DNA重组质粒的构建

DNA重组质粒的构建 DNA重组质粒的构建基因克隆 gene cloning应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子(重组体)，继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。核心技术:DNA重组技术 ( recombinant DNA technique )基因克隆的基本程序: 分—切—接—转—筛 PCR 酶切 连接 转化转染 抗性或标记筛选目的基因DNA片段的获得外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞重组DNA 分子克隆的筛选和鉴定目的基因或其表达产物的纯化和鉴定基因克隆技术的特点: 1. 可在体外人工的 有目的的 根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复; 2. 方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。 基因克隆示意图 载体DNA ， 限制性内切酶切开 目的基因 ， 重组体 宿主细胞 已转化的宿主细胞 繁殖 阳性克隆株 表达胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素 EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子?脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体例:干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是:从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。DNA重组操作过程 重组 引入宿 a b 主细胞 b A b 剪切 载体 抗性筛选 外源DNA插入 A 重组筛选 外源DNA片段重组质粒构建:目的DNA的PCR扩增 DNA片段和载体的酶切 片段DNA与载体的连接载体: plasmid(primary)工具酶:限制性内切酶 连接酶 常见的基因工程载体载体:用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起 复制与表达的运载工具。 根据来源:plasmid phage viral BAC YAC 根据用途分:克隆载体;原核生物表达载体;真核 生物表达载体 根据与宿主的关系分:整合性载体、非整合性载体 基因工程中用得最多的是plasmid载体。下面介绍几 种常见的载体。载体的基本结构单元:1.复制起点2.克隆位点3.筛选标记其他条件:4.适当大小5.易于操作:包括宿主、转化(或转染)、分离纯化、重组等等。 质粒Plasmid质粒是独立于宿主细胞(如细菌)染色体之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链闭合环状超螺旋DNA分子。是一种环状的双链DNA分子，大小从1K-200Kb。 通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责 编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生 存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿 主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗 生素的抗性(R因子)、产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生大肠杆菌素(大肠杆菌 素因子col)、肠毒素及限制酶、修饰酶等。 质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细 胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细 胞复制自身染色体的同一组酶系。 质粒DNA的特征 质粒复制依赖宿主细胞的复制机器，但可以独立复制。(单拷贝或多拷贝:紧密型质粒和松弛型质粒) 严紧型:这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个 细胞中只有一份或几份拷贝; 松驰型:这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之 下的，每个细胞中含有10-200份拷贝 不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复 制和分配到子细胞的过程中相互竞争。 质粒DNA所编 码的基因产物赋予细菌某些性状特征。 质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质，可以在细菌间 转移与丢失。 质粒可自行失去或经人工处理而消失 可有几种质粒同时共存在于一个细菌内，但同群质粒有不 相容性(同群质粒具有同源性，可以产生相同的阻遏蛋 白，故彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞)(四)人工构建质粒的基本元件 启始复制子:使质粒在宿主细胞中能够复 制 抗性基因:用于筛选阳性克隆。 多克隆位点:插入外源基因。对于表达载体还需要启动子、多聚A尾等.易于操作:包括宿主、转化(或转染)、分 离纯化、重组等等。pBR322 plasmid 是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备:复制起点:Ori克隆位点:EcoR IHind IIIBam HISal I筛选标记:Ampr。T-vector PCR产物亚克隆载体 T—Vector是一种高效克隆PCR产物 TA Cloning的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的3„端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3?末端添加一个“A”的特性所以用本制品可 PCR产物时用高效连接液大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 T-vector 克隆 LigationSolution I 可以在极短的时间内 30分钟,1小时 完成连接反应，大大地方便了实验操作。 用途 克隆PCR产物。 对克隆后的PCR产物使用M13 primers进行DNA测序。