血清丙氨酸氨基转移酶测定
实验六 血清丙氨酸氨基转移酶测定
一 实验目的
(1)了解血清酶活性测定的基本
(2)掌握血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定的临床意义
二 实验原理
丙氨酸及α-酮戊二酸在ALT作用下,生成丙酮酸及谷氨酸,丙酮酸与,,,-二硝基苯肼作
COOH COOH
| |
COOH C=O COOH H –C–NH2
| | ALT | | HC-CH+CHC=O + CH3 2 2
| | | |
NHCHNHCH | 2 2 2 2
| |
COOH COOH
丙氨酸 α-酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸
用,生成丙酮酸,,,-二硝基苯腙,在碱性溶液中呈红棕色。于波长505nm处读取吸光度值,计算酶活性。
三 试剂与主要器材
(1)0.1mol磷酸盐缓冲液(PH7.4):将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml,0.1mol/L磷酸二氢钾80ml,混匀,即为PH7.4、0.1mol磷酸盐缓冲液,加氯仿数滴,4?保存。
(2)ALT基质液:称DL-丙氨酸1.79g,α-酮戊二酸29.2mg,加磷酸盐缓冲液(PH7.4)约50ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/LnaOH调整PH7.4(约加0.5ml),缓冲液加到100ml,加氯仿数滴, 4?保存。该溶液可稳定2周。
(3),,,-二硝基苯肼溶液:称取,,,-二硝基苯肼19.8mg,溶于10mol/L盐酸10ml中,完全
溶解后蒸馏水至100ml,置棕色瓶中,室温保存,若有结晶析出,应重新配置。
(4)2μmol/L丙酮酸标准溶液:精称纯丙酮酸钠22.0mg于100ml容量瓶内,加磷酸盐缓冲液(PH7.4)至刻度。此液应新鲜配制,不能存放。
(5)0.4mol/LnaOH溶液:将16gNaOH溶液于蒸馏水中,加蒸馏水至1000ml,
置塑料瓶内,可长期使用。
四 实验方法
(1)标准曲线的制作。
0 1 2 3 4 丙酮酸标准液(ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 基质液(ml) 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 磷酸盐缓冲液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 相当于酶活性单位(卡门单位) 0 28 57 97 150
各管加入2,4–二硝基苯肼0)5 ml,混匀,37?水浴20 min后加入0)4
mol/L NaOH 5)0 ml,混匀。放置5min后在波长505nm处,以蒸馏水调零,读
取各管吸收光度值,各管吸收度值减去“0”号管吸收度,以所得吸光度差值为
纵坐标,各管相当酶活性单位为横坐标,绘制成标准曲线。
(2)血清ALT活性的测定。
测定管 对照管
血清(ml) 0.1 0.1
基质液(ml) 0)5
37?水浴30 min
2,4–二硝基苯肼(ml) 0.5 0.5
基质液(ml) 0.5
37?水浴20 min
0)4mol/L NaOH 5.0 5.0
放置5min后波长505nm处,以蒸馏水调零,读取各管吸光度值,各管吸关
度值减去“0”号管吸光度,从标准曲线上查得ALT的卡门单位。
五 临床意义
正常参考范围:8,25 卡门单位。
ALT在人体以肝脏含量最为丰富,其他组织如心肌等组织此酶含量亦不少。
所以肝炎急性期,药物中毒性肝细胞坏死时ALT明显增高,肝癌、肝硬化、慢性
肝炎、心肌梗死时ALT中度增高,阻塞性黄疸、胆管炎时ALT可轻度增高。