香水莲花多酚类组分及其抗氧化和抑制酪氨酸酶活性研究（可编辑）

香水莲花多酚类组分及其抗氧化和抑制酪氨酸酶活性研究（可编辑） 香水莲花多酚类组分及其抗氧化和抑制酪氨酸酶活性 研究 论文独创性声明 本人郑重声明: 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。 、本论文中除引文外,所有实验、数据和有关材料均是真实的。 、本论文中除引文和致谢的内容外,不包含其他人或其它机构已经 发表或撰写过的研究成果。 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢 意。 作者签名:缸?篮. 日 期:?丝叫 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的,学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版;有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图馆被查阅;有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索:有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名:盆叁 日 期: 型么翌::目录 目录 摘要 第章文献综述 .概述??. ..睡莲属简介? ..香水莲花的简介.睡莲的国内外研究概况 ..荷叶的研究概况?。 ..藕的研究概况??。 ..香水莲花的研究概况 .黄酮类化合物的研究现状..黄酮类化合物的化学结构和生理活性..黄酮提 取分离纯化工艺.论文设计思想. ..选题背景? ..研究目的与意义?. ..研究内容及? 第章香水莲花多酚类组分的研究 .香水莲花提取分离及纯化?. ..材料、仪器与试剂. ..香水莲花醇提物的提取分离及纯化..香水莲花醇提物沉淀酰化产物的分 离纯化??. .研究结果??. .. .样品的定性检测??一 .. .组分的高效液相色谱检测结果..?...的高效液相色谱检测结果?. .结构鉴定??.. ..化合物. ..化合物...??.::?. .讨论?.. .附录化合物.及化合物?...?各类图谱..第章香水莲花总黄酮的提取分离 及纯化 .微波提取香水莲花总黄酮的工艺研究??. ..材料与仪器. ..试验方法? ...结果与 ..结论 .大孔树脂精制香水莲花黄酮. ..仪器与材料.. ..材料的制备. ...实验方法?一 ..结果与分析 .高速逆流色谱法初步纯化香水莲花黄酮?. ..试剂与仪器。 ..实验方法? ..结果与分析。 . .?%流份的纯化??。 .. .纯化..%流份,高效液相色谱检测结果如下:? ..萃取..联合法纯化.%洗脱部位 .小结?。 第四章香水莲花生物活性的研究?. .香水莲花醇提物抗氧化活性研究?. ..材料与仪器??.. ..试验方法??. ..实验结果..讨论 .香水莲花抑制酪氨酸酶活性研究?. ..材料、仪器与试剂。 ..试验方法? ..结果与分析 ..小结 第章结论与展望参考文献 一?????????????????????????????????????????????...................... ...............................。?????????????????????????????????????目录 研究生期间科研成果.. 致 谢?..香水 莲,其化 性成分。 纯化及结构鉴定:由于含有较多酚羟基类的大极性物质,为便于成分研究,将醇 提浓缩物的沉淀部位进行了乙酰化,并对酰化产物进行了分离、纯化及结构初步 鉴定;初步研究了香水莲花提取物及各部位的抗氧化活性和抑制酪氨酸酶的活 性。此外,还对香水莲花总黄酮的微波提取工艺进行了研究,并对其黄酮成分进 行了纯化。 首先,采用%的乙醇对香水莲花干花进行回流提取,浓缩得到的粗提物的 乙酸乙酯部位分别经硅胶柱层析、凝胶.柱层析分离纯化,采用 薄层层析及高效液相色谱法鉴别纯度,得到了个较纯的化合物。经核磁共振包 括、撇、红外光谱等手段首次在该植物中鉴定出了,,.三羟基 苯甲酸,即没食子酸,其余成分的鉴定工作仍在进行中;研究发现香水莲花干花 中含有的多酚类物质较多,为化学成分的分离纯化增加了难度,经多次纯化得到 的组分纯度仍未达到鉴定的要求,为此将醇提物沉淀部位的酰化产物进行了分 离、纯化及结构初步鉴定,主要结构为乙酰化的多羟基黄酮葡萄糖甙。 其次,对香水莲花总黄酮的微波提取工艺进行了研究,确定了最佳的微波提 ,提取时间 ,液料比:。采 取条件:乙醇浓度为%,微波功率 用大孔树脂对香水莲花微波最佳条件所得的醇提物用不同浓度的乙醇进行 分离,得到的%乙醇洗脱部位以正己烷.正丁醇.甲醇.水:::为两相溶剂 /、流速. /、检测波长 的条件下,应 系统,在主机转速 用高速逆流色谱法进一步分离了香水莲花的黄酮类成分。 最后,对香水莲花醇提物的抗氧化活性和香水莲花各提取物抑制酪氨酸酶的 活性进行了研究。抗氧化实验结果表明:香水莲花醇提物对超氧阴离子自由基及 羟自由基具有清除作用;具有一定的还原能力和总抗氧化能力。抑制酪氨酸酶活 性实验以.酪氨酸为底物,以熊果苷为阳性对照,从马铃薯中提取酪氨酸酶, 分别以香水莲花醇提物、水提物及总黄酮为实验样品,结果表明:香水莲花总黄 酮对酪氨酸酶的抑制活性优于香水莲花醇提物,且两者对酪氨酸酶的抑制率 均相 当于阳性对照熊果苷对酪氨酸酶的抑制率,可以考虑将其作为一种新型植物 源的 美白剂,应用于化妆品行业。 关键词:香水莲花,多酚类,抗氧化,酪氨酸,总黄酮 . . , . , ,? 嬲 . ., .%.,一. ,. ”、 埘. ... : . %,:. ,一.% . 址曲 ?? :?:::,、帅, ~/. . /, :.;. , . : . ? . : ;;;;. ?第章文献综述 第章文献综述 .概述 ..睡莲属简介 .是睡莲科中最大的属,约种,广泛分布在欧亚大陆、 睡莲属 美洲、非洲及大洋洲各地。该属为多年生宿根浮水型植物,是园林水体绿化、美 化和净化的主体水生花卉之一。睡莲属植物除作为观赏外,还可供鲜切花和制作 工艺干花,具有较高的经济价值。另外,某些种的根茎、花芽和种子可食用、药 用或作染料及制革的媒染剂。如英国人用欧洲白睡莲的根作染 料;国人把睡莲用作酿造啤酒、制作保健品、化妆品的原料等。原生于我国的睡 莲属植物仅有.种,但随着国际花卉市场的开放与流通,目前我国已拥有睡莲 属植物.种的大约上百个品种。随着外来物种和品种的增多,睡莲种植面积 的扩大,寻求睡莲观赏以外的用途便是顺理成章的事情。因此,对睡莲化学成分 的分析及其生物活性的研究,具有重要的学术价值和经济价值。 ..香水莲花的简介 香水莲花属睡莲科睡莲属,是一种多年生宿根水生花卉,为大型 睡莲。它由台湾园林部门于世纪年代在引进美国香莲的基础上,经过多年 培育,选出了金、黄、红、紫、蓝、赤、茶、绿、白种深浅不同的花色,俗称 九品香水莲花。它集当今世界各地荷花、莲花珍贵品种之优点于一身,因而成为 备受青睐的园林水生观赏花卉?。 香水莲花花朵硕大,直径甚至有 以上者。花朵可伸出水面,花瓣 片,排列清晰整齐而多轮,颜色鲜艳美丽。不同品种的香气由清雅到浓郁而 各具特色。部分品种有一定的耐寒能力,温度适宜时可全年不间断地开花,秋冬 最美,适宜室内养育观赏。每朵花持续开放的时间长短随温度而异,夏日, 冬~日左右,日放夜收。如果及时采摘,每株每年可开花朵,产 花量居世界荷花或莲花之冠。香水莲花的叶子圆形有缺口,边缘有锯齿,叶片浮 于水面,叶面可聚合水珠,也很有观赏价值。 香水莲花之特有品质,鲜花可供人生食、泡茶、浸酒、炖煮食物等,经高温 烘焙,可制成香莲茶。香莲茶汤色金黄,不含咖啡因,无刺激性,是一种纯天然 绿色食品,有滋养补身、益脾养颜、美容护肤、清暑解热、醒酒除闷的作用。 第章文献综述 .睡莲的国内外研究概况 花卉的开发、利用的价值潜力巨大。利用花卉制成的中药、花酒、保健茶、 糕点等食品,一般能够产生数倍的效益。如果能利用高新技术提取花卉中有效的 成分,制成精油、香料、食品、化妆品、保健食品和药品,市场开发潜力十分明 显,利用现代化高新技术分离纯化食用花卉中的有效成份已成为增加食用花卉附 加值的一个重要途径。 从目前已经发表的文献看,国内外对睡莲属植物的化学成分和生理功能研究 主要集中在对荷叶的研究,也有对藕的研究报道,但对花的研究报道较少。 ..荷叶的研究概况 荷叶是睡莲科植物 莲的叶片。荷叶除了含有普通植 物所共有的碳水化合物、脂质、蛋白质、维生素、单宁等常规化学成分外,还富 含多种活性成分,例如:‘生物碱、黄酮、挥发油、皂苷、甾体、多糖、有机酸等。 其中生物碱种类较多,包括荷叶碱、一去甲荷叶碱、一去甲荷叶碱、牛心果 碱、绕袂碱、亚美帕碱、一甲基衡州乌药碱、原荷叶碱、鹅掌楸碱及去氧绕袂 碱等等。黄酮类主要是槲皮素和异槲皮苷,有机酸包括酒石酸、枸橼酸、苹 果酸、 草酸、琥珀酸等,此外尚含具有抗有丝分裂作用的某种结构未明的碱性成分。 荷叶是药食两用的中药,其水提物气味清香,清?解暑,生津止渴,酸甜可 口,具有减脂降脂保健功能的作用。 对荷叶活性成分的研究主要集中在对荷叶的多糖、黄酮及其生物碱的研究。 临床用荷叶水煎剂口服有一定的调脂作用。钟先锋【】等对荷叶多糖进行研究, 测定了荷叶多糖含量达%以上。陈海光等测定了水提物对羟基自由基及超氧 阴离子自由基的清除作用,为荷叶保健食品的开发提供一定的理论依据。杜力军 【】等以急性高脂血症小鼠为整体模型观察荷叶水提物对血清胆固醇及甘油三酯 的影响,结果表明:荷叶水提物有明显的调脂作用,其活性部位主要是荷叶黄酮, 其次是荷叶生物碱。许腊英【】等以荷叶抽提物中的生物碱为指标,通过对小白鼠 的喂养试验,证明其具有降脂作用。荷叶的生物碱和黄酮类化合物还具有抗有丝 分裂、抑菌和止痉挛等作用。 在荷叶的众多化学成分中具有明显生物活性和生理功能的是黄酮化合物和 生物碱这两大类物质,在这两方面的研究占到对荷叶总研究的%上,而且国内 外的学者对这些成分的功能活性也做了进一步的研究,但尚未了解其在体内 的反 应途径。 对荷叶的生理活性研究主要集中在对其抗氧化功能、减肥降脂功能及其抑菌 功能的研究。余以刚【】等采用电子自旋共振法自旋捕集技术研究了荷叶水提物 第章文献综述 对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除效果。结果表示. /的 对次黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶体系产生超氧阴离子自由基的清除率达.%, 浓度大于. /时可以全部清除由反应体系产生的羟自由基。由 此可知,荷叶水提物是一种非常优良的抗氧化剂。纪丽莲瞵等对荷叶不同有机溶 剂提取物的抗氧化活性作了深入研究,结果表明:荷叶抗氧化成分的最佳提取溶 剂为甲醇:荷叶的甲醇提取物具有强抗氧化活性,并与的抗氧化性相当, 而略高于.生育酚的抗氧化性;荷叶抗氧化物质的主要成分为.胡萝素、 .生育酚和黄酮类化合物。 近年的研究表明,荷叶具有调节血脂的功能,主要活性部位在黄酮和生物碱, 作用特点主要是促进胆固醇的代谢。陶波等【】研究荷叶水煎剂对高脂血症大鼠血 脂及血液流变学的影响,发现荷叶水煎剂能使高脂血症大鼠的下降.%~ .%,下降 .%~.%,对.未见明显影响,但随、的降低, .显著下降;同时荷叶水煎能降低全血比粘度、红细胞压积,从而改善血液 浓粘状态,说明荷叶水煎剂具明显降脂作用,这对防治高脂血症、肥胖及动脉粥 样硬化等并发症具有重要意义。张建伟等【 】自拟祛脂汤由山碴、丹参、荷叶等 组成治疗脂肪肝例,?结果显示该方具有降脂护肝,改善肝脏代谢的功效,而 无激活脂蛋白酶类西药损肝的弊病。 纪丽莲用荷叶乙醇提取物对种常见的食品腐败菌及致病菌进行抑菌活性测 定。结果表明,荷叶的抑菌作用显著,特别是对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵 母菌等主要靠无性裂殖繁殖微生物的抑制效果最为显著,且大多数供试菌的最低 抑菌浓度值小于或等于%。实验结果同时表明荷叶提取物在中、弱碱性条 件下抑菌活性最强,并能耐受高温短时及超高温瞬时的处理【?。 对荷叶的生理活性的研究,境外较少,只有台湾几位学者对荷叶的抗氧化活 性进行了研究。他们通过体外培养实验,认为荷叶的甲醇提取物具有清除羟基自 由基的能力,说明荷叶的甲醇提取物具有保护细胞免受氧化损坏的能力。另外, 荷叶的甲醇提取物还具有抗血色素诱导的亚油酸过氧化的能力,这与纪丽莲的研 究相似【。 ..藕的研究概况 莲藕为睡莲科多年生植物,原产亚洲南部热带沼泽地区,在我国已有 多年的栽培历史,现全国各地均有栽培。淀粉是莲藕的主要营养成分,对莲藕产 品的工艺过程和品质都有很大的影响。国内外有关莲藕淀粉颗粒性质的研究报道 极少。莲藕是无性繁殖植物,遗传变异很大,因而品种混杂现象较为严重。田翠 华等以特定品种的莲藕分离纯化出莲藕淀粉,对莲藕淀粉的颗粒特性进行了深入 研究,为莲藕产品的开发研究、工艺制定和品质控制提供理论依据。 第章文献综述 严浪【】等通过水提醇沉法从提取了淀粉的莲藕渣中分离得到可溶性粗多 糖,采用 离子交换柱层析纯化得到吸附多糖组分 ,,通过清除?和对氧化损伤红细胞溶血的影响研究水溶性莲藕多糖潜 在的抗氧化活性,实验结果表明:没有清除自由基的活性,但是对红细胞 自氧化和羟自由基导致的红细胞溶血起到了保护作用。 ..香水莲花的研究概况 徐辉等首次测定了香水莲花中各种化学成分的含量;对香水莲花的多糖进行 了提取分离及纯化鉴定,首次证明了香水莲花多糖是以酸性多糖为主体的杂多 糖,初步探明了香水莲花酸性多糖的部分一级结构;对香水莲花醇溶性 化学成分进行了提取分离及结构鉴定,经波谱分析鉴定出两个化合物,分别为硬 脂酸和.谷甾醇,并对香水莲花鲜花的挥发性成分进行了鉴定。 徐辉等初步研究了香水莲花干花对实验动物血脂水平和肝脏脂肪含量的影 响。结果显示:香水莲花具有较强的降血脂功能和良好的抗脂肪肝作用。 综上所述,进一步研究香水莲花化学成分的性质、结构、活性功能等,对香 水莲花化妆品、食品和保健品的开发具有一定的指导意义。鉴于以上原因,本实 验着重研究香水莲花的多酚类组分和活性功能。 ..香水莲花的开发利用前景 花卉在世界各地包括我国正越来越受到人们的普遍喜爱,随着人们物质和文 化生活水平的不断提高,人们更注意养生、减肥、保健、美容的作用,这些能给 人带来美感,具有丰富营养价值和保健作用的花卉也成了寻常人家餐桌上的佳 肴。在美国、日本、意大利、法国、台湾等地,食用花卉已成为新的饮食时尚。 在我国花卉产业虽处于起步阶段,但市场前景十分看好也十分广阔,因此,花卉 无论是内销还是出口前景都比较看好。 随着我国对外贸易活动日益频繁,睡莲得到了各地园林部门的高度重视,并 从欧美等国家陆续引种了不少睡莲品种,大大地满足了国内市场的需求,同 时也 增添和丰富了园林水景的色彩。现在在我国的南部广州、福建等地有大面积的种 植,随着其品种的性状改良,并在花色、花期,耐寒性和花的大小方面都有了一 定的改变良,其种植面积越来越大。同时,源于香水莲花的各种产品也开始不断 开发,有以花托连同雄蕊一起经高温烘培制成的香水莲花茶,也有以其提取物制 成的九品莲花酒。据说以香水莲花子房中的胶质敷面有很好的美容效果。因此, 香水莲花不但具有观赏、食用价值,还具有一定的药用价值,具有广泛的开发和 应用价值。 第章文献综述 .黄酮类化合物的研究现状 ..黄酮类化合物的化学结构和生理活性 ...黄酮类化合物的化学结构 图.黄酮类的基本化学结构 .. 黄酮类化合物是一类广泛分布于植物界的、具有.苯基色原酮 母核结构的化合物。其中黄酮分子中有一个酮式羰基,第一位上的氧原 子具碱性,能与强酸形成韦羊盐,其羟基衍生物多具黄色,故又称黄碱素。然 而 黄酮只是黄酮类化合物的一个亚类,目前广义的黄酮类化合物指凡具有 ..基本骨架结构,其上常有.与.等取代基的一类多酚化合物 ::,以及由它们与糖结合成苷的类黄酮苷 。 根据中央三碳链的氧化程度、环联接位置.或.位以及三碳链是否 构成环状等特点,可将重要的天然黄酮类化合物分为黄酮类、异黄 酮类、查尔酮类、黄酮醇类、黄烷.一醇 类..等十多类。其中以黄酮醇类最为常见,约占总数的/,其次 为黄酮类,占总数的/以上,其余则较为少见【卜。 通常类黄酮化合物都是以.糖苷的形式出现。在这种结构中,类黄酮化合 物糖苷基的一个或多个羟基通过酸不稳定的半缩醛与一个或多个糖分子相 接,糖 基化的作用增大了类黄酮化合物的水溶性,这一特征使其可以在细胞的液泡 中蓄 积起来一般类黄酮化合物存在于液胞内。与糖苷配基结合的糖最常见的是葡 萄糖。 ...黄酮类化合物的生理活性 ....抗氧化作用 黄酮为酚酸类化合物,在某些金属离子存在的条件下,其结构极易被氧化, 所以具有很强的抗氧化活性,能保护细胞膜上的非饱和脂肪酸免于氧化 ????????????????????????????????????????????’???????????? ??????????????。???????????????? 第章文献综述 。’’’‘。。。。‘‘。。。。。。。。。。。。。。。‘。。。。。‘‘。‘。。。。。。。。’。。’‘’。’。?’ ,‘口.:’【?’?,,、?, 所发挥的保护功效归因于它们对自由基的转变、螯和 【。黄酮类在生物系统中 金属催化剂刚、激活抗氧化酶【】、还原.生育酚自由基和抑制氧化酶嘲。郑公 铭等】对荔枝皮进行了食品抗氧化研究,结果表明,成熟荔枝皮和未成熟生理 落果荔枝皮提取物均有很强的抗氧化活性,经层析、化学显色推断,抗氧化成 分主要是黄酮类物质。等【】用化学荧光法对不同黄酮类化合物进行了分 析测定,确定了它们的强抗氧化性。由于抗氧化性质对低密度脂蛋白胆固醇 氧化的抑制,黄酮类展现了独特的心血管系统保护功效:。黄酮类化 合物捕获自由基,降低其对机体危害的生物活性,抗氧化是目前黄酮类化合物活 性研究最多的领域,而且许多黄酮类化合物的抗氧化活性远高于维生素,同时毒 性很低【。 ....对心血管系统的作用 黄酮类化合物对于心血管系统的作用是多方面的,银杏叶总黄酮有较明显的 降低血浆胆固醇及甘油三酯水平的作用【】,并且能够预防家兔的动脉粥样硬化。 、及 、在大白鼠及家兔身上 从桑根皮中分离得到的 示有明显的降压作用【。贾乘【采用放射免疫测定法研究沙棘总黄酮对大鼠血 浆和水平的影响,结果表明沙棘总黄酮具有单纯增强分泌的 作用。三棱总黄酮具有较强的抗血小板聚集及抗血栓作用【】而血竭总黄酮能够 明显地抑制静脉血栓的形成。 ....抗炎作用 ’ 黄酮类化合物,如芦丁及其衍生物羟乙基芦丁、二氢槲皮素以及橙皮苷.甲 基查耳酮等,据报道对角叉菜胶、及诱发的大鼠足爪水肿、甲醛引起 的关节炎及棉球肉芽肿等均有明显抑创作用。此外,生物类黄酮中的异黄酮类和 香豆素类等显示出抗雌激素作用。年,首次报道妇女尿中异黄酮 植物雌激素含量和妇女患乳腺癌机率成反比【,近年来,这方面的研究主要集 中在大豆异黄酮类及其皂苷对乳腺癌的作用上,并有人推测,异黄酮等的抗雌激 素作用可能是其抗癌的机制。多种资料显示性激素与致癌有关,其途径是通过抑 制细胞分裂,而植物雌激素类通过竞争结合雌激素受体,增加性激素结合蛋白的 合成,进而抑制肿瘤细胞的增殖【‘。 此外,研究表明黄酮物质具有降低胆固醇,抑制癌症的作用【邓,还有降血 脂、镇痛、抑制血小板聚集、抗骨质舒松‘、抗心律失常、抗菌、抗衰老‘矧、 抗过敏及抗缺氧等多种药理及保健作用。 第章文献综述 ..黄酮提取分离纯化工艺 ...提取 ....传统提取方法 热水浸提法 由于黄酮苷类物质易溶于水,所以对黄酮苷类物质含量较高的原料,可以采 取热水浸提法。该法以水为提取溶剂,无毒、成本低,提取率可与醇提法媲美。 例如,陈海光【】等以水为溶剂研究了荷叶黄酮类化合物的提取工艺条件, 结果 表明:以水为溶剂来提取荷叶中的黄酮类化合物,较佳的工艺条件为以倍的 水, 于??,提取.。但是,由于水的极性大,易把蛋白质、糖类等溶于水的成 分浸提出来,从而使提取液存放时易腐败变质,为后续的分离带来困难,这是 水 提法的最大不足 碱水或碱性稀醇溶液提取法 黄酮类物质大多数具有酚羟基,因此可以用碱水或碱性稀醇浸出,经酸化后 得黄酮类物质。常用的碱性溶液是稀氢氧化钠和石灰水氢氧化钙水溶液。氢 氧 化钠水溶液浸出能力高,但杂质较多不利于纯化。石灰水可以使一些鞣质或水溶 性杂质生成钙盐沉淀,有利于浸提液的纯化,但浸出效果不如氢氧化钠水溶液好, 同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质,不被溶出。一般可以根据不同 的原料使用不同的碱性溶液,但应注意的是采用碱提法时,所用碱的浓度不宜过 高,以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核。例如,张永煌等【】根据 葛根黄酮结构中酚羟基易溶于碱水的性质,用饱和氢氧化钙水溶液分别以倍量 提取次及倍量提取次,取得了满意的总黄酮提取率。 有机溶剂浸提法 有机溶剂提取法所得的提取液可达到初步精制和纯化的程度,也很容易实 工业化生产。在用石油醚或己烷对样品脱脂后,接着使用一定极性的有机溶剂进 行冷浸或加热抽提,去除溶剂后就得到具有一定纯度的黄酮提取物,是目前国内 外提取总黄酮或某类黄酮化合物的最常用方法。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、 丙酮等,但由于甲醇、丙酮等的毒性较大因此乙醇的应用更为广泛。用单一溶剂 提取,往往得到的是总黄酮或某一类黄酮而难以将植物中不同类别的黄酮化合物 依次分离,因此对同一植物样品可以用性由小到大的溶剂依次提取。例如用苯提 取多甲氧基黄酮或含异戊烯基、甲基的黄酮,再用氯仿、乙醚、乙酸乙酯提取出 大多数游离的黄酮类化合物,然后用酮、乙醇、甲醇、甲醇.水:提取多羟基 黄酮、双黄酮、查耳酮等,最后用稀醇、沸水提取出类黄酮苷类,%提取 花色素类等。 高金燕等无水乙醇为提取剂,采用在。下回流提取.,实现了西芹 第章文献综述 样品中大部分黄酮物质的提取分离,提取效果较好。同时,他们的研究还发现, 用乙醚去除叶绿素后可进一步改善黄酮物质的提取率。 ....现代提取技术 ....微波辅助提取法 微波提取是目前国内外正在研究开发的一种新的提取技术,它以快速、试剂 用量少以及提取效率高等特点受到广泛重视。微波提取法己成功地用于植物有效 成分的提取【朋。李嵘等曾用微波提取法提取了银杏叶中的黄酮甙【。刘忠 英等 用微波提取法提取了刺五加中的黄酮类化合物,他们研究的结果都表明, 与索氏提取法相比,微波提取法的提取率明显提高。 .....超声提取技术 超声提取是一种比较新的提取方法,超声波对类黄酮提取的辅助作用主要源 于超声空化,超声的机械效应和热效应也会有一定贡献。超声空化产生的极大压 力使得植物细胞壁及整个植物体在瞬间被破碎,并引起湍动效应、微扰效应、界 面效应和聚能效应,其中湍动效应和机械效应使传质边界层减薄,导致界面层中 溶质的浓度梯度减少速度比没有超声时大,从而增大传质速率,微扰效应强化了 类黄酮的微孔扩散,界面效应增大了传质表面积,聚能效应和热效应加快了类黄 酮分子扰动,从而整体上能提高提取过程的传质速率和效果,缩短提取时间】 ...分离纯化 ...传统分离纯化方法 柱层析 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或柱载体有硅胶、聚酰胺、氧化铝等。 .硅胶 主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇等。 .聚酰胺 对有机物的吸附属于氢键吸附,吸附强度取决于黄酮类分子中羟基的数目、 位置和溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺柱 层析可用于分离各种类型黄酮类化合物。 .氧化铝 有三种:碱性氧化铝,其中混有碱性成分而带碱性,不适合分离黄酮类化合 物;中性氧化铝是由碱性氧化铝除去碱性成分而得,可用于黄酮类化合物的分离; 酸性氧化铝是氧化铝经稀硝酸或稀盐酸处理得到的产物,适合于酸性成分的柱层 析。 第章文献综述 .葡聚糖凝胶 对于黄酮类化合物的分离,主要用两种型号的凝胶:.、 .。葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是凝胶对黄酮类化合物的 吸附程度取决于游离酚羟基的数目。但分离黄酮苷时,则分子筛的属性起主导作 用。在洗脱时,黄酮苷类大体上是按分子量由大的顺序流出柱体。常用的洗 脱剂有:碱性水溶液,醇及含水醇,其它溶剂如丙酮、甲醇、氯仿。 结晶与重结晶 结晶是纯化黄酮类化合物的一种重要方法,适用于经一定其它方法提取分离 后、杂质含量小于%的产物的进一步纯化。应用结晶法提纯黄酮类化合物的原 理是利用黄酮类与其它杂质在有机溶剂中的溶解度差异及其与温度的依赖关系 不同,使黄酮类从其粗品混合物中分离出来。因此结晶法的关键是溶剂的选择和 结晶条件的确定。 上述方法所使用的设备简单,技术原理易于理解和掌握,是比较经典的纯化 方法。 其它方法 黄酮类化合物的传统分离纯化方法很多,除上述方法外,还有薄层层析、溶 剂萃取、铅盐沉淀、硼酸络合等方法,铅盐沉淀、硼酸络合都是属于化学纯化方 法,由于其成本问题,在一定程度上较难用于工业化大生产。 ....现代分离纯化技术 .....大孑树脂 . 大孔吸附树脂是上世纪年代发展起来的继离子交换树脂后的一类有机高 聚物吸附剂。大孔吸附树脂一般为白色球形颗粒,理化性质稳定,不溶于酸、碱 及有机溶媒,对有机物选择较好,不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影 响。大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料,与以往使用的离子 交换树脂分离原理不同,它本身具有的吸附性是由于产生范德华引力或氢键的结 果,筛选原理则是由于其本身多孔性结构所决定。正因为这些特性,使得有机化 合物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大的简化。 近年来大孔吸附树脂在天然产物化学成份以及植物黄酮类的提取、分离纯化 等方面有了较广泛的应用研究。袁怀波【】等人对.,.,一, .,.,一等种商品化大孔树脂吸附纯化葛根异黄酮的性能进行对 比筛选,发现.型树脂最适合葛根异黄酮的纯化。当洗脱剂乙醇的体积分数 为%,洗脱液流速为 /,浸提浓缩液值为时,采用.大孔吸附树脂 串联柱对葛根异黄酮进行纯化效果最优,得到的产品的收率和纯度都较高。涂宗 第章文献综述 财【等利用.型大孔吸附树脂分离纯化苦槠黄酮,并用液相色谱仪检测了经 过分离纯化的苦槠黄酮,发现黄酮类物质的吸收峰更加明显,杂峰明显减少了, 具有显著的效果。 .....高速逆流色谱 高速逆流色谱衄 ,是由美国 国立卫生院博士研制开发的新型色谱技术,它能在短时间内实现高效分离和 制备,并且可以达到几千个理论塔板数【。与其它传统柱色谱不同的是,高速 逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术。在细管绕成的螺旋 管柱里,互不相溶的两相溶剂能在重力场的作用下形成分段状态。当螺旋管柱在 一离心力场内转动时,会形成很强的两相分割和对流趋势,且这种分割和对流的 过程是连续进行的【。将待分离样品从一端注入高速转动的螺旋管内,连续的 分配传递过程将在管柱里进行,实现连续的液液分配过程。因此,与其他色谱方 法相比,逆流色谱具有以下显著优点: 不用固态支撑体,完全排除了支撑体对样品组分的吸附、污染、变形、 失活等不良影响;能避免不可逆吸附造成的溶质色谱峰拖尾现象,样品回收率高, 特别适用于分离极性物质和具有生物活性的物质; 逆流色谱的分配分离是在螺旋转动运动中完成的,两相溶剂都被剧烈振 动的离心力场依其界面特征甩成极微小的颗粒,样品各组分会在两相微粒的极大 表面上分配,并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效的传递。类似于自动连续的 将萃取过程进行成千上万次【; 逆流色谱不用填料,分离过程不是淋洗或洗脱过程,而是对流穿透过程 】。因而能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗,后续投入低; 对样品预处理要求低,一般只需粗提物,分离时所用溶剂只需化学纯即 可; ’ 设备操作简单,维修方便。 发展的未来趋势是与质谱联用。由于常由于固定相的流 失而导致流出液乳化,用常用光学检测时如紫外检测会发生吸收峰形变宽, 灵 敏度降低等问题【】。与联用则可解决这种乳化现象带来的问题。 等解决了与电子电离质谱蹦,化学电离质谱,快速原子轰击 质谱,热喷雾质谱联用的接口问题,设计了型连接器,发现 与联用并不影响色谱的分离和质谱的分析,从而为的应用提供 一种新型多维分离分析方法。逆流色谱和质谱联用技术能将逆流色谱分离的 多样 性与质谱的高灵敏度检测和结构分析特性良好的结合在一起,广泛的应用于 天然 产物、药物、蛋白质及其他生化物质的分离和分析。 第章文献综述 近年来,高速逆流色谱仪器技术得到不断发展,从最初的单螺旋管逆流色 谱仪到现在的三螺旋管逆流色谱仪,从小制备量到大制备量逆流色谱仪,进 样 量从几十毫克到几十克。高速逆流色谱的快速发展使其在天然产物分离中担当 起越来越重要的分量,展现出广阔的应用前景。 .论文设计思想 ..选题背景 世纪是生命科学的世纪,随着社会进步和人类自我保健意识的提高,人 们对天然产品的需求量越来越大,其中以植物为原料的药品、化妆品、农药等越 来越受到青睐,所涉及的内容从植物药和植物源农药,到特殊油脂、特殊精油、 香料、饮料、天然色素、功能食品等。植物资源的开发利用已显现出巨大的应用 价值和市场潜力,尤其是从天然植物中发现新的天然美白剂,筛选生物活性成分 作为新型的植物源的美白剂,更有不可估量的前景。 香水莲花作为一种纯天然的绿色保健品,备受爱美的人青睐。香水莲花富含 黄酮、多糖等化学成分,其生理活性显著,极具开发利用价值。 ..研究目的与意义 香水莲花的生物活性与其多种活性成分及结构密切相关。目前,有关香水莲 花的报道很少。徐辉研究了香水莲花的多糖及挥发油,其他成分未有深入涉及, 故而有必要对其化学成分及其生物活性进行研究,可以为寻找和筛选新型天 然药 物做一些基础工作,为高效利用和深度开发香水莲花提供借鉴。 ..研究内容及方法 在对睡莲属植物的化学成分和生物活性研究进展进行全面了解的基础上,依 照研究目的,以香水莲花为试材,确定本论文的研究内容和方法: 香水莲花醇提物及其酰化产物的化学成分的提取分离及结构鉴定 .、、等色谱分离手段对香水莲花 采用硅胶、 的化学成分进行分离和纯化。通过、等波谱技术并与文献对 照,鉴定相关化合物的结构。 香水莲花黄酮的提取分离及纯化的工艺研究 香水莲花黄酮的微波提取工艺研究:以黄酮得率为考察指标,采用单因素试 验和正交试验对微波提取香水莲花黄酮的最佳条件进行了研究,确定最佳微 波提 取条件。 采用大孔树脂和高速逆流色谱法精制香水莲花黄酮:选用大孔树脂对 香水莲花黄酮进行富集,洗脱溶剂为乙醇。收集各洗脱流份,进行检测,第章 香水莲花多酚类组分的研究 第章香水莲花多酚类组分的研究 香水莲花化学成分的研究国内文献报道不够详细,为了该植物的进一步开 发利用,对多酚类物质进行了初步研究。本章第一部分将香水莲花醇提浓缩 液依 次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,选取乙酸乙酯部位进行硅胶柱层 析和 .凝胶柱层析,得到了较纯的化合物.,经波谱分析鉴定为没食 子酸。本章第二部分将香水莲花的乙醇提取液浓缩、离心后分为三个部分: 上层 离析出的油状物低级性部位,未进行研究,溶液部分大极性部位,未研究, 底部产生的橙黄色沉淀中极性部位,将中极性部位即沉淀乙酰化处理后 进行了硅胶柱层析,同时应用.凝胶柱层析、重结晶等分离手段对 主要流份进行纯化,得到了较纯的化合物?...,初步鉴定为多羟基黄酮葡 萄糖甙乙酰化物。 .香水莲花提取分离及纯化 ..材料、仪器与试剂 ...材料 香水莲花带雄蕊的干燥花托:浙江省温州市三心美德投资有限公司提供。七 月采摘,剥去萼片和花瓣,贴近花托基部切去花梗,晒干或烘干。经鉴定为 . .。.仪器 回流提取桶: ,自制; /,自制: 真空薄膜浓缩器: 电热鼓风干燥器:.南京实验仪器厂; 离心沉淀机:.上海医用分析仪器厂 超声波清洗仪:.型昆山市超声仪器有限公司色谱柱:. 色谱柱:. 质谱仪:型; 型和 、后型; 核磁共振仪:?弋 高速逆流色谱仪:.半制备型上海同田生化技术有限公司,进 样圈 ,.紫外检测仪,恒流泵,.恒温循环器; 高效液相色谱仪:,四元泵,?分离柱,. ,,光电二极管阵列检测器。 ...试剂 第章香水莲花多酚类组分的研究 乙醇医用级,石油醚,乙酸乙酯,正丁醇,苯,丙酮,甲醇用 为色谱纯,磷酸,均为市售分析纯。 柱层析用硅胶.目,薄层层析用硅胶,青岛海洋化工厂生产。 .,公司生产。 没食子酸标准品:中国生物制品检定所,纯度%。 ..香水莲花醇提物的提取分离及纯化 自制的回流提取桶,加入 %乙醇,回 称取香水莲花埏,装入 流提取两次,每次 ,抽滤,合并滤液,用旋转蒸发器在?下减压浓缩至膏 状。取适量浸膏用甲醇溶解后加蒸馏水制成水悬液,加入适量的氯化钠防止 乳 化,蒸去甲醇,水悬液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,各萃取液浓缩 成浸膏。称取乙酸乙酯部位浸膏粉末. ,甲醇溶解后粗硅胶拌样,用硅胶 柱分离,以氯仿.甲醇梯度洗脱,得... ,氯仿:甲醇:、.. . ,氯仿:甲醇:、.。. ,氯仿:甲醇:、... ,氯仿:甲醇:、... ,氯仿:甲醇:个主要流分。经 薄层层析检测,.和.这两个流分为单一斑点,故选取这两个流份进行进 一步的纯化。.和..组分经过反复.凝胶柱层析洗脱 溶剂为氯仿:甲醇:得针状结晶和.两个较纯的组分。 将.针状结晶和.组分进行高效液相检测。 ..香水莲花醇提物沉淀酰化产物的分离纯化 . ...香水莲花醇提物沉淀的酰化 香水莲花乙醇提取液浓缩至无醇味,加少量的水离心得到不同极性的三个部 位。选取中极性部位即沉淀用石油醚充分洗涤,然后用浓硫酸.醋酐进行乙 酰化。乙酰化的具体步骤为:称取香水莲花醇提物中极性部位 ,用 乙酸酐充分溶解后滴加滴浓硫酸,回流 后,加冰块冷却后抽滤,再加水 洗涤,直至无乙酸味为止。酰化产物干燥后备用。 ...香水莲花醇提物沉淀酰化产物的分离纯化 酰化产物 粗硅胶拌样,硅胶柱分离,以石油醚.乙酸乙酯梯度洗脱, 得.?.石油醚:乙酸乙酯:、.?..,石油醚:乙酸乙酯:、 ..石油醚:乙酸乙酯:、.?一. ,石油醚:乙酸乙酯:、 .?。. ,石油醚:乙酸乙酯:、.?.. ,石油醚:乙酸乙 酯:、.?.石油醚:乙酸乙酯:、.?.乙酸乙酯% .?斑点单一,对其进行了纯化。 个流分。经薄层层析检测, 称取..组分. 用粗硅胶拌样,硅胶柱分离,以苯.丙酮梯度洗脱, 第章香水莲花多酚类组分的研究 得..苯:丙酮:、.?..苯:丙酮:、..?苯:丙酮: 个主要组分。将..和.合并后进行硅胶柱层析苯.乙酸乙酯 :?苯一乙酸乙酯:,主要流分经凝胶柱层析洗脱溶剂 为氯仿:甲醇:得纯度较高的化合物...白色粉末. 图: 加水离心 依次萃取 涤 困 醇 茬 ..............一 硅胶柱层析 硅胶柱层析 一 ?????????。???丫 .研究结果 .. .样品的定性检测 .样品的甲醇溶液滴加.滴溶液,呈蓝黑色,说明样 品中含有酚羟基。第章香水莲花多酚类组分的研究 样品的薄层检测 依据紫外光谱及经验,将.样品与没食子酸标准品点于同一薄层板上,展 开剂分别为氯仿:甲醇:和正丁醇:乙酸:水::,值均相等。.样品与没 食子酸标准品混合点样,薄层板上只有一个斑点,初步证明样品就是没食子 酸。 .样品的高效液相检测 / 高效液相色谱条件:流动相为甲醇:水.%磷酸:;流速为. 柱温为;检测器,检测波长 ;进样量为此。分别将没食子 酸标准品、.样品进行高效液相色谱检测分析。 经高效液相色谱检测,样品的纯度为%。 没食子酸标准品、样品高效液相色谱图和光谱以及二者的图 如下:笙皇重查垄垄兰坠耋塑坌塑堑窒?? ????????????????????????????????????????????????一一一 图.没食子酸标准品的光谱.. 图. 样品的高效液相色谱图 .. 第章香水莲花多酚类组分的研究 . ? ? \ ? ? 一\\。 一 图. 样品的光谱图 .. 图.没食子酸标准品与样品的维图谱比较 ..一 笙三兰重查垄垄兰坠鲞丝坌箜竺窒 ??????????????????????????????????????????一一一 .. .组分的高效液相色谱检测结果 /; 高效液相色谱条件:流动相为甲醇:水.%磷酸:;流速为. 图. .样品的高效液相色谱图.. 图. 样品的高效液相色谱图.. 由图.、图.可看出,.组分比较复杂,量少,其主要成分与样品 第章香水莲花多酚类组分的研究 相同。 .. ...的高效液相色谱检测结果 高效液相色谱条件:流动相为甲醇:水.%磷酸的混合液,梯度洗脱, 甲醇浓度依次为%一 、%. 、%. ;流速为 . /柱温为。;检测器,检测波长 ;进样量为此。 图. .的高效液相色谱图?一 .. ? ? ? 入 ? ? ? ??//\\~ 一 图.?? 的光谱图一? .. 一.第章香水莲花多酚类组分的研究 由图.、图.可看出,出峰时间为. 是黄酮类物质,纯度为%。 .结构鉴定 ..化合物. 浅黄粉末,溶于,不溶于,反应呈蓝黑色,显示化合物 分子中有酚羟基结构。 :,.:. 宽峰示有缔 , 合羟基, 为羧酸特征峰, 和 均为苯环 伸缩谱带, 。为面内弯曲振动, ‘宽峰示.伸缩 振动。 ,,:.,,.,。, 中:.为羰基的羰基信号,.一,..,, ..,,..,根据以上数据的分析,并结合文献【及与标准品的 对照分析,确定该化合物为,,.三羟基苯甲酸,即没食子酸。其结构 式见下图。 化合物的、及红外图谱见附录、附录、附录。 没食子酸标准品红外图谱见附录。 ..化合物?... 白色粉末。反应呈黄绿色,显示样品酰化不完全,含有少量的酚羟基。 :带,,,带,呈黄酮类化合 、 宽峰示有缔合羟基, 物的特征吸收。王:. 为甲基 为羰基特征峰, 为苯环伸缩谱带, 弯曲振动, ‘为.面内弯曲振动。 ,,:低场区.,,.,为 黄酮母核环的氢质子;.出现了六组信号,均为双峰及多重峰,示为糖上 的氢质子,.,:.糖端基质子,初步判定为葡萄糖,依据偶合常 数判定糖的构型为型,.,、.,、.,、.,、 .,分别为糖上的到位的六个质子。由于化合物?.?为乙酰 化产物,故在高场区...,出现了乙酰氧基上的质子信号,.,、 .,、.,为糖上醇羟基乙酰氧基质子,说明糖上应该含有个 第章香水莲花多酚类组分的研究 羟基: .,、.,、.,为黄酮甙元上酚羟基的乙酰氧 基质子,甙元至少含有个酚羟基;?,中低场 区...为化合物...【羟基乙酰化后及甙元的羰基碳信号, ...为甙元母核上碳信号,.为糖端基碳信号,.、.、 .、.、.分别为糖上的位碳信号,...为羟基乙酰 化后的甲基碳信号。由于图谱中有些信号未完全出现,酚羟基位置及糖苷键的取 代位置暂时不能确定,只能大概推测其结构为:含有.个酚羟基黄酮葡萄糖甙 的乙酰化产物。 化合物...的、及红外图谱见附录、附录、附 录。 .讨论 本章较为系统的分离纯化了香水莲花醇提物乙酸乙酯部位及中极性部位沉 淀的酰化产物,由于这两个部位极性偏大,溶剂梯度洗脱过程中很难将其完全 分离,且香水莲花中具体的化学成分未见报道,所以具有一定的盲目性,分离难 度较大,得到的样品量少,成分较杂。由于时间的关系,得到了两个化合物,其 他组分的研究仍在进行,其中一个鉴定为没食子酸,另一个初步判定为含有. 个酚羟基黄酮葡萄糖甙的乙酰化产物,初步探明了香水莲花中含有多酚类的鞣质 和黄酮类物质,为今后的开发应用提供了化学基础。第章香水莲花多酚类组分的研究 .附录化合物一及化合物.。.各类图谱 ?姗加 兰 浸 暑 : 黼叩 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 附录化合物.的谱 第章香水莲花化学成分的研究 瑚,蛳积??湘 黧? 【哼 ..? ?. .型 鑫. 蛳嗍蝴恻蜊四 懒咧嘲忡棚蝴喇蝴四 喇椭呐籼洲惭嗍删喇如舢醐 附录化合物的谱 第章香水莲花化学成分的研究 ,‘’、 : :季 孟 :: : : : 附录化合物的红外图谱搿弘?一’叼 % ? ‘ ‘ ? 附录没食子酸标准品的红外图谱