菌落的PCR鉴定

实验六  菌落的PCR鉴定 【实验目的】 通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。 【实验原理】 重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR对重组子进一步进行快速鉴定。以重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。 【实验步骤】 用200 μL的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15 μL无菌水中， 吹打混匀，从中取2μL菌液作为菌落PCR模板。 1．在200 μl PCR 管内配制20 μl 反应体系： 反应物                        体积/μL 模板DNA                        2.0 灭菌蒸馏水（ddH2O)              10.3 10×PCR 缓冲液                  2.0 dNTP  （2.5mM）                1.6 引物1  （2μM）                2.0 引物2  （2μM）                2.0 rTaq 酶  （1.0单位）            0.1 Total                            20 2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反 应成分集于管底。 3. PCR反应热循环程序设置： ① 94 ℃ 预变性 3 min; ② 94 ℃ 变性  30 sec; ③ 64 ℃ 退火  30 sec;            30 cycles ④ 72 ℃ 延伸  1 min; ⑤ 72 ℃ 延伸  3 min; ⑥ 16 ℃        pause 反应结束后短暂离心，置4℃ 保存备用。 配制1％的琼脂糖凝胶。 4.取5μL PCR产物加1μL 6×loading buffer于1%的琼脂糖凝进行电泳 剩余的13 μL菌液置4℃ 保存备用。 【结果与】 3 2 1 4 本实验扩增片段长652 bp。 由图可知，1、4泳道没有条带，说明目的基因没转入感受态细胞。可能的原因是连接体系有外源性核酸酶污染，使T-载体变为平端，连接后由于移码，而生成白斑。而2、3号泳道目的基因已成功转入感受态细胞中，所得片段大小符合目的片段。