最大比吸附值[最大比吸附值= (原液中目标成分的质量- 残余药液中目标成分的质量)/树脂干质量]表示大孔吸附树脂的吸附量。以草莓中总酚为指标为指标所得吸附量的大小排序基本一致, 淘汰两个吸附量较小的树脂, 将其余5 种型号树脂做进一步的分离度考察。 解吸附的考察: 称取等量AB-8、NKA-9、HPD2600、D2101、D2201 树脂, 装柱。取5份等量的草莓样品提醇沉后的浓缩液通过大孔吸附树脂, 用水洗至流出液无A2萘酚反应后, 然 、60%、80% 乙醇洗脱, 洗脱液浓缩干燥, 测定其中草莓中总酚的质量，后分别用20%、40% 确定最适合草莓中总酚纯化的树脂型号。根据参阅文献，初步确定选用AB-8大孔树脂。 洗脱液乙醇体积分数的考察: 根据前期试验结果, 水洗总酚酸的量为整个洗脱总量的7.0% , 20%乙醇洗脱量为76.7% , 40%乙醇洗脱量为15.0% ,60% 乙醇洗脱量为0.4% , 80%乙醇洗脱量为0.9% ,结果表明20% 乙醇能将大部分总酚酸洗脱下来, 60%、80% 乙醇洗脱部分目标成分的量很少, 为将草莓总酚洗脱完全, 试验选择40% 乙醇作为洗脱剂。 通过以上实验优筛出最佳型号的大孔树脂及洗脱溶剂, 进行草莓总酚的分离纯化, 得到草莓总酚质量分数。 七 总酚的酚酸质谱分析 1.1 试剂 对羟基苯甲酸类酚酸:没食子酸(gallic acid)、原儿茶酸(protocatechuic acid)、龙胆酸(gentisic acid)、p,羟基苯甲酸(P-hydroxybenzonic acid)、香草酸(vanillicacid)、丁香酸syringic acid;对羟基肉桂酸类酚酸:绿原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)、香豆酸(Pcoumaricacid)、阿魏酸(ferulic acid)、芥子酸(sinapicacid)，这11种酚酸标样均购自Sigma公司，纯度95%以上;乙腈、甲醇为色谱纯 美国Fisher Scientic公司;其余试剂均为分析纯;实验用水为自制超纯水。 1.2 仪器 Shimadzu高效液相色谱仪:LC-6A色谱泵、SPD-6AV紫外检测器、SIL-6A自动进样器、日本 C-R6A色谱数据处理系统;UV-1601紫外分光光度计 日本Shimadzu公司; 十万分之一天平 德国Merck公司;LiChrospher100RP-18e色谱柱(250×4.0mmID，5μm)以及RP-18(10 mm×4mm)保护柱。 1.3 洗脱方法 紫外检测波长在11,15min为320nm，其余时间为280nm，柱温30?，进样量为10μl，流速为1ml/min，以峰面积外标法定量。 梯度洗脱:流动相A为:甲醇+乙酸+水(10:2:88) B为:甲醇+乙酸+水(90:2:8) ; 洗脱程序:0,25min，B为0%,15%;25,45min，B为15%,50%;45,53min，B为50%,0% 。 1.4 草莓样品的制备方法 莓烘干成粉末，制备样品 草 2 结果与分析 2.1 检测波长 11种酚酸在波长200,400nm区间的紫外吸收光谱图表明各组分在280nm以及320nm处均有较大吸收，但龙胆酸(保留时间:为13.5min)在280nm波长检测下响应值较低，而在320nm波长检测下响应值较高。因此，在11,15min选用320nm波长检测，其它选取280nm作为检测波长。 2.2 流动相的选择和保留时间的确定 流动相A:甲醇+乙酸+水(10:2:88) ; 流动相B:甲醇+乙酸+水(90:2:8)。洗脱程序:0,25min，B为0%,15%;25,45min，B为15%,50%;45,53min，B为50%,0%，流速为1ml/min。实验中11种酚酸在40min内均得到了很好的分离，此条件下标准品色谱图见图1。参考分离效果和保留时间，该条件有利于蓝莓酒中11种酚酸的精确测定。 2.3 标准工作曲线的建立 准确配制1mg/ml的11种酚酸混合标准，按照要求稀释到5,250mg/L中5个不同浓度，进样5μl，按上述确定的色谱条件测定，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到11条标准曲线，结果见表1。从表1中可知，没食子酸等11种的酚酸标准品的溶液浓度和检测响应值呈现出良好的线性关系，并且11种酚酸的最低检测限都较低，表明此方法灵敏度较高。 2.4 稳定性检验 在上述色谱条件下，分别将草莓样品连续进样5次，对其保留时间上的11种酚酸含量进行统计分析(见图)。结果表明(见表2)其保留时间相对标准偏差(RSD)都极小，在2%以内，均低于0.01‰;样品含量相对标准偏差均小于3%。这表明色谱工作稳定，重现性良好。 2.5 草莓样品的测定 根据前述的色谱条件，对草莓样品进行测定。测定结果(草莓样品检测到了没食子酸等10种酚酸。其中绿原酸的含量最高;其次为咖啡酸与芥子酸，P-羟基苯甲酸没有检出。草莓中对羟基苯甲酸类酚酸含量在总酚酸中含量较低(17.653,26.96mg/L)，对羟基肉桂酸类酚酸含量占总酚酸含量的90%以上(276.415,405.405mg/L)，酚酸总含量在303.375-423.058mg/L 之间。在草莓酿造过程中对羟基苯甲酸类酚酸含量总体呈增长趋势、对羟基肉桂酸类酚酸含量总体呈减少趋势，其中绿原酸含量最高,它含量减少对总体酚酸变化影响最大，酚酸总含量也呈减少趋势。 九 活性物质的抗氧化性研究 1采用 Schaal烘箱法研究提取物在菜籽油过氧化体系中的抗氧化性能 将草莓提取物分别取一定体积，按0(2, 、0(4, 、0(6, 、0(8, 、1(O, 的剂量(mg,g)加入盛有30 g菜籽油的100 mL烧杯中，充分搅拌使其溶解。另取菜籽油30 g放入100 mL烧杯中做空白样。将所有油样同时放入70qC?1? 电热恒温培养箱中保存;每隔1、3、5、7、9、11、13d测定过氧化值(POV)。 2 DPPH?自由基清除能力测定? 取一定浓度待测样品的甲醇溶液0(2 mL，加入1 mL浓度为25 mrJL的DPPH?甲醇溶液，立即混匀，在一定时间间隔内，以溶剂为参比，于515 nm处测定吸光度直到读数稳定，吸光度记为Al，同法取0(I mL溶剂加入4 mLDPPH?甲醇溶液混匀，测其吸光度记为A ，按照以下公式计算自由基清除率:IP=(1一A,A )×100,，每个样品测3次，取平均值。 3 羟自由基(?OH)清除能力测定 H20 和Fe 混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的?OH，能被水杨酸有效的捕捉，并生成有色物质。但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减少。10 mL的试管中依次加入6 mmol,L的FeSO 溶液2 mL，不同浓度的多酚溶液2 mL，6 mmol,L的H2O:溶液2 mL，摇匀，静置10 min，再加入6 mmol,L的水杨酸溶液2mL，摇匀， min转速离心5 rain，于510 nm处测其吸光值。清除率计算公式为:静置30min后以5000 r, 清除率=[1一(Ai—Ai),Ao]xl00,式中:A。为空白对照;Ai为多酚溶液的吸光值;A_为无水杨酸时多酚溶液的吸光值。每个样品测3次，取平均值。