解脂耶氏酵母杂合启动子的构建

解脂耶氏酵母杂合启动子的构建 第26卷第6期 2OO4年12月 宜春学院(自然科学) JoumalofYichunUniversity(naturalscience) Vo1.26,No.6 Dec.2004 解脂耶氏酵母杂合启动子的构建* 姜琼,谢妤,马立新 (1.宜春学院生物工程研究所,江西宜春336000;2.湖北大学生命科学院,湖北武汉430062) [摘要]目的:构建一系列新的用于解脂耶氏酵母的杂合启动子.方法:采用PCR技术将 pXPR2的一段上游激活序列(UAS一1B)进行了离体串联重复,得到了一系列拷贝数不同的串联 重复体,并将其克隆到了P硒启动子的上游.结果:通过酶切鉴定,确证得到了含有UAS一1B 重复单元数目不等的杂合启动子.结论:本方法实用可行,并构建了一系列杂合启动子.为进一 步构建高表达水平的解脂耶氏酵母表达载体奠定了良好的基础. [关键词]解脂耶氏酵母;杂合启动子;PCR [中图分类号】Q782[文献标识码]A[文章编号]1671—380X(2004)06一OOO4—03 Constructionofhyb~dpromotersofyeastYarrowiali~lytica JIANGQiong,XIEYu,MALi—xin2 (1.InstituteofBioengineering,YichunUniversity,Ywhun336000China; 2.diescienceFaculty,HubeiUniversi0',Wuhan430062China) Abstract:Objective:Toconstructaseriesofhybridpromoters.Methods:AdoptingPCRtech niquestoconstructtandem repeatsoftheUAS—— 1BregionsofpXPR2promoterandincorporatethemintoupstreamoftheminimalpromotere ncom. passingtheTATAboxandATGregionofthepromoterPTEF.Results:restrictionenzymedige stionidentifiedhybridpm. rootersencompassingdifferentrepeatsofUAS一1Bwereconstructedsuccessfully.Conclusion:Themethodisfeasibleand theconstructionofthesehybridpromoterslaidagoodfoundationfortheconstructionofhighe xpressionlevervectorsof yeastYarrowialqgolytica. Keywords:Yarrtno/alipolytica;hybridpromoter;PCR 解脂耶氏酵母是研究的最广泛的非常规酵母之 一 ,曾相继用于工业化规模生产单细胞蛋白,柠檬酸 等【l-2].由于它具有很强的分泌蛋白的能力,因此是 一 种很有潜力的表达异源蛋白的宿主生物.由于强 有力的基因扩增系统的发展[引,逆转录转座子的发 现【,调控型和组成型的强启动子的鉴定[引,近年来 解脂耶氏酵母作为异源蛋白表达宿主的研究进展很 快.迄今已有42个异源蛋白在解脂耶氏酵母中得 到了表达.而且大多数蛋白的表达都能达到毫克/ 升.蛋白质的高水平表达在很大程度上依赖于强的 启动子.现在解脂耶氏酵母中有几个调控型强启动 子用于异源蛋白的表达,例如XPR2,1CL1,POX2和 POT1启动子等.Madzak等构建了一个基于pXPR2 启动子的上游激活序列的串联重复和leu2基本启 动子的杂合启动子L6J,这个杂合启动子(hp4d)只受 环境条件的微弱影响,并且驱动蛋白质的半组成型 表达,显示了很大的优势.杂合启动子hp4d的成功 为我们寻找更多更好的强启动子指出了新的方向. 本文基于此思路,同时在方法上进行了新的尝试,构 建了一系列基于pXPR2的上游激活序列(UAS一 1B)的串联重复和P肿启动子的TATAbox和ATG 的杂合启动子.期望在这些杂合启动子中找到更好 的启动子. 1实验部分 1.1菌株和质粒 大肠杆菌DH5a由本实验室保存,质粒sk由本 实验室保存,质粒T+pXPR2由本实验室构建,质粒 pSKTEF为本实验室构建. 1.2工具酶和试剂 限制性内切酶,碱性磷酸酶,Extaq酶均购自 收稿日期;2004—08—28 *基金项目:国家"863"计划资助项目(2(~AA227011) 作者简介:姜琼(1980一),男,湖北监利人,讲师,硕士,主要研究方向:分子生物学与基 因工程 ? 4? 第6期姜琼,谢妤,马立新:解脂耶氏酵母杂合启动子的构建第26卷 TAKARA公司.DNA凝胶回收试剂盒购自杭州V— gene公司.其他试剂均为国产分析纯. 1.3仪器和设备 Px2多功能PCR仪购自ThermoHybaid公司, Biochimi凝胶成像系统购自UvP公司,超低温冰箱 购自Thermoforma公司. 1.4TEF基本启动子合成及克隆 根据聊启动子(Genebank登陆号AF054508) 的TATAbox和ATG之间的序列两条大部分互 补的寡核苷酸,mpTEF1:5tc cgtccccgaattacctttcctcttcttttctctctctccttgtcaactcacacccgaaa tcgttaagcatttccttctgagtatnngaatcattcaaaatgg3,mpTEF2: 3gttcccatattttctggtggcaggggcttaa gtaagttttaccuaa5.mpTEF1和mpTEF2退火后与用 EcoRI和SalI双酶切的sk质粒连接.转化大肠杆 菌. 1.5pXPR2启动子上游激活序列UAS一1B的引物 设计及PCR扩增 根据pXPR2启动子序列(Genebank登陆号 M17741)一700至一800之间的序列设计两条引物 (图1),上游引物引入XhoI酶切位点ctcgag,下游引 物引入SalI酶切位点gtcgac.引物序列如下:UAB一 1:5atactcgagtgaggtgtctcacaagtgc3UAB一2:5atagtc— gaccggatcgaggtgggcgg3.以质粒T+pXPR2为模板, UAB一1,UAB一2为引物扩增上游激活序列UAS一 1B.扩增方法为:94cI=5rain;94cI=30see,55cI=30see, 72cI=20see;35个循环;72cI=7min. 1.6杂合启动子的构建 UAS一1B的PCR产物回收后用Sa/I和XhoI双 酶切,回收,取3微升自连.以连接物稀释十倍为模 板,UAB一1和UAB一2为引物进行PCR反应.溶液 回收PCR产物后用SalI和XhoI双酶切,回收酶切 产物,与经SalI酶切并用碱性磷酸酶处理的质粒 pSKTEF连接.转化大肠杆菌(见图2). I.7杂合启动子的鉴定 接种转化子,抽提质粒并纯化.挑选质粒大小 大于pSKTEF的,用KpnI和0砒双切鉴定. UAS1UAS2 :799-. 794.790.778.777.771.767.720.713.710.146..37-136-127-121-112.1O9—1O7+1 TCTCACAAGTGCCGTGCAGTCCCGCCCCCAC/TCCCGCCCACC/CGTCTTGG CGCGTCTTGGCGCGTGTFTCGTGACGc,A UAS1B 图1启动子pXPR2的UAS区.远的UAS1和近的UAS2以及用于构建杂合启动 子的片段UAS1B都已指出 【JASIB 厂—] XhoI,I lSail&XhoI 自连 -ISafl/.XhoISat!0ISail 图2杂合启动子的构建图 ? 5? 一 第6期宜春学院(自然科学)第26卷 2结果 2.1陋F基本启动子的克隆 寡核苷酸irlTEF1和mTEF2退火后形成粘性末端 的双链DNA,与用EcoRI和SalI双酶切的sk质粒连 接.转化大肠杆菌,得到数百个转化子. 2.2重组质粒的鉴定 抽提转化子质粒,进行电泳检测和EcoRI及 SalI双酶切鉴定.得到重组质粒pSKTEF(见图3). 2.3pXPR2启动子上游激活序列UAS一1B的PCR 扩增 以质粒T+pXPR2为模板,UAB一1,UAB一2 为引物扩增上游激活序列UAS一1B.得到约100bp 的片段. 2.4构建杂合启动子 UAS一1B的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶回收 后用SalI和XhoI双酶切,回收,最后溶解于TE 图3重组质粒 pSKTEF鉴定图 图4UAS1B 串联电泳图 中.取3微升自连.两小时后电泳检测连接物,呈 现大小间隔为100bp的梯状谱带(见图4).以连 接物稀释十倍为模板,UAB一1和UAB一2为引物 进行PCR反应.电泳结果出现从0.7kb至23kb以 上的连续谱带.溶液回收此PCR产物后用Sa/I和 I双酶切5小时,电泳结果呈现为从100bp至 2kb的连续谱带(见图5).回收酶切产物,与经SalI 酶切并用碱性磷酸酶处理的质粒p$KTEF连接.转 化大肠杆菌.得到转化子. 1.7杂合启动子的鉴定 转化子中选取三个质粒大于pSKTEF的,用 nI和RI双切鉴定.得到插入片段大小不等 的3个重组质粒hyTEF1,hyTEF2,hyTEV3(见图6). 因为UAS一1B中间有SnaBI单酶切位点,所以不同 的重组质粒被SnaBI单切后的大片段大小一致. 3讨论 CatherineM.等构建了基于XPR2启动子的一 段上游激活序列UAS一1B的四次串联重复和LEU 基本启动子的杂合启动子hp4d~.实现了外源蛋白 的高表达.hp4d杂合启动子不仅表达量高,而且具 备有趣的性质:对培养条件敏感以及依赖于生长阶 段的表达.这使得菌体生长和蛋白质表达的阶段部 分分离.有利于蛋白质的表达.最近大量的各种异 源蛋白的生产获得的结果表明,这个启动子的不可 诱导性不是问题,除非要表达高度毒性的蛋白.受 此启发,我们想通过改变上游激活序列UAS—IB 的串联重复次数和不同基本启动子来构建新的杂合 启动子.或可找到活性更强的杂合启动子.在实验 方法上我们也进行了新的尝试,没有采用常规的将 上游激活序列UAS一1B一次一个的插入载体的做 法.而是借助PCR技术一次构建了大量重复次数 不等的UAS一1B串联体,并把它们插入到1EF基 ? 6? 图5多拷贝 UAS1B串联产物 图6重组质粒hyTEF1. hyTEF2,hyTEF3酶切鉴定 本启动子上游,从而得到了一系列的新的杂合启动 子(图2).这些杂合启动子的构建将为进一步构 建高表达水平的解脂耶氏酵母表达载体奠定了良好 的基础. 参考文献: l1JJ.F.T.Spencer'A.L.RagoutdeSpencer'C.Laluce Non—conventionalyeasts[JJ.ApplMicmbiolBiotechnol, 2002,58:147—156. 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[()+(;)+()+()]=6656 例5一张币值为二角的人民币兑换成一分, 二分,五分这三种硬币,有多少种不同的兑换方式? 解:以U记一张分币值的人民币用硬币兑换 的方法的全体, U七:{(l,2,3)Il+2L2+5L3=k,Ll,L2, 为非负整数} 记I—ukl=u,则序列{u}的母函数 (t)=(I+t+t2+t3+…)(I+t2+t4+t6+ … )(I+t+t0+…) = {(I+t)+2(t2+t3)+3(t4+t5)+4(t6 +t7)+…}(I+t5+to+…) 再来看上面的展开式中t加的系数,这时,第一个花 括号内取t0=I,则第二个圆括号内必取t加,其系数 为l;第一个取3,,第二个则必取t,其系数为3, 如此等等,于是U20=I+3+6+8+1I=29,所以有 29种不同的兑换方式. 例6在一个程序设计课程里,每个学生的每 个任务最多可以运行十次.教员发现某个任务共运 行了38次.设有l5名学生,每个学生对这一任务 至少做一次.求观察到的总次数的组合数. 解:先考虑有n个学生的一般情况,并记观察 的运行总数的组合数为u.因为每个学生至多运行 l0次,按题意至少运行1次,所以序列{u}的母函 数是 (f)=(t+t+t+…+t10) = [(t+t2+t3+…)一(t?+t2+t3+…)] =[t(I+t+t2+t3+…)一tn(I+t+t2+t3+ … )] = [(t—tl1)?(I+t+t+t+…)] = (1?.)南: ? 盏_1)? 二(一,)r r=Or!, ? n -1)k.tlOk. r=O f,Hkr 卜 )l】 = 卜).(…+l0, t".的系数是运行总次数为n+r+10k时 n个学生运行次数组合的总个数,本题运行总次数 为38,故有n+r+10k=38,以n=15代入得r+ 1.=23,解得r 一 =2 — 3 , 一 r=l 一 3 , {:主,因此各种组 合总个数是这些k,r值的三组系数的总和,它是 (;+23一)?()一(+23一)?(5)+ (315+3-II5).5806283700 参考文献: [I]柯召,魏万迪.组合论[M].北京:科学出版社, 1981. [2]周振黎,康泰.组合数学[M].重庆:重庆大学出 版社,1986. [3]卢开澄.组合数学算法与分析[M].北京:清华 大学出版社,1983. 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