基因工程课程习题

基因工程课程习题 《基因工程》课程习题 第二章习题 一、 单选题 1.在基因操作中所用的限制性核酸内切酶是指( B ) A(I类限制酶 B. II类限制酶 C. III类限制酶 D.核酸内切酶 E. RNAase 2.下列关于同裂酶的叙述错误的是( B ) A. 是从不同菌种分离到的不同的酶,也称异源同工酶。 B. 它们的识别序列完全相同。 C. 它们的切割方式可以相同，也可以不同。 D. 有些同裂酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。 E. 两种同裂酶的切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶的识别位点。 3. 多数限制酶消化DNA的最佳温度是( A ) A. 37? B.30? C.25? D.16? E.33? 4. 下列关于限制酶的叙述错误的是( B ) A. I类限制酶反应需要 Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸。 B. II类限制酶反应需要Mg2+、ATP。 C. III类限制酶反应需要Mg2+、ATP，S-腺苷蛋氨酸能促进反应，但不是绝对需要。 D. I、III类限制酶对DNA有切割和甲基化活性，II类限制酶对DNA只有切割活性 而无甲基化活性。 E. II类限制酶要求严格的识别序列和切割点，具有高度精确性。 5. 如果一个限制酶识别长度为6bp ,则其在DNA上识别6bp的切割概率为( D ) A. 1/44 B. 1/66 C. 1/64 D.1/46 E. 1/106 6. 多数II类限制酶反应最适PH是 ( C ) A. PH:2-4 B. PH:4-6 C. PH:6-8 D. PH:8-10 E. PH:4-10 7. 下列关于限制酶反应的说法错误的是 ( D ) A. 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，可能会阻碍 限制酶的酶解活性。 B. 许多限制酶对线性DNA和超螺旋DNA底物的切割活性是有明显差异的。 C. 有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率会有差异。 D. 限制酶反应缓冲系统一般不用磷酸缓冲液，是由于磷酸根会抑制限制酶反应。 E. BSA对许多限制酶的切割活性都有促进作用，所以酶切反应中常加入一定量的 BSA。 8. II类限制酶反应中必须的阳离子是( C ) A. Na + B. Ca2+ C. Mg2+ D. Zn2+ E. Mn2+ 9. RFLP形成的原因是 ( A ) A. 由于遗传变异造成同源染色体中碱基的随机变化。 B. 使用不同的限制性内切酶进行切割。 C. 杂交时使用不同的探针。 D. 每种染色体存在两条。 E. 提取不同的染色体DNA酶切。 10. 下列关于限制酶命名的示方法，正确的是( E ) A. Sau.3A I B. B.amH I C. pst I D. Ecor I E. Hind III 11. 需进行DNA部分酶切时，控制下列哪种条件最合适( D ) A. 反应时间 B. 反应体积 C. PH D. 限制酶量 E.反应温度 12. 下列酶在反应中不需要ATP的是( D ) A. E coK B. T4DNA连接酶 C. BamH I D. EcoB E. DNA pol I 13. 限制性内切酶可特异性识别 ( B ) A. 双链DNA的特定碱基对 B. 双链DNA的特定碱基序列 C. 单链RNA的特定碱基序列 D. 单链DNA的特定碱基序列 E 双链RNA的特定碱基对 14. 下列与RFLP相关的一条是( D ) A. 不同限制酶在单个染色体DNA上的限制性图谱。 B. 两种物种个体间的限制性图谱。 C. 同一个体等位基因的限制性图谱。 D. 同一物种不同个体的限制性图谱。 E. 非同源染色体用同种限制酶切形成的限制酶图谱。 15( 限制酶的星号活性是指在非正常条件下，限制酶( A ) A. 识别和切割序列发生变化。B. 切割活性大大提高。C. 识别和切割序列 与原来完全不同。D. 可以任意切割DNA。E. 只能部分切割DNA。 二、多选题 1. 下列因素中影响限制酶切割的有( A,B,C,D,E) A. EDTA浓度 B. 甘油浓度 C. DNA纯度 D. 酶的自身活性 E. 盐浓度 2. 限制酶反应中出现星活性的可能原因是(A B D E) A(酶浓度太高 B 低盐 C 盐浓度过高 D 高PH E 甘油浓度>5%(V/V) 3( 限制酶切割后的DNA电泳得到的电泳条带有些扩散，可能原因是(B，C，D，E) A(酶失活 B 有蛋白质与DNA结合 C 酶切条件不合适 D 有外切核酸酶污染 E 星号活性 4( 下列有关回文序列的描述正确的是(A，B，C) A( 是II类限制酶的识别序列 B 是某些蛋白的识别序列 C 是基因的旁侧序列 D 是高度重复序列 E 是卫星序列 5( 下列有关回文序列的一般特征正确的是(B，C，D，E) A( 可增强基因表达 B 有对称轴 C 是自我互补的序列 D( 两条链从5‘ 3‘方向的序列一致 E 是II类限制酶的识别序列 6( 关于II类限制酶说法正确的是(B，D) A( 具内切核酸酶和甲基化酶活性 B( 仅有内切核酸酶活性 C( 只识别非甲基化的DNA序列 D( II类限制酶反应条件只需要Mg2+ E( II类限制酶反应需要Mg2+,ATP 7(通过限制性片段分析，可对等位基因进行精确比较是因为(B，C) A( 限制酶只切割两个变异等位基因中的一个 B( 限制酶位点可作为遗传标记 C( 它不依赖变异的等位基因的产物的功能 D( 不同组织等位基因的核苷酸序列存在差异 E( 同一组织等位基因核苷酸序列不会完全相同 8. 下列关于II类限制酶的叙述正确的是(B，C，D，E) A( 它既有内切酶的活性，也有外切酶活性 B( 在特异位点对DNA进行切割 C( 同一限制酶切割双链DNA时产生相同的末端序列 D( 有些限制酶切割双链DNA产生粘末端 E( 有些限制酶切割双链DNA产生平末端 9( 限制酶反应结果若显示没有切割，可能原因是(A，B，C，D，E) A( 限制酶无活性 B 存在抑制剂如SDS，EDTA C DNA不纯 D( 缓冲液组成不合适 E DNA甲基化 10(下列关于限制酶的叙述正确的是(B，C，D) A( 在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他限制酶就不能切割了。 B( 限制酶在DNA中的识别/切割位点的二、三级结构影响酶切效率。 C( 如果限制酶的识别位点位于DNA分子末端，那么接近末端的程度也影响切割。 D( 已知某限制酶在一环状DNA上有3个切点，因此该酶切割这一环状DNA，可得到3个片段。 E( 能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中没有该酶识别的序列。 11(酶在储存过程中迅速失活，可能原因是(A，B，C，E) A( 储存温度不合适 B 稀释后储存 C 储存缓冲液不合适 D( 分装后储存 E 储存缓冲液中蛋白浓度低 12(限制酶切反应结果显示为部分切割，可能原因是(A，B，C，D，E) A( 限制酶失活 B 有抑制剂如SDS，EDTA等存在 C 反应条件不合适 D DNA不纯 E DNA结构(线形或超螺旋)的影响 13(如果用限制酶切割DNA后得到的片段比预期的多，可能原因是(B，C，E) A( 限制酶失活 B 限制酶的星号活性 C 有其他限制酶污染 D 有抑制剂存在 E 测试DNA中有其他DNA污染 14(限制酶切割后的产物连接反应效果差，可能原因是(A，B，C，E) A(限制酶去除不完全 B 平端连接 C 核酸外切酶污染 D(连接反应温度低于16? E(从限制酶消化中带来太高浓度的磷酸盐或其他盐类 15(下列限制酶属同裂酶的是(A，B，D，E) A(BamHI G?GATCC Sau3AI ?GATC CCTAG?G CTAG? B( Sal I G?TCGAC Xho I C?TCGAG CAGCT?G GAGCT?C C( BamH I G?GATCC EcoR I G?AATTC CCTAG?G CTTAA?G D. Hpa II G?CGC Msp I C?CGG CGC?G GGC?C E. Xba I T?CTAGA Nhe I G?CTAGC AGATC?T CGATC?G 三(填空题 1(限制酶是一类专门切割 DNA 的酶，它能特异性识别切割 双 链(单、双)DNA。 2(II型限制酶识别位点一般长度为 4~6 个核苷酸对。 3(个体之间DNA限制酶片段长度存在差异称 限制性片段长度多态性(RFLP)。 4(限制酶命名采用Smith和A thens提议的，第一个字母大写取自来源细菌的 属名 ;第二、三个字母取自来源细菌的 种名;第四个字母(如果有)取自来源菌的 株系。 5(需要部分酶切时可采取的方法有(1)减少酶的用量 (2)缩短反应时间 (3)增大反应体积。 6(限制酶识别序列为n个碱基，则其切割频率的理论值应是 4n。 7(限制性内切酶通常保存在 50% 浓度的甘油溶液中。 8(甘油浓度是导致一些酶的星活性的原因之一，在酶切时反应体系中的甘油浓度应控制在 5% 以下。 9(限制与修饰是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的 限制 和对自身DNA的 修饰 来实现的。 10(II型限制酶既具有 识别位点 的专一性，也具有 切割位点 的专一性。它作用时需要 Mg2+ 离子作辅助因子。 四(简答题 1(在酶切缓冲液中加入牛血清白蛋白(BSA)的目的与机理是什么, 答:目的是保护酶的活性;机理是通过提高反应体系中蛋白质的浓度，防止内切酶失活。 2(如果用EcoR I酶切DNA时出现星活性，试分析原因, 答:主要原因有:酶浓度太高;高PH;低盐;含Mn2+、Cu2+等非Mg2+金属离子;甘油浓度高于5%;存在某些有机溶剂。 3(下列序列中哪些可能是II类限制酶的识别序列, ATATCG CCCGGG GATATC AGCCGA GAGTC 答:CCCGGG GATATC GAGTC 4(用Klenow酶可将5‘粘末端填补成平末端，而导致某些限制位点消失，下列酶切后用klenow处理再连接不会丢失识别位点的是哪些, XmaI C?CCGGG BssH II G?CGCGC PstI CTGCA?G HhaI GCG?C HpaII G?CGC 答:BssH II, HpaII 5(当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施,为什么, 答:要避免星活性及部分酶切。(1)先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶;(2)用一种酶消化后，以酚:氯仿:异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化;(3)先低温酶，后高温酶;(4)使用通用缓冲液。 6(试计算下列三种限制酶各自在某染色体DNA序列上的切割概率 Sau3A I GATC Pst I CTGCAG Hinf I GANTC Acy I GPuCGPyC 答: 1/44;1/46;1/44;(1/44)x(1/22) 7(一长为4.2kb的DNA片段，分别用EcoRI、PstI及EcoRI+PstI消化，电泳结果如下图所示，请根据结果绘出该片段限制性图谱 0.7kb 0.7kb 0.8kb 1.5kb 1.4kb 2.0kb 2.0kb 2.8kb EcoRI Pst I EcoRI + Pst I 答: EcoRI PstI EcoRI 0.7kb 0.7kb 0.8kb 2.0kb 回收与连接 一(单选题 1(用DEAE膜片法回收电泳分离的DNA片段时，在紧靠目的DNA片段前方的凝胶切一裂缝，以插入DEAE纤维素膜，该裂缝长度与DNA条带相比应(C) A( 略短 B. 等长 C. 略长 D. A或B都可 E . A、B、C都可 2(用透析膜插片凝胶电泳法回收DNA片段时，再区带前挖一小槽，将透析膜置于槽中，这时应注意(B) A(透析膜要接触DNA区带一侧的胶缘 。 B(透析膜不能接触DNA区带一侧的胶缘 。 C(透析膜要接触DNA区带相对一侧的胶缘 。 D(透析膜不能接触DNA区带相对一侧的胶缘 。 E(随意插入槽中即可。 3(在回收DNA片段时，观察电泳结果为尽量减少对DNA的照射损伤应使用(A) A(长波长紫外 B. 短波长紫外 C . 长波长红外 D. 短波长红外 E. ABCD 都不可 4(DNA回收时，如要除去EB(溴化乙锭)可用下列那种试剂( A ) A(正丁醇 B. 苯酚 C. 氯仿 D. 异戊醇 E. 乙醇 5(在DNA分子克隆时，常用到部分填补法，填补时应注意( E ) A(控制反应温度 B. 控制酶的反应时间 C. 控制DNA聚合酶的用量 D. 控制反应PH E. 限制dNTP的种类 6(下列关于平末端连接的说法正确的是( B) A( 同等条件下连接效率高于粘末端连接的连接效率。 B( 加入凝聚剂PEG8000可促进平末端连接。 C( 平末端连接时反应温度要比粘末端连接温度高。 D( 平末端连接方法的使用仅限于酶切后产生的两个平末端之间的连接。 E( 平末端连接比粘末端连接更易产生自身环化。 7(用同一种酶切割载体和目的基因后进行连接，连接产物会含大量自身环化载体，采用下列哪种酶处理，可防止自身环化( E ) A(核酸内切酶 B. 核苷酸激酶 C. 核酸外切酶 D. 末端转移酶 E. 碱性磷酸酶 8(分子克隆中用T载体主要是与下列哪种产物连接( D ) A(单酶切产物 B. 双酶切产物 C. 同裂酶产物 D. PCR产物 E. 酶切后形成的平末端产物 9(采用BamH I单切载体和目的基因后，进行重组连接前要( D ) A( 65?处理10分钟使BamH I灭活。 B( 用碱性磷酸酶处理载体防止其自身环化。 C( 电泳检测酶切结果。 D( A、B、C都正确。 E( 只有A、C 正确。 10(粘末端连接的优点是操作简便且( C ) A(可产生新的酶切位点 B. 载体易自身环化 C. 易于回收片段 D(具有方向性 E. 选时更简便 二(多选题 1(重组连接时，反应体系必须的组分有( A、C) A(Mg2+ B. BSA C. ATP D. PO43- E . EDTA 2(DNA片段重组连接可用下列哪些方法(A、B、C、D、E) A(平末端连接 B. 粘末端连接 C. 加接头连接 D. 同聚尾连接 E . T载体连接 3(酚抽提法回收DNA片段后残余的哪些物质可能会影响连接反应(A、C) A(酚 B.微量的EB C.琼脂糖 D. 少量的乙酸钠 E .少量的乙醇 4(产生平末端的方法主要有(A、B、E) A(用产生平末端的限制酶切 。 B(用klenow片段补齐5‘粘末端。 C(用末端转移酶补齐粘末端。 D(用Taq聚合酶补齐粘末端。 E(用S1核酸酶降解粘末端。 5(在DNA重组连接时，常采用连接头连接(linker ligation)，其作用是(A、B、C、E) A(引入某些限制酶切位点。 B. 人工构建载体。 C(增加调控元件。 D. 调整阅读框。 E(通过接头引入与目的基因相同的限制酶位点，并对目的基因相应酶切点进行甲基化修饰保护，可保护目的基因不受限制酶破坏。 6(构建载体时，使用双酶切相对于单酶切的优点在于(A、B、C、D) A(避免载体自身环化 B. 提高连接效率 C. 控制外源基因的插入方向 D. 便于转化后的筛选 E . 便于修改阅读框 7(下列关于同聚物加尾法的说法正确的是(A、B、C、D、E) A(其核心是利用末端转移酶的功能，将载体和外源DNA的3‘端再加上一端寡核苷酸。 B(不易自身环化。 C. 连接效率高 D. 适用于CDNA克隆 E(可能会产生某种限制酶切位点。 8(下列与DNA重组连接相关的说法正确的是 (A、D、E) A(不匹配的粘末端可通过部分填补后连接。 B( 同聚尾法连接不仅连接效率高，也易回收插入的片段。 C(限制酶切割DNA后加入EDTA-SDS终止液抑制限制酶活性，将有利于重组连接。 D(Mg2+-ATP是T4DNA连接酶反应时的必须因素。 E(平末端连接时，在反应体系中加入适量凝聚剂可提高连接效率。 9(下列哪些因素对保证较高连接效率是有利的(A、C、D) A(高纯度DNA。 B(载体与目的基因摩尔数之比为1:1。 C(载体与目的基因摩尔数之比为1:3~5。 D(连接反应体系中DNA浓度较高。 E(连接反应体系中DNA浓度较低。 10(如果DNA分子重组时，需要用平端连接，下列哪些方法可形成平末端(B、C、D、E)。 A(3‘突出的粘末端用DNA聚合酶加dNTPs填平。 B(3‘突出的粘末端用核酸酶切平。 C(5‘突出的粘末端用DNA聚合酶 加dNTPs填平。 D(5‘突出的粘末端用核酸酶切平。 E(利用切口为平末端的限制酶。 三、填空题 1(形成平末端的方法有 用产生平末端的限制酶切，用S1核酸酶切除粘末端 ，用DNA聚合酶填平粘末端。 2(载体与CDNA连接重组可用的方法有 同聚尾连接酶，加人工接头连接法。 3(DNA片段重组连接时，如要克隆PCR产物，PCR产物可直接用 T载体连接，而无须用限制酶处理。 4(回收DNA片段时，在确定DNA条带位置时，应使用 长 波长紫外灯，以最大限度减少对DNA的照射损伤。 5(回收DNA片段时，常用 正丁醇 处理以除去EB。 6(在用单一限制酶切载体和目的基因并进行连接时，为防止载体自身环化，常用 碱性磷酸酶 处理载体，或用 α-互补 进行筛选。 7(DNA片段重组连接的方法主要有 平端连接、粘端连接、同聚尾连接、加接头连接 。 四(简答题 1(如何将一平末端的DNA片段与BamH I形成的粘末端连接, 答:使用加接头连接法。人工合成一段含BamH I酶切位点的DNA短片段，然后与该平末端片段两端连起来，用BamH I切割连接片段，即可形成BamH I的粘末端。 2(什么是同聚尾连接法,具有哪些优缺点, 答:同聚尾连接法是利用末端转移酶在载体和外源DNA的3‘端各加上一段互补的寡聚核苷酸，形成人工粘性末端，然后在DNA连接酶的作用下，连接成重组DNA。 其优点在于(1)由于同一DNA两端粘尾相同，不会自身环化;(2)连接效率高;(3)用任何一种方法制备的DNA都可用这种方法连接。 其缺点在于(1)方法复杂;(2)外源片段较难回收;(3)由于添加了同聚尾，可能会影响外源基因表达。 3(什么是接头连接法, 答:人工合成或来源于某一质粒的小段含某限制酶位点的DNA与载体或外源DNA分子相连，这样便在载体或外源DNA上制造出新的酶切位点，即接头连接。 4(为什么用同裂酶进行体外重组效率最高, 答:同裂酶是指来源不同的限制酶切割DNA后，产生相同的末端。多数同裂酶产生的粘性末端并非完全一致而是有四个碱基相同，这样用同裂酶切割载体和目的基因后的连接产物常会失去原有的限制酶位点，这样用同裂酶进行重组时，限制酶切割反应后不用将该酶失活，即可直接进行重组连接，由于连接体系中原有限制酶存在，载体自连不会发生，从而保证了载体只同外源DNA的连接。 转化 一(单选题 1(下列哪种DNA结构在转化时能获得最高转化效率( ) A(线形双链DNA B. 单链线形DNA C. 完整的环状双链DNA D(开口环状双链DNA E. A和C 2(下列表型中，哪种是基因工程上的理想的受体菌表型( B ) A. r+m+rec+ B. r-m-rec- C. r- m+rec+ D. r+m+rec- E. r-m-rec+ 3(大肠杆菌出现感受态的生理期是 ( B ) A(潜伏期 B. 对数期 C. 对数后期 D. 平衡期 E. 衰亡期 4(CaCl2法制备E.coli感受态细胞时，摄入,,,温度是(E ) A(0? B. 16? C. 37? D. 25? E. 42? 5(关于感受态细胞的下列说法不正确的是( C ) A(有人工感受态细胞和自然感受态细胞。 B(具有可诱导性。 C(有可转移性。 D(不同种细菌出现感受态的生理时期不同。 E(不同种细菌出现感受态的比例不同。 二(多选题 1(C aCl2诱导E.coli感受态细胞时，下列哪些因素会影响转化效率(A、B、C、D、E) A(Ca2+浓度 B. DNA纯度与构象 C. DMSO D. 温度 E. PH 2(人工诱导感受态细胞，下列方法哪些正确(A、B、C、D) A(CaCl2处理 B. 核酸酶抑制法 C. 饥饿法 D. PEG处理 E. DMSO 3(下列有关利用粘尾质粒将外源DNA导入E.coli中的说法正确的是(B、C、D、E) A(空cosmid质粒可直接体外包装导入E.coli，也可用CaCl2法导入E.coli 。 B(Cosmid/DNA与头部蛋白、尾部蛋白混合，体外包装后可进入E.coli。 C(Cosmid虽然只有4~6kb ,但可容纳约40~50kb的外源DNA。 D(Cos序列是DNA包装到λ噬菌体颗粒中所需的DNA序列。 E(Cosmid/DNA重组体包装后以双链线性分子形式导入E.coli。 4(下列有关λDNA重组体导入E.coli 说法正确的是(A、B、C) A(λDNA重组体必须有效包装后才能有感染E.coli的活性。 B(λDNA重组体包装要有头部蛋白、尾部蛋白的参与。 C(λDNA重组体包装长度为野生型λDNA的75~105%。 D(λDNA重组体是以双链环状形式导入E.coli。 E(λDNA重组体用CaCl2法导入E.coli也能取得高转化率。 5(下列关于CaCl2处理获得感受态方法的说法正确的是(A、B、C、D) A(DNA与Ca2+结合后吸附在细胞表面，该复合物可抵抗细胞表面的DNAase作用。 B(DNA—Ca2+在0?时吸附于细胞表面，温度高或温度波动会大大降低转化效率。 C(有可能将两种质粒转入同一细胞但最终选择板上的菌落只含一种质粒。 D(42?热休克是为了让DNA进入感受态细胞。 E(热休克后要37?温育1小时，目的是使含有外源DNA的细胞分裂1~2代，更易筛到重组子。 三(填空题 1(感受态细胞是指 具有摄取外源DNA分子能力 的细胞。 2(λ噬菌体蛋白对重组DNA体外包装时，包装长度为野生型λDNA的 75~105%。 3(感受态大肠杆菌细胞在温度为 0? 时吸附DNA，42? 时摄入DNA。 4(CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，DNA以 DNA-Ca2+ 复合物形式吸附于细胞表面。 5(基因工程受体菌的基因型常为r-m-rec-, r-表示 限制缺陷型， m-表示 修饰缺陷型 ，rec-表示 重组缺陷型。 6(CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，热休克的温度是 42?。 7(E.coli感受态出现的生理时期是 对数期。 四(简答题 1(简述在CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，影响转化效率的各种因素。 答:影响因素有:Ca2+浓度、PH值、感受态细胞活力、DNA浓度、DNA纯度和构象、温度、DMSO处理、还原剂处理、氯化六氨合高钴处理。 2(CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，低温的主要目的是什么,热休克温度和目的是什么, 答:低温目的:(1)抑制细胞的旺盛生理代谢;(2)有助于DNA—Ca2+吸附于细胞表面;(3)防止DNAase降解DNA 。 热休克温度是42?;目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA。 3(简述利用Cosmid将外源DNA导入E.coli的特点是什么, 答:(1)Cosmid大小为4~6 kb，可用常规CaCl2法直接导入E.coli扩增。 (2)Cosmid含cos位点，是DNA包装到λ噬菌体蛋白颗粒中所需的DNA序列，cosmid/DNA重组体需与λ噬菌体头、尾部蛋白混合体外包装后，才能导入E.coli。 (3)其包装长度为野生型λ噬菌体DNA的75~105%，可容纳较大片段(30~50kb)DNA，可用于建立真核细胞文库。 (4)只有重组体可包装，未重组cosmid不能包装，因而不能进入E.coli有利于克隆的筛选。 第三章习题 选择题 1.关于PCR扩增停滞的原因有很多种，但下列各项中(B)项不是主要原因。 A.底物(模板)过剩 B.dNTP的大量消耗 C.产物的聚集 D.非特异性产物的竞争性抑制 2.Clark作了一个有趣的实验，发现TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的末端加一个碱基，主要是加(B) A. dGTP B.dATP C.dCTP D.dTTP 3.有简并引物的3’端尽量使用具有简并密码的氨基酸，这是因为(A) A. TaqDNA聚合酶具有一定的不精确性 B.便于排除错误碱基的掺入 C.易于退火 D.易于重组连接 4.PCR实验的特异性主要取决于(C) A.DNA聚合酶的种类 B.反应体系中模板DNA的量 C.引物序列的结构和长度 D.四种dNTP的浓度 E.循环周期的次数 5.有关PCR的描述下列哪项不正确:(D) A.是一种酶促反应 B.引物决定了扩增的特异性 C.扩增的产量按Y=m(1+X)n D.扩增的对象是氨基酸序列 E.扩增的对象是DNA序列 6.有关PCR的描述下列哪项正确:(ABC) A.polymerase chain reaction的字首缩写 B.1993年获诺贝尔化学奖 C.已广泛的应用于医学各学科 D.能够准确对扩增模板定量 E.以上都对 7.PCR反应产物的特异性取决于(E) A镁离子浓度 B退火温度 C引物碱基组成和长度 D循环次数 E.A+B+C 填空 1.Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的 。 2.在简并引物的设计中，常常要用到dI(次黄嘌呤)，原因是 。 3.简并引物PCR主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计 引物来合成相应的基因。 4.SSC是由NaCl和柠檬酸钠组成的试剂，其中NaCl的作用是使 ，而柠檬酸钠的作用是 。 KEY 1.T-载体 2.dI可以和任何载体相匹配 3.一组混合 4.DNA溶解;作为螯合剂抑制核酸酶的活性 简答题 1.你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出引物中选出合适的一对， 5’-GACCTGTGGAAGC CATACGGGATTG-3’ 3’-CTGGACACCTTCG GTATGCCCTAAC-5’ 引物1 引物2 5’-GACCTGTGGAAGC 5’-CATACGGGATTG 5’-CTGGACACCTTCG 5’-GTATGCCCTAAC 5’-CGAAGGTGTCCAG 5’-GTTAGGGCATAC 5’-GCTTCCACAGGTC 5’-CAATCCCGTATG 答:引物1:5’-GACCTGTGGAAGC; 引物2:5’-CAATCCCGTATG 2.PCR反应包括引物与DNA模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物-DNA双螺旋稳定性的影响及对PCR产率的影响。 答:由于GC对间是三个氢键的作用力，比两个氢键作用力的AT对要稳定，因此DNA的解链与退火都是依赖于G+C的含量与A+T的含量的比例。GC对普遍比AT对更倾向于非特异性的复性，所以GC含量高的引物比AT含量高的引物更适合于PCR反应。 PCR的基本原理是什麽,用PCR扩增某一基因，必须预先得到什麽样的信息, (1) 利用DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。 (2) 至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。 3.何谓简并引物,简并引物设计的一般原则是什麽, 答:简并引物是指根据肽链的氨基酸序列(或部分序列)，并充分考虑密码子的简并性而设 计的，用于PCR扩增的混合引物之间具有不同的碱基组成，但碱基数量是相同的。由于 充分考虑了密码的简并性，在这种混合引物中必定有一种引物可以和该基因的DNA序列 精确互补。 简并引物设计的一般原则是: (1) 选择保守区设计简并引物; (2) 选择简并性低的氨基酸密码区设计引物; (3) 注意密码的偏爱性; (4) 使用尽可能短的引物，以降低简并性，最短可用15~20个碱基。 (5) 由于TaqDNA聚合酶在PCR扩增时容易掺入错误碱基，所以设计的引物， 其3’端尽量使用具有简并密码的氨基酸。 4.在古生物学中，尚不知道恐龙是否是温血爬行动物，而不像今天的变温爬行动物。假如你得到一些恐龙的DNA，你如何通过PCR和基因克隆来检测恐龙是否是温血爬行动物, 答:用PCR扩增恐龙的高度保守的酶的基因，然后将扩增的DNA克隆到大肠杆菌表达载体，每可能被合成。然后测定酶的最适温度和热的稳定性并与相应的温血动物(如鸟类)进行比较。来自于冷血动物的酶与来自于温血动物的酶相比，温血动物最适的温度范围较宽。 5.PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同,你认为最根本的差别在哪里, 答:PCR用双引物，体内复制用单引物。 染色体DNA的提取 选择题 1.基因组是:(D) A(一个生物体内所有基因的分子总量 B(一个二倍体细胞中的染色体数C(遗传单位D(生物体的一个特定细胞内所有基因的分子总量 2.下列关于酵母和哺乳动物的陈述哪些是正确的,(ABD) A(大多数酵母基因没有内含子，而大多数哺乳动物基因有许多内含子 B(酵母基因组的大部分基因比哺乳动物基因组的大部分基因小 C(大多数酵母蛋白比哺乳动物相应的蛋白小 D(尽管酵母基因比哺乳动物基因小，但大多数酵母蛋白与哺乳动物相应的蛋白大致相同 3.下列哪些基因组特性随生物的复杂程度增加而上升,(ABD) A(基因组大小B(基因数量C(基因组中基因的密度D(单个基因的平均大小 4.细胞器DNA能够编码下列哪几种基因产物,(ABCDE) A(mRNAB(大亚基rRNAC(小亚基rRNAD(tRNAE(4.5SrRNA 5.从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖溶液，目的是:(B) A.抑制核酸酶的活性 B.保护DNA，防止断裂 C.加速蛋白质变性 D.有利于细胞破碎 6.用SDS-酚来抽提DNA时，SDS的浓度是十分重要的，当SDS的浓度为0.1%时:(B) A.只能将DNA抽提到水相 B. 只能将RNA抽提到水相 C. 可将DNA、RNA一起抽提到水相 D.DNA和RNA都不能进入水相 7.变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNA分离，原因主要是:(A) A. 氧化物可使DNA的磷酸二酯键断裂 B. 氧化物同DNA形成复合物 C. 氧化物会改变pH值 D. 氧化物在DNA分离后不易除去 8.在分离DNA时，异戊醇的作用是:(D) A(使蛋白质脱水B(使DNA脱水C(帮助DNA进入水相;D(减少气泡，促进分相 填空题 1.酚是蛋白变性剂用酚抽提细胞DNA时，具有两方面的作用:(1) (2) 2.用酚-氯仿抽提DNA时，通常要在氯仿或酚-氯仿中加少许异戊醇，这是因为:异戊醇 。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相，中间的变性蛋白及下层有机溶剂相维持稳定。 3.同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K具有两个显著的优点:(1) (2) 。 4.在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 5.用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子，如NaCl、NaAc，其目的是 。 6.浓缩DNA的方法有(1) (2) (3) (4) 。 7.通常可在三种温度下保存DNA:4~5?，-20?，-70?，其中以 最好。 8.用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到0.8，109细胞/ml时，即通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以 为宜。 9.在用SDS分离DNA时，要注意SDS的浓度，0.1%和1%的SDS的作用效果是不同的，前者 ，后者 。 10.在DNA分离过程中，通常要进行透析，其目的是 。 11.在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素很多，主要有(1) (2) (3) 。 12.在DNA分离过程时，常用(1) (2) (3) (4) 等方法去除蛋白质。 13.在DNA保存液中，常加一滴氯仿，主要是起 的作用。 14.在分离DNA时，要戴手套操作，原因是 。 15.乙醇沉淀DNA的原理是 。 填空题答案: 1.(1)使蛋白质变性;(2)由于它能使蛋白质变性，故也能使核小体和核糖体解聚，释放出DNA和RNA，提高DNA的得率。 2.是一种有机试剂，可以降低表面张力，从而减少气泡产生。 3.(1)水解能力很强，作用范围广;(2)在SDS和EDTA中保持高活性，可以同SDS和EDTA同时使用。 4.螯合Mg2+，抑制核酸酶的活性。 5.中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力。 6.(1)包埋吸水法 (2)蒸发 (3)膜过滤法 (4)有机溶剂抽提法 7. -70? 8.8000rpm 9.只将RNA分离出来;可将DNA与RNA一起分离出来。 10.除去小分子的无机离子。 11.(1)核酸酶降解;(2)化学降解;(3)物理减切 12.(1)酸变性;(2)碱变性;(3)热变性;(4)酶水解 13.抑制真菌污染 14.手上常有核酸酶 15.乙醇使DNA分子脱水 简答题 1.溶菌酶是破碎细菌细胞的有效方法，但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理, 答:添加DTT、,-巯基乙醇，或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。 2. SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它在这里的主要作用是什麽, 答:(1)溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂;(2)溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来;(3)对RNase、DNase有一定的抑制作用;(4)SDS能够与蛋白质结合形成R-O-SO3-…R-蛋白复合物，使蛋白质变性沉淀。 3.比较基因的大小和基因组复杂性的不同: 一个基因组有两个序列，一个是A，另一个是B，各有2000bp长，其中一个是由400bp的序列重复5次而成，另一个则由50bp的序列重复40次而成，问: (1) 这个基因组的大小怎样, (2) 这个基因组的复杂性如何, 答:基因组的大小是指在基因组中DNA的总量。复杂性是指基因组中所有单一序列的总长度。这个基因组的大小为4000bp;复杂性为450bp。 4.从细菌中分离总DNA，应采取哪些措施获得高分子量的DNA, 答:添加酶抑制剂抑制核酸酶活性，温和操作，加保护剂等。 用于克隆的DNA在质量上有什麽要求, 答:(1)首先是稳定性:保持DNA的高分子量和原有的构型。 (2)低蛋白质含量 (3)DNA样品中应不含RNA (4)不含可透析的小分子 5.为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂, 答:(1)细胞内存在很高的核酸酶活性，DNA裸露后，很容易遭到核酸酶的降解; (2)在分离DNA的过程中，要用到一些酸碱等化学试剂，也会使DNA断裂; (3)在DNA的分离过程中要经过多次离心、吸取、转移等，产生的机械张力剪切会使DNA断裂。 实验习题 一、 填空 1(质粒提取中细菌的裂解可采用多种方法，包括:非离子型或离子型去圬剂，有机溶剂，碱或加热处理。 92(用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到0.8×10细胞/ml时，即可通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以8000r/min为宜。 3(在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处:可以扩增质粒DNA;抑制了菌体的数量，有利于裂解。 4(常使用的质粒纯化方法都利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状两个性质。 5(由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(SC)的泳动速度最快，一条链断裂的开环状质粒DNA(OC)泳动速度最慢，二条链断裂的线性DNA(L)居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。 6(超离心法纯化质粒DNA时，选用CsCl作介质的优点是:CsCl与不同DNA起反应;CsCl可以自动形成密度梯度，从而使不同分子量的DNA分子得以分开。 7(SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用:溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂;溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来;对RNase、Dnase有一定-+的抑制作用;SDS能够与蛋白质结合形成R-O-SO…R-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。 132 8(碱裂解法所用溶液?、?、?的体积比为:2:4:3 9(质粒提取中溶液?的主要成分为SDS和NaOH。 10( 溶液?中钾是3mol/L，乙酸根是5mol/L 11( LiCl可沉淀大量蛋白质和高分子RNA。 12( 1OD=50μg质粒DNA/ml。 260 13( 在碱变形法提取质粒DNA实验中，聚乙二醇用于沉淀质粒DNA。 14( 残留在DNA样品中的酚可抑制酶的活性。 15( 质粒DNA提取中酚的pH值范围是pH7.8,pH8.0。 16( 乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的单价阳离子的类型有:乙酸铵、氯化钠和乙酸钠。 17( SSCP电泳方式为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 18( SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的。 19( 影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。 20( SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是:甲酰胺 21( 点突变对SSCP检出率的影响不仅仅取决于该点在DNA链上的位置，更取决于该位置对维持立体构象作用的大小。 二、 选择 1(质粒提取中溶液?的主要成分为:B A. SDS和EDTA B. SDS和NaOH C. EDTA和NaOH D. SDS和冰乙酸 2(分离质粒DNA时，用蔗糖的目的是:B A. 抑制核酸酶的活性 B. 保护DNA，防止断裂 C. 加速蛋白质变性 D. 有利于细胞破碎 3(关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确,:D A. 溶液?的作用是悬浮菌体 B. 溶液?的作用是使DNA变性 C. 溶液?的作用是使DNA复性 D. 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性 4(质粒DNA提取中酚的pH值范围:D A. pH6.5,pH7.0 B. pH8.0,pH8.5 C. pH6.8,pH7.0 D. Ph7.8,pH8.0 5(CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是:C A. 氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去 B. 氯化铯可以较多地插入到SC DNA中去 C. EB可以较多地插入到线状DNA中去 D. EB可以较多地插入到SC DNA中去 6(同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是:B A. OC DNA>SC DNA>L DNA B. SC DNA>L DNA>OC DNA C. L DNA>OC DNA.SC DNA D. SC DNA>OC DNA>L DNA 7(用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为:C A. 染色体DNA断成了碎片 B. 染色体DNA分子量大，而不能释放 C. 染色体变性后来不及复性 D. 染色体未同蛋白质分开而沉淀 8(1OD相当于每毫升质粒DNA:A 260 A. 50μg B. 100μg C. 50ng D. 100ng 9(加入溶液?后出现的白色絮状沉淀不包括:A A. 质粒DNA和小分子量RNA B. 染色体DNA和高分子量RNA C. 钾离子和SDS D. 蛋白质和细胞膜 10( SSCP电泳方式为:D A. 普通琼脂糖凝胶电泳 B. 低熔点琼脂糖凝胶电泳 C. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 D. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 11( SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是:B A. EDTA B. 甲酰胺 C. 溴酚兰 D. Tris-HCl 12( SSCP分离单链DNA片段是依据:B A. 单链DNA分子量大小 B. 单链DNA片段空间构象的立体位阻大小 C. 单链DNA带电量的大小 D. 单链DNA分子量和带电量的大小 三、 是非 1(迄今发现的质粒都是环状的。(错) 2(质粒DNA提取时，溶液?需新鲜配置。(对) 3(如果溶菌酶溶液中pH值低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。(对) 4(碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。(错) 5(CsCl-EB密度梯度离心法纯化SC DNA原理是根据EB可以较多地插入到SC DNA中，因而沉降速度较快。(错) 6(酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。(对) 7(氯霉素扩增DNA时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。(对) 8(碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。(错) 9(酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。(对) 10(SSCP对长链DNA或RNA的点突变检出率要比短链的高。(错) 11(SSCP分析中非变性PAG电泳分离不能反映出分子量的大小。(对) 12(SSCP可以检测出所有的单点突变。(错) 13 点突变对SSCP检出率的影响取决于该点在DNA链上的位置，点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来。(错) 四、 简答 1(简述溶液?、?、?所包含成分及生化作用原理 溶液?含葡萄糖和EDTA，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA2+2+可螯合Mg、Ca等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(Dnase作用时需要一定的金属离子作辅基)，另外，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 溶液?含NaOH和SDS，核酸在pH大于5小于9的溶液中是稳定的，但当pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液?中的NaOH浓度为0.2N，加入抽提液液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒的变性。SDS是离子型表面活性剂，它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜;解-+聚细胞中的核蛋白;SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO…R-蛋白质的复合物，使蛋白质变132 性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用Rnase去除RNA时)受到干扰。 溶液?是NaAc-Hac的缓冲液(pH4.8)。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液pH调回中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3MnaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 2(小量制备质粒DNA时发现质粒DNA不能被限制酶所切割，分析可能原因及解决。 由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导致。大多数情况下，用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化DNA。 3(溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理, 添加DTT、β-巯基乙醇，或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。 4(从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。 方法是先用酚:氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理:使用两种不同的有机溶剂去除 蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量酚。(此外，酚 虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制RNA酶的活性，它还能溶解带有长poly(A)段 的RNA分子。使用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液可以使这两个问题迎刃而解，) 5(在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1-0.25M? 在pH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使 Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成 DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造 成DNA沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过 多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 6(LiCl在质粒DNA提取中的作用是什么, 沉淀大量蛋白质和高分子RNA。 7(简述PCR-SSCP基本过程。 1) PCR扩增靶DNA; 2) 将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子; 3) 将适量单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; 4) 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，若发现单链DNA带迁移率与正常 对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断DNA片段中有碱基突变。 8(简述RNA-SSCP的基本原理。 RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了 检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行 电泳，有利于用溴化乙锭染色。 9(SSCP图谱一般是二条单链DNA带，有时可能只呈现一条SSDNA带或三条以上的原因是什 么, 主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象，有时三条以上的SSCP图谱是由于 野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。 10(分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状DNA在凝胶中迁移率大小顺序是什么, 超螺旋环状DNA迁移最快，其次为线状DNA，最慢为带切口环状DNA。 11( 影响DNA迁移率的因素有哪些, 影响DNA迁移率的因素有:DNA分子的大小，琼脂糖浓度，DNA的构象，所加电压，温 度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。