新乡医学院实验课教案首页

新乡医学院实验课首页 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 生物化学实验 课程名称 实验一 蛋白质的性质实验 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解30 min 操作90min 时间分配 1. 掌握几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法; 课时目标 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3(了解蛋白质变性与沉淀的关系。 常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 授课重点 常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1. 茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调,并说明原因。 3(是否所有氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果,为什么,是否大部分蛋白质呈现思考题 阳性结果,为什么, 4(沉淀、变性之间有什么样的关系,哪些沉淀往往伴随变性, 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 教学手段和基本内容 教学组织 实验一 蛋白质的性质实验 首先介绍有关蛋白质的背景知识 结合理论知识?(蛋白质及氨基酸的呈色反应 介绍引入试验一、目的和要求 内容 1(了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2(了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3(学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 (一)双缩脲反应 1(原理 尿素加热至180?左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境 2+中能与Cu结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中 有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定 量测定。 反应式如下: 幻灯片显示 反应式 主要介绍双 缩尿反应得 原理 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个 —CS—NH，—CH—NH，—CRH—NH，—CH—NH—CHNH—CHOH22222222 或—CHOHCHNH等基团 22 NH NH 22 的物质以及乙二酰二胺(O,C——C,O)等物质也有此反应。NH也干扰此3 2+2+ 反应，因为NH与Cu可生成暗蓝色的络离子Cu(NH)。因此，一切蛋334 白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是 蛋白质或多肽。 2(主要试剂、材料和器材 器材 试管及试管架，滴管，酒精灯。 边演示边介绍试剂 器材 ?尿素 ?10%氢氧化钠溶液 ?1%硫酸铜溶液 ?2%卵清蛋白溶液 3(操作 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿 素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化 钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉 红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加 1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 (二)茚三酮反应 1(原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及 一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪 和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反 应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量 测定中，应严防干扰物存在。 该反应十分灵敏，1?1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是 一种常用的氨基酸定量测定方法。 强调原理 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO、NH和醛，水23反应式 合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个 水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 反应机理如下: 此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件 下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 2(主要试剂、材料和器材 器材 试管及试管架;电磁炉;滤纸。 讲解仪器用法 试剂 ?蛋白质溶液 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清?水=1?9)?0.5%甘氨酸溶液 ?0.1%茚三酮水溶液 ?0.1%茚三酮-乙醇溶液 3(操作 ?取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml 0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫 红色再变蓝。 ?在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴 0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 (三)黄色反应 1(原理 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄 色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。反应式如下: 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易 硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 2(主要试剂、材料和器材 器材 试管及试管架;酒精灯。 试剂 ?鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1?20混匀，然后用6层纱布过滤。 ?大豆提取液 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。 ?头发 ?指甲 ?0.5%苯酚溶液 ?浓硝酸 ?0.3%色氨酸溶液 ?0.3%酪氨酸溶液 ?10%氢氧化钠溶液 3(操作 向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反 应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢 氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。 管 号 1 2 3 4 5 6 7 强调试管编号 鸡蛋大豆 0.3% 指甲 头发 0.5% 0.3% 材 料 清 提取酪氨 苯酚 色氨酸 (滴) 溶液 液 酸 少许 少许 4 4 4 4 4 浓硝酸/2 4 40 40 4 4 4 (滴) 现象 ?(蛋白质的沉淀反应 一、实验目的 1(加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 与理论知识相2(了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 联系 3(了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲 水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而 沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 (1)可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除 去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天 举例介绍 然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙酮) 短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 (2)不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质 常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白 质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不 析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已 变性。 三、主要试剂、材料和器材 器材 试管;滴管。 试剂 1. 蛋白质溶液 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液(新鲜鸡蛋清?水=1?9) 2. pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液 3. 3%硝酸银溶液 4. 5%三氯乙酸溶液 5. 95%乙醇 6. 饱和硫酸铵溶液 7. 硫酸铵结晶粉末 -1-1 8. 0.1mol?L盐酸溶液 9. 0.1mol?L氢氧化钠溶液 -1-110. 0.05mol?L碳酸钠溶液 11. 0.1mol?L醋酸溶液 12. 甲基红溶液 13. 2%氯化钡溶液 四、操作步骤 1(蛋白质的盐析 加5%卵清蛋白溶液5ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后 静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否 溶解，为什么,将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为 止，此时析出的沉淀为清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 2(重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合 物。 取1支试管，加入蛋白质溶液2ml，再加3%硝酸银溶液1~2滴，振荡试 管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是 否溶解,为什么, 3(某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋白质溶液2ml，再加1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试 管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察 沉淀是否溶解。 4(有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇。混匀，观察 沉淀的生成。 5(乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂: 试剂0.1 5%卵清 0.1 -1(ml) mol?L 95%乙pH4.7 -1 蛋白溶mol?L 醇 缓冲溶液 氢氧化钠 液 盐酸溶液 管号 溶 液 1 1 — — 1 1 2 1 1 — 1 — 3 1 — 1 1 — 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8ml，然后 -1-1在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol?L醋酸溶液及0.05mol?L -1碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol?L 盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。 五、思考与作业 1(如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此时可对水布置思考题 解作用进行的程度作出什么结论, 2(茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调,并说明原因。 3(是否所有氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果,为什么,是否大部分蛋 白质呈现阳性结果,为什么, 4(沉淀、变性之间有什么样的关系,哪些沉淀往往伴随变性, 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 生物化学实验 课程名称 实验二 氨基酸薄层层析分离 授课题目 2005级本科生物技术专业 授课对象 课时分配:讲解原理、操作步骤、注意事项等35-45分钟，学生操作75-85分 时间分配 钟，共计3个学时。 1. 学习薄层层析操作技术，了解吸附薄层层析的一般原理。 课时目标 2. 初步掌握吸附薄层层析法分离、鉴定氨基酸的方法。 1. 薄层层析的一般原理 授课重点 2. 薄层层析操作技术 薄层层析操作技术 授课难点 演示与示教 授课形式 讲解与演示 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 本实验应注意的问题 思考题 教研室主任教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 教学手段和 基本内容 教学组织 先交代一下这实验二 氨基酸薄层层析分离 次实验的内一、目的和要求 容，然后引入1. 学习薄层层析操作技术，了解吸附薄层层析的一般原理。 正体。 介绍这次实验2. 初步掌握吸附薄层层析法分离、鉴定氨基酸的方法。 的目的，大约二、原理 用5分钟 氨基酸薄层层析分离属于吸附层析。以硅胶G为吸附剂，加水调成糊 状后，在玻璃板上均匀铺成做固定相。将氨基酸样品点于薄层板一端，展 开剂借助毛细作用将样品展开。由于被分离的氨基酸结构不同，硅胶对其 介绍本实验的吸附力也不同。吸附力大的吸附得较牢，不易被解吸，随展开剂流动得速原理 度慢;吸附力小得容易解吸，移动速度快。层析过程中，各种氨基酸样品大约用10分钟 在吸附剂和展开剂之间经过反复得吸附与解吸，最终达到分离得目的。 三、主要仪器、材料和试剂 器材 玻璃板、层析缸、电吹风、毛细管、恒温干燥箱、喷雾器 简单介绍试剂试剂 和器材 硅胶、氨基酸样品溶液(0.01mol/L，以90,的异丙醇溶液做溶剂)、大约用1分钟 展开剂(按4:1:1体积混合正丁醇、冰乙酸及水。临用时再配置)、0.5,茚 三酮溶液(茚三酮0.5g溶于无水丙酮至100ml)。 四、操作步骤 1. 制板 绍实验步骤 硅胶15g溶于45ml蒸馏水，调成糊状，倒在玻璃板上铺成薄层(2块)，大约用20分钟 室温干燥后，放105?恒温干燥箱活化1小时以上，取出晾凉备用。 制板 2. 点样 (做实验前提前以毛细管分别吸取氨基酸及其混合液，距玻板一端3cm处，每间隔2cm做好) 点一样品。待点样处干后，再在原位置重复点一次。 3. 展层 演示点样 将薄板点样端向下，倾斜地放入约有1cm高展层剂地层析缸中，使薄 o板与缸底平面呈30角，注意勿使试剂淹没层析点。盖严层析缸进行层析。 演示展层 当展开剂到达玻璃板全长约3/4处时，取出薄层板，记下展开剂前沿位置， 用电吹风吹干或烘干。 4. 显色 显色 将0.5,茚三酮-丙酮溶液用喷雾器均匀地喷洒于薄层板上，并将薄板 置105?恒温干燥箱内烘数分钟，至板上出现粉红色斑点。 如何计算实验五、结果与计算 结果 大约用5分钟分别测量并计算各种氨基酸地R值，与混合液中分离的各种氨基酸的f的时间 R值比较，分析混合氨基酸的分离结果。 f 原点至斑点中心的距离R, 交代本实验应f原点至展开剂前沿的距离 注意的问题 六、注意问题 要求学生写实 验 硅胶板干后才能活化，层析时缸盖要盖严密。 七、思考题 1. 吸附薄层层析的一般原理是什么, 下面让学生操 作实验 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:张秀华 讲师 生物化学实验 课程名称 实验三 考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量 授课题目 2007级生物技术专业本科生 授课对象 课时分配:讲解原理、操作步骤、注意事项等35-45分钟，学生操作75-85分 时间分配 钟，共计3个学时。 1.测定方法与优点2.测定原理 课时目标 测定原理 授课重点 测定方法与曲线的制备 授课难点 演示与示教 授课形式 讲解与演示 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1.为什么样品测量需在1小时内完成, 思考题 教研室主任教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:张秀华 讲师 教学手段和 基本内容 教学组织 实验三 斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量 一、目的和要求 多媒体教学， 1. 掌握考马斯亮蓝G-250法测蛋白质浓度的原理; 启发式教学， 传统讲授与2.了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。 演示 二、基本原理 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质 的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农产品品质分析、食品营养价值比较、 详细介绍原生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质的定 理 量方法。 考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的方法，简便快捷、灵敏度好， 是一种较好的常用方法。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，与 蛋白质结合呈蓝色，且最大吸收波长从465nm转变为595nm。蛋白质溶液在一定浓 度范围内，与595nm的光密度值成正比，可用于蛋白质的比色定量。 三、主要仪器、材料和试剂 器材 分析天平、试管、吸管、 研钵、漏斗、离心管、容量瓶、离心机、722分光光 度计。 简单介绍器 材并演示用试剂 法 1(蛋白质标准液(100μg/ml):称取小牛血清白蛋白10mg加生理盐水至100ml， 制成100μg/ml标准液。 2(考马斯亮蓝G-250:考马斯亮蓝G-250 100mg，加95%乙醇50ml，加85%(W/V) HPO100ml，加蒸馏水稀释至1000ml，置棕色瓶过夜，用二层滤纸过滤，室温下34 可放置一个月。 四、操作步骤 1. 标准曲线制作取6支试管，编号，按下表操作: 管号 1 2 3 4 5 6 蛋白质标准(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 演示 考马斯亮蓝G-250试剂( ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(μg) 0 0 40 60 80 100 盖上盖子，摇匀。放置2分钟后在595nm波长下比色测定(比色应在1小时内 完成)。以牛血清蛋白含量(μg)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 2. 样品中蛋白质含量的测定 (1)准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在研钵中 充分研磨，平衡离心(4000rpm,10min),将上清液倒入容量瓶，再向残渣中倒入2ml 蒸馏水，悬浮后再离心(4000rpm,10min)，合并上清液，定容至10ml。 (2)取另一只具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml 考马斯亮兰G-250试剂，充分混匀。放置2分钟后，以标准曲线1号试管做参比， 在595nm波长下比色，记录吸光度。 五、结果处理 根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查的相应的蛋白质的含量(μg)， 按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g鲜重)= 公式来源 六、注意事项 比色应在出现蓝色2分钟-1小时内完成。 七、思考题 1. G-250法测蛋白质浓度的原理及本实验操作中的注意事项是什么, 强调 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 生物化学实验 课程名称 实验四 素薄膜电泳分离人血清蛋白质 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解30 min 操作90min 时间分配 掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离人血清蛋白质的基本原理及操作技术 课时目标 1.电泳原理2.醋酸纤维素膜电泳技术 授课重点 操作步骤 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1(电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质,各谱带为何种成份,请分析原因。 思考题 2(电泳时，点样端置于电场的正极还是负极，为什么, 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 课教师姓名及职称:闫清华 助教 教学手段和 基本内容 教学组织 实验四 素薄膜电泳分离人血清蛋白质 一、目的和要求 多媒体教学，启掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离人血清蛋白质的基本原理及操作技术 发式教学，传统二、原理 讲授与演示 带电粒子在电场中向着与其电性相反方向移动的现象称为电泳。蛋白质为两 性电解质，在不同pH条件下，其带电情况不同。在等电点时，蛋白质为兼性离 子，其实效电荷为零，在电场中不发生泳动;蛋白质分子在pH小于其等电点的 详细介绍原理 溶液中，呈碱式解离，带正电荷，在电场中向负极泳动;蛋白质分子在pH大于 其等电点的溶液中，呈酸式解离，带负电荷，在电场中向正极泳动。泳动速度除 与电场强度和溶液性质有关外，主要决定于分子颗粒的电荷量以及分子的大小与 形状。电荷较多、分子较小的球状蛋白质泳动较快。 醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。与纸 上电泳相似，是在其基础上发展起来的。该电泳技术具有比纸电泳电渗小、分离 速度快、样品用量小(可少于10微升)、而分辨率高和分离清晰等优点。因此， 从1956年Kohn首先应用此法以来，纸上电泳已逐渐被取代。醋酸纤维素薄膜电 泳的操作方法除比琼脂电泳、淀粉胶电泳和聚丙烯酰铵凝胶电泳简便外，还有一 个显著优点，即染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便 于保存和定量分析。 醋酸纤维素薄膜可用于一般血清蛋白电泳、脂蛋白电泳、同工酶电泳、甲胎 球蛋白电泳(AFP)、血红蛋白电泳以及免疫电泳等。 本实验以醋酸纤维素薄膜作为支持物，于浸有缓冲液的薄膜一端加微量血 清，膜两端连接于缓冲液。所用缓冲液的pH为8.6，大于血清中各种蛋白质的等 电点(见注)。因此，各种蛋白质皆带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因泳 动速度不同而被分离。依次为清蛋白A、α 、α、β和γ-球蛋白，将蛋白质染色 12 后，可按染色区带位置进行定性观察，也可对各条色带进行定量测定。 三、主要仪器、材料和试剂 器材 电泳仪、醋酸纤维素薄膜(2×8cm)、载玻片、点样器(市售或自制)、培养皿 (染色及漂洗用)、粗滤纸、镊子、铅笔、尺子等 简单介绍器材试剂 并演示用法 1(巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.06):巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g 加蒸馏水数百毫升，加热溶解后再补加蒸馏水至1000ml，混匀。 2(染色液:氨基黑10B 0.5g，溶于甲醇50ml中，再加冰醋酸10ml，蒸馏水 40ml混匀。 3(漂洗液:甲醇(或95%乙醇)45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml混 匀。 4(洗脱液:0.4N NaOH 溶液 5(透明液:95%乙醇20ml，冰醋酸5ml混匀。 四、操作步骤 1. 准备和泡膜:电泳槽内放适量的缓冲液，使两侧液面达到平衡后。在电泳 槽的两侧的支持板上分别用四层滤纸(或纱布)搭桥，即使其一端塔到支持板上， 另一端浸入缓冲液中。在醋酸纤维薄膜(2×8cm)的无光泽面距一端2cm处，， 用铅笔画一横线(与此端平行)，作为准备点样的位置，称为点样线或者是起点详细介绍步骤 线。把膜放进pH8.6的巴比妥缓冲溶液中浸泡20min使膜完全浸透。 2. 点样:把浸透缓冲液的醋酸纤维素膜取出，夹到滤纸中，轻抚使吸去多余 的缓冲液，使膜的无光泽面向上，用盖玻片沾取微量样品[血清]均匀地涂于盖玻 片的一端(把玻片竖直轻贴到膜的点样线上)，使样品吸入膜内。注意应使点样 线成为粗细一致的直线状。 3. 电泳:把膜放进电泳槽内，注意要把膜的点样面即无光泽面向下，点样端 靠近阴极侧，把膜的两端紧贴到内侧支持板上搭桥的滤纸或沙布上，把膜摆平拉 直，盖好电泳槽盖。检查电泳槽电极的连接正确无误后通电，调节电流按总膜宽 计算，每cm宽给电流0.4-0.6 mA,通电时间 45,60分钟。 4. 染色:关闭电源后立即将膜取出，放入染色液中浸染5,10分钟，然后移 放漂洗液中漂洗数次，至蛋白条带清晰，本底无色为止，取出薄膜用滤纸吸干。 5. 定量:把漂洗干净的膜夹在滤纸中吸干，剪下各蛋白区带及一段平均大小 的空白区，分别依次放入试管中，标清管号，向清蛋白管加0.4N NaOH 10ml，其 余各管加0.4N NaOH 5ml，轻轻振摇，使着色完全洗脱于溶液中，用620nm波长 比色，记取各管光密度值。然后计算各组分相对百分含量。计算方法如下: 设测得各管光密度值为D 、D、D 、D、 D，则光密度值总和DT=2D Aα1α2βγA +D+D+D+D。 α1α2βγ D,12DA，，其余类推，可分别求出球蛋白%,，1001清蛋白%,，100, DTDT 各蛋白所占总蛋白的百分数。 另外，如用光密度计扫描，需要先使膜透明化，可把染色后干燥的薄膜放入 透明液中10,20分钟，取出放到玻璃板上凉干，得到透明薄膜，可用扫描光度 计描记出电泳曲线，亦可据此计算出各蛋白组分的百分含量。 [注] 1. 血清蛋白各组分的等电点、分子量及其在正常血清中的百分含量如下表: 等电点 分子量 占总蛋白的% 清蛋白 4.64 69，000 57,72 α球蛋白 5.06 200，000 2,5 1 α球蛋白 5.06 300，000 4,9 2 β球蛋白 5.12 90，000,150，000 6.5,12 γ球蛋白 6.85,7.3 156，000,950，000 12,20 2. 血清蛋白电泳有一定的临床意义。例如肝硬化时清蛋白明显降底，而γ球 蛋白可增高2倍;肾病综合症和慢性肾小球肾炎可见到清蛋白降低，ɑ和β球蛋 白增高。从电泳谱上亦可查出某些异常，例如多发性骨髓瘤病人血清，有时在β 与γ球蛋白之间出现巨球蛋白;原发性肝癌病人血清在清蛋白与α球蛋白之间可1 见到甲胎蛋白。 五、思考与作业 1(电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质,各谱带为何种成份,请分析原 因。 布置作业 2(电泳时，点样端置于电场的正极还是负极，为什么, 新乡医学院教案首页 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 生物化学实验 课程名称 实验五 温度、pH、激活剂和抑制剂对酶活性的影响 授课题目 2005级本科生物技术专业 授课对象 讲解原理、步骤等约30分钟，学生操作约90分钟，共计3学时 时间分配 1.验证温度、pH、激活剂和抑制剂对酶活性的影响 课时目标 2.掌握测定酶活性的基本方法。 1..影响酶活力的因素 授课重点 2.实验操作步骤 实验操作步骤 授课难点 演示与示教 授课形式 讲解与演示 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1.唾液淀粉酶的最适温度、最适pH分别是多少, 2.唾液淀粉酶的激活剂和抑制剂分别是什么, 思考题 3.为何每次反应总是取2号管的反应液与碘反应, 4.当反应过快或过慢时应如何处理, 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 教学手段和 基本内容 教学组织 实验五 温度、pH、激活剂和抑制剂对酶活性的影响 先交代一下这一、目的和要求 次实验的内 1.验证温度、pH、激活剂和抑制剂对酶活性的影响 容，然后引入 正体。 2.掌握测定酶活性的基本方法。 介绍这次实验二、原理 的目的，大约 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使用5分钟 酶失去活性。此外，温度、pH、激活剂和抑制剂对酶的活性均有显著影响。 酶的活性通常是通过测定酶所作用的底物在作用前后的变化来研究 介绍本实验的的。本实验用唾液淀粉酶作用的底物-淀粉，被唾液淀粉酶分解成糊精、麦原理 芽糖等产物的变化来观察该酶在各种环境(温度、pH、激活剂和抑制剂等)大约用10分钟 条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化，可以借遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝 色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘呈蓝、紫、红等不同的颜色;最小 的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 简单介绍试剂三、主要仪器、材料和试剂 和器材 器材 大约用1分钟 电热恒温水浴锅、电炉、比色盘、吸管、试管、漏斗、烧杯等。 试剂 0.5,淀粉溶液、碘化钾-碘溶液、1,CuSO溶液、0.5,NaCl溶液、4 pH5缓冲液、pH6.6缓冲液、pH8缓冲液。 四、操作步骤 介绍实验步骤 (一)制备唾液淀粉酶 大约用20分钟 每人用自来水漱口3次，然后取20ml蒸馏水含于口中，半分钟后吐入制备唾液淀粉烧杯内，纱布过滤，取此酶液10ml，放入小烧杯稀释至20ml，以此稀释酶 唾液作如下实验。 (二)温度对酶活性的影响 1. 取3支试管，编号后按下表操作 温度对酶活性 的影响 演示操作步骤 试管号 0.5,淀粉酶 稀释唾液 温度 1 5ml 1ml 0?水浴 2 5ml 1ml 37?水浴 3 5ml 1ml 沸水浴 2. 各管加入0.5,淀粉溶液后，放入各自温度中水浴，待管内温度一 致时，3支试管同时迅速加入稀释唾液，摇匀及时放回水浴中。 3. 在比色盘中，各孔中置碘液2滴，每隔1分钟从2号管中取反应液 1滴与比色盘中的碘液混合，观察颜色变化。 4. 待第二管反应液遇碘不发生颜色变化(即只有碘液的颜色)时，从 水浴中取出各管，向管中加入1-2滴碘液，摇匀后，观察各管颜色，说明 温度对酶活性的影响。 (三)pH对酶活性的影响 1. 取3支试管，编号后按下表操作: pH对酶活性的稀释唾试管号 0.5,淀粉酶 pH5 pH6.6 pH8 影响 液 演示操作步骤 1 2ml 3ml 0 0 1ml 2 2ml 0 3ml 0 1ml 3 2ml 0 0 3 ml 1ml 2. 将以上3支试管摇匀，放入37?水浴中保温。 每隔1分钟从2号管中取1滴反应液与碘液混合观察，待遇碘不发生 颜色变化时，向各管中加入碘液1-2滴，充分混匀，观察并记录各管颜色， 解释pH对酶活性的影响。 (四)激活剂和抑制剂对酶活性的影响 1. 取3支试管，编号后按下表操作: 试管0.5,淀粉1,CuSO溶0.5,NaCl溶蒸馏稀释唾4 号 酶 液 液 水 液 激活剂和抑制1 2ml 1ml 0 0 1ml 剂对酶活性的2 2ml 0 1ml 0 1ml 影响 3 2ml 0 0 1ml 1ml 2. 将以上3支试管摇匀，放入37?水浴中，每隔1-2分钟在比色盘上 用碘液检查2号管，待碘液不变色时，再向各管内加入碘液1-2滴，观察、 布置思考题 记录结果，并解释原因。 要求学生写实五、思考与作业 验报告 1.唾液淀粉酶的最适温度、最适pH分别是多少, 2.唾液淀粉酶的激活剂和抑制剂分别是什么, 下面让学生操 作实验 新乡医学院教案首页 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 生物化学实验 课程名称 实验六 淀粉酶活力的测定 授课题目 2005级本科生物技术专业 授课对象 实验原理和实验步骤等的集中讲解约40分钟，学生操作和辅导约120分钟， 时间分配 共计4个学时 通过本实验，学习酶活力测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用 课时目标 淀粉酶测定的原理 授课重点 测定淀粉酶的实验步骤 淀粉酶测定的原理 授课难点 演示与示教 授课形式 讲解与演示 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 本实验应注意的问题 思考题 教研室主任教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 教学手段和 基本内容 教学组织 介绍本实验的实验六 淀粉酶活力的测定 目的 一、目的 约5分钟的时 间 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1,6糖苷键连结的高分子多糖，是 人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本 原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业 上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟 期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小 麦种子中淀粉酶活动的结果。因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用 研究的意义。通过本实验，学习酶活力测定的一般方法，巩固并熟练分光 光度计的使用。 二、原理 淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们 广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。 详细介绍本实植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶。 验的原理 α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，约15分钟的时 2+间 单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca能使α -淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6键 时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基 ,2+ 酶，不需要Ca及Cl等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它 不耐热但较耐酸，70?保温15min可使其钝化。 通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定(α+β)淀 粉酶总活力，然后在70?加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活 力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。 淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸 的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样 品在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小。 三、仪器、试剂和材料 仪器 (1)电子顶载天平 (2)研钵 (3)容量瓶 100ml 2个 (4)具塞刻度试管 25m1 15支 (5)试管 8支 (6)吸管 lml 3支， 2ml 12支，5ml 1支 (7)离心机 (8)离心管 (9)恒温水浴 (10)分光光度计 试剂 仪器和试剂 (1)1,淀粉溶液 (2)0.4 mol,L氢氧化钠 约1分钟 (3)pH5.6柠檬酸缓冲液 称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000ml， 为A液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000ml，为B液。取A液 13.7ml与B液26.3ml混匀，即为pH5.6之缓冲液。 (4)3,5-二硝基水杨酸 精确称取1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20ml lmol ,L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸 馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，防止CO进入。 2 (5)麦芽糖标准液(1mg,ml) 称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸馏水， 定容至100ml。 材料 萌发3天的小麦芽。 四、操作步骤 1.酶液提取 称取2g萌发3天的小麦种子(芽长1 cm左右)，置研钵中加少量石英 砂和2ml左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100ml容量瓶中，用蒸馏水 定容至100ml。每隔数分钟振荡1次，提取20min。3000 r/min离心10min， 转出上清液备用。 操作步骤及注 意事项 2.α-淀粉酶活力测定 约15分钟 (1)取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。 (2)于每管中各加酶液lml，在70??0.5?恒温水浴中准确加热15min， 钝化β-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。 (3)在对照管中加入4ml 0.4mol,l 氢氧化钠。 (4)在4支试管中各加入lml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5)将4支试管置另一个40??0.5?恒温水浴中保温15min，再向各管 分别加入40?下预热的1,淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40?恒温水浴 准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4m1 0.4mol,L 氢氧化钠， 终止酶活动，准备测糖。 3.淀粉酶总活力测定 取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100ml，为稀释酶液。另取4支试管编 号，2支为对照，2支为测定管。然后加入稀释之酶液1ml。在对照管中加 入4ml 0.4mol,L氢氧化钠。4支试管中各加1ml pH5.6之柠檬酸缓冲液。 以下步骤重复α-淀粉酶测定第(5)步的操作，同样准备测糖。 4.麦芽糖的测定 (1)标准曲线的制作 取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖 标准液(1mg,m1)0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0 m1，然后用吸管向各管 加蒸馏水使溶液达2.0ml，再各加3,5-二硝基水杨酸试剂2.0ml，置沸水浴 中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml。混匀后用分光光度计在 520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量 (mg)为横坐标，绘制标准曲线。 (2)样品的测定 取步骤2，3中酶作用后的各管溶液2ml，分别放入相 应的8支25ml具塞刻度试管中，各加入2ml 3,5-二硝基水杨酸试剂。以下 操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量， 最后进行结果计算。 五、结果处理 A,A，V，，0Tα-淀粉酶活力(mg麦芽糖/g鲜重?5min), W，VU结果处理 约5分钟 B,B，V，，0T淀粉酶总活力(mg麦芽糖,g鲜重?5min), W，VU 式中 A为α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖(mg); A为α-淀粉酶的对照管中麦芽糖量(mg); 0 B为(α+β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖(mg); 为(α+β)淀粉酶的对照管中麦芽糖(mg); B0 步骤作业，然后让学生独立操作 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 生物化学实验 课程名称 实验七 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解20 min 操作100min 时间分配 1. 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法 课时目标 鉴定核酸组分的方法 授课重点 鉴定核酸组分的方法 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1(用酸水解RNA的产物是什么,为什么不检查嘧啶碱基, 思考题 2(在提取RNA的过程中，为什么在沸水浴上加热30min,RNA会被破坏吗, 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 教学手段和基本内容 教学组织 实验七 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的和要求 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、原理 先介绍有关核 糖核酸的有关 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸 理论知识 性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水 解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝; 核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色，脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色 化合物，而核糖无此反应; 嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 三、主要仪器、材料和试剂 器材 1(研钵 2(150ml锥形瓶 3(水浴锅 4(量筒 5(布氏漏斗及抽 滤瓶 6(吸管 7(滴管 8(试管及试管架 9(烧杯 10(离心机 11(漏 斗 12(酵母粉 13(石英砂 试剂 边演示边讲 解 1(0.04mol,L氢氧化钠溶液 ; 2(酸性乙醇溶液 300ml;将3ml浓盐酸加入300ml乙醇中。 3(95,乙醇; 4(乙醚; 5(1.5mol,L硫酸溶液; 6(浓氨水; 7(0.1mol,L硝酸银溶液; 8(氯化铁浓盐酸溶液;将2ml l0,三氯化铁溶液(用FeCl?6HO配制)加32 入到400ml浓盐酸中; 9(苔黑酚乙醇溶液;溶解6g苔黑酚于100ml 95,乙醇中(可在冰箱中保 存1 个月)。 10(定磷试剂; (1)17,硫酸溶液(1.5mol/L的硫酸) : 将17ml浓硫酸(比重1.89)缓缓加 入到 83ml水中。 (2)2.5,钼酸铵溶液: 将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 (3)10,抗坏血酸溶液: 10g抗坏血酸溶于100ml水中，贮棕色瓶保存。 溶 液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。 17,硫酸溶液:2.5,钼酸铵溶液:10,抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2(V,V)。配 好后 试剂应呈黄绿色或黄色，如呈棕黄色或深绿色或蓝色应弃去。 四、操作步骤 1(RNA的提取 (1)将1g酵母悬浮于2ml 0.04 mol,L氢氧化钠溶液中，加少许石英砂 并在研钵中充分研磨均匀(至少15min); (2)将匀浆液转移至10ml离心管中，再用6ml 0.04 mol,L氢氧化钠溶注意介绍步 骤 液分两次洗涤研钵，洗涤液一并倒入离心管中，在沸水浴上加热30分钟后， 冷却。配平离心(3 000r,min)15分钟; (3)将上清液缓缓倾人盛有7ml酸性乙醇溶液的另一10ml离心管中。 注意要缓缓倾人; (4)再平衡离心(3000r,min)3分钟，弃去上清液; (5)用95,乙醇5ml洗涤沉淀、离心(3000r,min)3分钟;即得RNA粗 制品。如欲得RNA粉末，可再用乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移 至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中很快干燥。 2(RNA成分的鉴定 在沉淀(本实验不用乙醚洗涤干燥)中，加入1.5 mol,L硫酸溶液6ml，强调 在沸水浴中加热至少10分钟(太短后面实验就会失败)制成水解液并进行组 分的鉴定。 (1)嘌呤碱: 在1支干净试管内加入约1ml 0.1 mol,L硝酸银溶液，再 逐滴加入氨水至沉淀消失，然后加入水解液1ml放置片刻，观察有无白色嘌 呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖: 取1支试管加人水解液1ml、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔 黑酚乙醇溶液0.2ml。用木夹夹好后放沸水浴中3-5分钟。注意溶液是否变成 绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸: 取1支试管，加入水解液1ml和定磷试剂Iml。在水浴中加 热，观察溶液颜色变化，溶液变蓝色，说明磷酸的存在。 五、思考题 1(用酸水解RNA的产物是什么,为什么不检查嘧啶碱基, 2(在提取RNA的过程中，为什么在沸水浴上加热30min,RNA会被破布置思考题 坏吗, 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 生物化学实验 课程名称 实验八 抗坏血酸含量的测定 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解30 min 操作90min 时间分配 1.熟悉碱式滴定管的使用; 课时目标 2.掌握用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定植物材料中抗坏血酸含量的原理与方法。 2,6-二氯酚靛酚滴定法测定植物材料中抗坏血酸含量的方法 授课重点 2,6-二氯酚靛酚滴定法测定植物材料中抗坏血酸含量的原理 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1.该法测定抗坏血酸有何不足, 2.用2%草酸提取样品的目的是什么, 思考题 教研室主任教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 教学手段和基本内容 教学组织 实验八 抗坏血酸含量的测定 首先介绍有关维生素C的背景知识: 维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。 结合实际介绍新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为引入试验内容 丰富。 测定维生素C常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法和高效液 相色谱法等。 一、实验目的: (1)熟悉碱式滴定管的使用; (2)掌握用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定植物材料中抗坏血酸含量的原理与方 法。 二、实验用品和实验材料 新鲜水果(蔬菜)、组织捣碎机 、天平、组织捣碎机、容量瓶(50mL)、 幻灯片 刻度吸管(5mL，10mL)、锥形瓶(100mL)、碱式滴定管(10mL)、2,草酸、主要介绍碱式 滴定管的使用1,草酸、标准抗坏血酸溶液(0.1mg/mL) 、0.05,的2,6-二氯酚靛酚溶液 。 方法 碱式滴定管的使用方法是: 边演示边讲解 (1)试漏。给碱式滴定管装满水后夹在滴定管架上静量1,2分钟。若有漏 水应更换橡皮管或管内玻璃珠，直至不漏水且能灵活控制液滴为止。 (2)滴定管内装入标准溶液后，要将尖嘴内的气泡排出。方法是:把橡皮管 向上弯曲，出口上斜，挤捏玻璃珠，使溶液从尖嘴快速喷出，气泡即可随之 排掉。 (3)进行滴定操作时，用左手的拇指和食指捏住玻璃珠靠上部位，向手心方 向捏挤橡皮管，使其与玻璃珠之间形成一条缝隙，溶液即可流出。 三、实验原理 O 2,6-二氯酚靛酚是一种染料，在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。 HOON O抗坏血酸具有强还原性，能使2,6-二氯酚靛酚还原褪色，其反应如下:ClHO幻灯片 C图示反应式介H-O+绍原理 COHO(蓝 色)-+H ClCOH2HO Cl抗坏血酸OC O OOHHONCH ClH HCH2,6-二氯酚靛酚Cl+ HO(红 色)还原型2,6-二氯酚靛酚OHON (无 色)OH2脱氢抗坏血酸 CCl C当用2,6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，滴下的2,6-二氯酚 C 靛酚被还原成无色;当溶液中的抗坏血酸全部被氧化成脱氢抗坏血酸时，滴 C 入的2,6-二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。因此用这种染料滴定抗坏血酸至 CH 溶液呈淡红色即为滴定终点，根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏CH 血酸的含量。 四、操作步骤 1(2,6-二氯酚靛酚溶液的标定:准确吸取4.0mL抗坏血酸标 准液(含 0.4mg抗坏血酸)于100mL锥形瓶中，加16mL 1,草酸溶液，用2,6-二氯酚 靛酚滴至淡红色(15S内不褪色即为终点)。记录所用染料溶液的体积(mL)， 计算出1mL染料溶液所能氧化抗坏血酸的量(mg)(记作T)。 2(样品滴定:准确吸取样品提取液(上清液或滤液)两份，每份20.0mL， 分别放入两个100mL锥形瓶中，按上面的操作进行滴定并记录所用染料溶液 体体积(mL)。 五、结果计算 取两份样品滴定所用染料体积平均值，代入下式计算100g样品中还原型 抗坏血酸的含量: 解释每个字母抗坏血酸含量(mg/100 g样品)=V×T×G×A×100W× 代表含义 G1×A1式中:V —— 滴定样品提取液消耗染料平均值(mL) T —— 每mL染料所能氧化抗坏血酸mg数 G —— 匀浆总重量(g) G1 —— 制备提取液取用匀浆重量(g) A —— 样品提取液定容体积(mL) A1 —— 滴定时吸取样品提取液体积(mL) W —— 样品重量(g) 六、注意事项 强调 1.样品提取液定容时若泡沫过多，可加几滴辛醇或丁醇消泡。 2.市售2,6-二氯酚靛酚质量不一，以标定0.4mg抗坏血酸消耗2mL左右的染料为宜，可根据标定结果调整染料溶液浓度。 3.样品的提取液制备和滴定过程，要避免阳光照射和与铜、铁器具接触，以免抗坏血酸被破坏。 4.滴定过程宜迅速，一般不超过2min。样品滴定消耗染料1, 4mL为宜，如果超出此范围，应增加或减少样品提取液用量。 七、思考与作业 1. 该法测定抗坏血酸有何不足, 2. 用2%草酸提取样品的目的是什么, 新乡医学院实验课教案首页 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师课程名称:生物化学实验 生物化学实验 课程名称 实验九 油脂酸价的测定 授课题目 2007级本科生物技术专业 授课对象 课时分配:讲解原理、操作步骤、注意事项等35-45分钟，学生操作75-85分 时间分配 钟，共计3个学时。 掌握测定油脂中游离脂肪酸含量的方法 课时目标 油脂酸价测定的原理和操作步骤 授课重点 本实验的操作步骤 授课难点 演示与示教 授课形式 讲解与演示 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 本实验应注意的问题 思考题 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 教学手段和 基本内容 教学组织 介绍本实验的实验九 油脂酸价的测定 目的 一、目的和要求 约2分钟 掌握测定油脂中游离脂肪酸含量的方法。 二、原理 介绍原理 油脂暴露于空气中一段时间后，在脂肪水解酶或微生物繁殖产生的酶约10分钟 作用下，部分甘油酯会分解产生游离的脂肪酸，使油脂变质酸败。因此， 油脂中游离脂肪酸含量就能够反映油脂新鲜程度。游离脂肪酸的含量可以 用中和1g油脂所需的氢氧化钾mg数，即酸价来表示。油脂中游离脂肪酸 含量越高，中和时氢氧化钾的消耗量越高，所得的酸价越大，表明该油脂 的质量越差。 三、主要仪器、材料和试剂 器材 三角瓶、碱式滴定管、水浴锅、豆油或菜油。 试剂 1(乙醚-乙醇混合液:95,乙醇和无水乙醚按1?1体积比混合。 试剂、器材 2(0.1,酚酞:1g酚酞溶于100 ml 95,乙醇中。 约1分钟 3(0.1mol/L KOH溶液:0.56g KOH溶于100ml蒸馏水中。 四、操作步骤 1. 取3只三角瓶，两只中称量油脂1,2g，第三只做空白对照; 2. 分别向3只三角瓶中各加入50ml乙醇-乙醚混合液融解，呈透明状 态; 操作步骤 演示操作等 3. 加1,酚酞指示剂1,2滴; 约15分钟 4. 用0.1M的KOH滴定，至溶液出现浅红色，30秒不褪色为止。 五、结果分析 (21)VV, 酸价, ，，0.156W 结果分析 V2:滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的ml数。 约5分钟 V1:滴定空白对照时耗用的氢氧化钾的ml数。 W:油样重(g)。 六、思考题 1. 为什么油脂要选择乙醚-乙醇混合液来溶解, 思考题、作业 2. 深色油测定酸价时应注意哪些问题, 1分钟 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 生物化学实验 课程名称 实验十 肝糖原的提取和定性 授课题目 2007级本科生物技术专业 授课对象 理论讲授30min 学生操作辅导90min 时间分配 1. 学会和掌握肝糖原提取和定性的原理和方法。 课时目标 2. 掌握使用离心机的方法步骤。 肝糖原提取和定性的原理和方法 授课重点 肝糖原提取和定性的原理和方法 授课难点 演示与示教 授课形式 讲解与演示 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 本实验应注意的问题 思考题 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:井长勤 讲师 教学手段和 基本内容 教学组织 引言 实验十 肝糖原的提取和定性 介绍本实验的应一、目的和要求 用和特点 1. 学会和掌握肝糖原提取和定性的原理和方法。 约2分钟 介绍本实验的目2. 掌握使用离心机的方法步骤。 的 二、原理 约3分钟 肝糖原是糖在机体内的重要储存形式之一。储存量虽不多，但在代 谢过程中，它是机体内糖的重要来源之一。其合成或分解，对血糖浓度 的调节起着重要的作用。糖原是一高分子化合物 (分子量约400万)。微 溶于水，无还原性，与碘作用生成棕红色。提取糖原是将新鲜的肝组织 与石英沙及三氯醋酸共同研磨，当肝组织充分破碎后，其中的蛋白质被介绍原理 三氯醋酸所沉淀，而糖原仍留于溶液中。过滤除去沉淀。在上清液中加 入乙醇溶液，糖原从溶液中沉淀析出。离心后将沉淀的糖原溶于水，一 部分作碘的颜色反应，一部分经酸水解成葡萄糖后，用斑氏(Benedict)试 剂检验。糖原本身无还原性，但在酸性溶液中加热可水解为具有还原性 的葡萄糖，后者可将碱性铜溶液(班氏试剂)中二价铜还原为氧化亚铜。 利用上述性质可判定肝组织中糖原的存在。 三、主要仪器、材料和试剂 试剂和器材 器材 解剖剪、镊子、滤纸、离心管、研钵、玻璃棒、电炉、解剖盘、托 盘天平。 试剂 斑氏试剂:将硫酸铜173g溶于100ml温蒸馏水中;另溶柠檬酸钠 173g和无水碳酸钠100g于700ml温蒸馏水中，待冷后，将硫酸铜溶液 缓缓(不断搅拌)加入柠檬酸钠和碳酸钠混合液内，最后用蒸馏水稀释至1 000ml。10%三氯醋酸、5%三氯醋酸、95%乙醇、碘溶液、20%NaOH、 浓盐酸 四、操作步骤 (一)肝糖原提取 演示操作步骤 1. 用断头法杀死兔或大鼠，立即取出肝脏，迅速以滤纸吸去附着的 血液。 称取约2g，置研钵中，加石英沙少许及10%三氯醋酸2mL，研磨5min。 2. 再加5%三氯醋酸4ml，继续研磨1min，至肝脏组织已充分磨成 糜状为止，然后以2 500r/min，离心10min。 3. 小心将离心管上清液转入另一有刻度的离心管中并量取体积，加 入同体积的95%乙醇，混匀后，静置10min，此时糖原成絮状沉淀析出。 4. 沉淀溶液以2 500r/min离心10min。弃去上清液，并将离心管倒 置于滤纸上1,2min。 5. 在沉淀内加入蒸馏水1ml，用细玻璃棒搅拌沉淀至溶解，即成糖 原溶液。 (二)鉴定 1. 取2支小试管，一支加糖原溶液10滴(0.5ml);另一支加蒸馏水 10滴，然后两管中各加碘溶液1滴，混匀，比较两管溶液颜色有何不同? 解释之。 2. 在剩余的糖原溶液内，加浓盐酸3滴，放在沸水浴中加热10min 以上。取出冷却，然后以20% NaOH溶液中和至中性(用pH试纸试验)。 3. 在上述溶液内，加斑氏试剂2ml，再置沸水浴中加热5min，取出 冷却。观察沉淀的生成，并解释之。 五、注意事项 1. 实验兔或大鼠在实验前必须饱食，因为空腹时肝糖原易于减少含 量或耗尽。 2. 肝脏离体后，肝糖原会迅速分解。因此在杀死动物后，所得肝脏强调注意的问题 必须迅速以三氯醋酸处理以防分解。 六、思考题 1. 提取肝糖原时，实验动物在实验前为什么必须是饱食的? 2. 在杀死实验动物后，离体肝脏为什么要迅速用三氯醋酸(10%)处理? 3. 提取肝糖原的第一步是将新鲜肝组织与三氯醋酸溶液(5%)置研钵中共同研磨，此时三氯醋酸的主要作用是什么? 4. 在提取肝糖原实验中，使糖原从溶液中沉淀析出应添加什么试剂? 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:张秀华 讲师 生物化学实验 课程名称 实验十一 酪蛋白的制备 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解20 min 操作100min 时间分配 1(学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 课时目标 2(掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法 授课重点 从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1(制备高产率纯酪蛋白的关键是什么, 思考题 2(试设计另一种提取酪蛋白的方法, 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:张秀华 讲师 教学手段和 基本内容 教学组织 实验十一 酪蛋白的制备 一、实验目的 多媒体教学，启 发式教学，传统1.学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 讲授与演示 2.掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 二、实验材料、试剂与主要仪器 材料:新鲜牛奶 试剂:0.2 mol/L 醋酸钠缓冲液(pH4.6)、95%乙醇、乙醇-乙醚混合液(体积比 1:1)、乙醚 器材:抽滤装置、精密pH试纸或酸度计、 烧杯、水浴锅、表面皿 三、实验原理 酪蛋白是牛乳中存在的主要蛋白质。它不是简单蛋白质，而是一些含磷蛋白 质的混合物。 酪蛋白同许多其它蛋白质一样，在等电点时溶解度很低，利用这一性质，将 牛乳调到pH4.8，酪蛋白就沉淀出来。。酪蛋白不溶于乙醇和乙醚，利用这个性质， 启发学生利用用乙醇和乙醚除去酪蛋白中的水和脂类物质。 蛋白质的其他 牛乳中的酪蛋白含量比较稳定，约为35g/L，利用这个特点，可以牛乳是性质制备酪蛋 白 否掺假。 四、操作步骤 (一)酪蛋白的粗提 1(100mL牛奶加热至40?。在搅拌下慢慢加入预热至40?、pH4.6的醋酸缓 强调过滤时应冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.8。 该注意的事项 2(将上述悬浮液冷却至室温，放置3分钟，用两层纱布过滤。 (二)酪蛋白的纯化 1(用水洗涤沉淀3次，在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转 移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次(每次20ml)。最后用乙 醚洗沉淀2次(每次20ml)，抽干。 2(将沉淀摊开在表面上，风干;得酪蛋白纯品。 五、结果计算 准确称重，计算含量和得率。 公式的来源 含量:酪蛋白g/100毫升牛乳(g%) 测得含量 ，100%得率: ，式中理论含量3.5g/100mL牛乳 理论含量 六、注意事项 1(由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一 定要准确。 强调 2(精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。 3(目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算 七、思考题 1(制备高产率纯酪蛋白的关键是什么, 2(试设计另一种提取酪蛋白的方法, 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:张秀华 讲师 生物化学实验 课程名称 实验十二 植物基因组DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳技术 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解30 min 操作130min 时间分配 1.初步掌握基因组DNA的提取方法。 2.了解SDS、PK、饱和酚、氯仿、无水乙醇等试剂的特性及作用。 3.学习分光光度法测定DNA的浓度; 课时目标 4.初步掌握琼脂糖凝胶电泳技术。 5.了解水平式琼脂糖凝胶电泳在检测DNA的纯度、浓度及分子量等方面的应用。 1. 基因组DNA的提取方法2. 琼脂糖凝胶电泳技术 授课重点 1.分光光度法测定DNA的浓度2.水平式琼脂糖凝胶电泳在检测DNA的纯度、浓度授课难点 及分子量等方面的应用。 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 数次离心，每次离心后应保留哪部分,弃去的部分主要含什么, 思考题 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:张秀华 讲师 教学手段和 基本内容 教学组织 实验十二 植物基因组DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳技术 多媒体教学，启 发式教学，传统一、目的和要求 讲授与演示 1. 通过本实验学习琼脂糖电泳检测DNA的方法和技术。 2. 掌握从植物组织上提取DNA的方法。 二、原理 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取中的含有的SDS溶 解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。详细介绍原理 再用酚、氯仿抽提的方法除蛋白，得到的DNA溶液经冰冷异丙醇沉淀。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高 于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结 构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以 同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于 分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数 值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的,NA，也可以分离相对 分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 三、主要仪器、材料和试剂 器材 强调并演示微恒温水浴器、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外线透射仪、陶瓷研钵、 量移液器的正吸头、小吸管、液氮。 确使用方法 试剂 1. 细胞提取液: 100mmol/L Tris-HCL(pH8.0) 5mmol/L EDTA(pH8.0) 500mmol/L NaCl 1.25% SDS 1mol/L ß-巯基乙醇 2. 3mol/L KCl 3. TE缓冲液 4. 5?TBE(5倍体积的TBE贮存液) 配1000mL5?TBE(pH8.0): Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml 5. 凝胶加样缓冲液(6?) 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% 6. 琼脂糖 7. 溴化乙锭溶液(EB) 10 m g /ml 四、操作步骤 (一)植物基因组DNA的提取 1. 取决1g新鲜蒜黄叶片，在液氮中研成粉末状(越细越好)。 详细介绍过程 O2. 加入700µl细胞提取液，充分混匀，转移至1.5mlEP管中。65C水浴 保 温20min。 3. 从水浴中取出EP管，加入500µl 3mol/LKCL溶液，混匀，冰浴20min。 4. 12000r/min离心5min。 5. 转移700µl上清液到另一EP管中。 6. 加等体积饱和酚混匀，12000r/min离心5min，取上清。 7. 加等体积氯仿，混匀，12000r/min，离心5min，取上清。 8. 加入等体积的冰冷异丙醇(沉淀DNA)，混匀，12000r/min，离心10min。 9. 弃上清获得沉淀，70%冰冷乙醇洗3次。风干沉淀。 10. 加入100µlTE缓冲液，溶解DNA (二)琼脂糖凝胶电泳检测 1. 制备琼脂糖凝 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表: 琼脂糖凝胶浓度/% 线状DNA的有效分离范围/kb 0.3 5~60 0.6 1~20 0.7 0.8~10 0.9 0.5~7 1.2 0.4~6 1.5 0.2~4 2.0 0.1~3 称取0.4g琼脂糖，放入锥形瓶中，加50ml 1XTBE缓冲液，置微波炉或水浴加热 演示 至完溶化，取出摇匀，则为0.8%琼脂糖凝胶液。 2(胶板的制备 (1)取有机玻璃槽，洗净，晾干，皮用橡膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好 (一定封严，不能留缝隙)。 (2)将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 0(3)当冷到60C左右的琼脂糖凝胶液，加入50µl 10 m g /ml EB ，然后缓缓 倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气 演示点样的过泡)。 程 (4)待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽中 。 (5)加入电泳缓冲液至电泳槽中(浸没胶面少许)。 3(加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品(2 µl 6?上样缓冲液+10µl DNA样品)加入样孔(记录点样顺序及点样量)。 4(电泳 (1)接通电泳槽与电泳仪的电源(注意下负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。 (2)当溴酚兰染料移动到距凝胶前沿1,2cm处，停止电泳。 5(检测 在凝胶成像系统下用紫外光观察DNA条带(戴手套操作)。 五、思考题 1(在DNA抽提过程中酚、氯仿的作用是什么, 2(在电泳检测时应注意哪些事项, 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 生物化学实验 课程名称 实验十三 SDS碱变性法制备质粒DNA 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解40 min 操作:240min 时间分配 1学习和掌握用SDS碱变性法提取的质粒DNA原理与方法; 课时目标 2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的操作方法。 SDS碱变性法提取的质粒DNA方法; 授课重点 琼脂糖凝胶电泳的操作方法。 SDS碱变性法提取的质粒DNA原理 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1. 质粒DNA提取的原理是什么, 思考题 2. 质粒DNA提取过程都注意哪些事项, 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 教学手段和基本内容 教学组织 实验十三 SDS碱变性法制备质粒DNA 首先与理论课所学的内容相结合复习有关质粒得知识: 结合以前学习1. 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 的理论知识 2. 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式 存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 3. 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋 白和酶。 质粒特点 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的 结合实际介绍原始生命。 应用 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的 性因子. 1952年由Lederburg正式命名为质粒。 质粒类型 质粒按复制方式分为两种类型: 松弛型质粒和严紧型质粒 看图幻灯片 10.11.12 1. 松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的 半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋 白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可 达2000-3000拷贝。 2. 严紧型质粒 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯 霉素等蛋白合成抑制剂来增加。 质粒的应用: 大多数基因使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介 物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 一、目的和要求 学习和掌握用SDS碱变性法提取的质粒DNA原理与方法。 二、主要仪器、材料和试剂 器材: 1(5mL Eppendorf 管、1000µL微量加样器、台式高速离心机、 电泳仪、电泳槽、含质粒的菌株pUCm-T-JM109。 试剂: 1(溶液I:50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl ，10mmol/L EDTA， 调pH至8.0，高压灭菌后4?保存 2(溶液II:10mmol/L EDTA和2% SDS临用前1:1混合，现用现配， 终浓度0.2mol/L NaOH;1% SDS 3(溶液III:5mol/L 乙酸钾 60mL;ddH2O 28.5mL，调pH至5.2，高 压灭菌后4?保存 4(RNase A:10mg/mL，沸水浴20分钟后4?保存 5(TE缓冲液:1mmol/L EDTA;10mmol/L Tris-Cl，调pH至8.0，高压 灭菌后4?保存 6(Tris-Cl(pH8.0)饱和苯酚 7(氯仿/异戊醇:24/1(v/v) 8(70%:乙醇 9(100 mL氨苄青霉素LB培养基:含胰化蛋白胨1g;酵母提 取物0.5g;氯化钠1g。高压灭菌后加入氨苄青霉素，使其终浓度为50µg/mL 10(50倍100 mL TAE缓冲液:Tris 24.2g;5.71g 冰乙酸;10 mL 0.5mol/ L EDTA，调pH至8.0 11(0.5µg/mL溴化乙锭 12(分子量标准DNA:100bp-5000bp 结合质DNA的 三、实验原理 性质介绍原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在 碱变性条件下(pH 12.6)，线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性， 质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的 两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性 的质粒DNA又恢复到原来的构型，而线性DNA不能复性，形成缠绕的致密 网状结构，离心后，由于浮力密度不同，线性DNA与大分子RNA、蛋白质 SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，从而实现质粒DNA的分离。 四、操作步骤 (一)质粒提取 关键步骤边演1(取出一个菌落，移至氨苄青霉素的LB培养基中，在37?条件下振荡示边讲解 (120转/分)培养12-16h。 2(将1.5mL培养物移至1.5 mL Eppendorf管中， 10000g离心1min。 先看幻灯片，在3(弃上清，沉淀悬浮在200µL预冷的溶液I中，混、匀，使其完全分散。 看实物，然后边 4(加400µL新配制的溶液II, 盖紧管口。颠倒2次使内容物混合、放置讲解边演示。 冰上5min。 5(加300µL预冷的溶液III，盖紧管口。将管颠倒3次，冰上放置5min。 6(12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。 7(加等体积酚/氯仿/异戊醇振荡混匀，12000g离心5min。 8(弃上清，加入0.5mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，离心弃上清，在空气中 使质粒DNA干燥，约需20min。 9(将质粒DNA溶于30µL ddH2O中，加入3µL 10mg/mL 的RNase A ，37? 保温30min，后4?保存。 (二)琼脂糖凝胶电泳检测 1. 配胶 称取一定量的琼脂糖倒入三角瓶中，加入一定量的TAE缓冲液， 电炉上加热煮沸，待温度降40?C左右，倒胶，凝固30 min左右，拔出梳子 和挡板。放入电泳中，让电泳缓冲液没过凝胶; 2. 加样 根据需要取质粒DNA 2 μl 样品按比例加入6 x 的上样缓冲 液，混合均匀后即可上样; 3. 电泳 保持电压120 V左右，待溴酚蓝距离凝胶前端1,2 cm 时，关 闭电源; 4. 观察 取出凝胶，在紫外灯下观察。 五、注意事项 1.质粒提取过程中动作要准确、迅速; 强调 2.电泳过程中一定要防止EB污染。 六、思考与作业 1. 质粒DNA提取的原理是什么, 2. 质粒DNA提取过程都注意哪些事项, 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 生物化学实验 课程名称 实验十四 RNA的分离和检测 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解50 min 操作:190min 时间分配 1.学习和掌握用异硫氰酸胍提取RNA的原理与方法; 课时目标 2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的操作方法。 用异硫氰酸胍提取RNA的方法 授课重点 用异硫氰酸胍提取RNA的原理 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 在RNA提取时，为降低RNase的作用，采 取了哪些必要措施, 思考题 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 教学手段和基本内容 教学组织 实验十四 RNA的分离和检测 背景知识: 原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA， 信使RNA(mRNA)、核 结合以前学习糖体RNA (rRNA)、转运RNA(tRNA)。而真核生物则能产生四种，还有一种的理论知识介 绍RNA有关知为真核生物所持有的小RNA。mRNA是由基因转录而来的，它运送编码蛋白 识。 所需的信息。 由于mRNA代表了基因表达的水平，因此mRNA的分离、定 量和检测极为重要。 应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。RNA存 在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。由于当前 没有一种方法能够直接扩增RNA，因此，RNA的分离通常是决定实验结果质 量的第一步，也是关键的一步。 一、实验目的 学习和掌握用异硫氰酸胍提取RNA的原理与方法。 二、原理 组织中的RNA主要分布在胞浆中，包括mRNA、tRNA和rRNA三种。 mRNA含量最低，半衰期短，易于降解。在RNA 的提取过程中，主要采用 强变性剂，如异硫氰酸胍等破坏细胞结构，失活RNA酶。细胞碎片、蛋白质 等经酚、氯仿等有机溶剂抽提被去除。 图示介绍 RNA提取的关键是防止内源性和广泛存在的外源性RNA酶，如器皿、试剂 和手上等存在的RNA酶对核酸的降解作用，所用材料、器皿均需经DEPC处 理(包括0.1%溶液浸泡过夜，蒸馏水冲洗及高压灭菌15min去除残存的 DEPC)。真核生物中18S rRNA、28S rRNA经琼脂糖电泳后，在紫外灯下可 观察到两条清晰的条带。 三、主要仪器、材料和试剂 器材: 电子天平、研钵、手术剪刀、Ep 管、冰盒、65?水浴、锡箔、冷冻离心 机、电泳仪、电泳槽、烘箱、棉手套、振荡器。 试剂: 1(液氮 2(氯仿-异丙醇(49:1，V/V) 3(75%乙醇 4(溶液D(变性液):250g异硫氰酸胍、0.75mol/L(pH7.0)柠檬酸钠 17.6 mL和10%(m/V)月桂基磺酸钠26.4溶于293mL水中。65?水浴搅拌 混匀至完全溶解。临用前每50mL加入14.4mol/L的β-巯基乙醇0.36mL，室 温下避光保存。终浓度:4mol/L异硫氰酸胍;25mmol/L柠檬酸钠;0.5%(m/V) 月桂基磺酸钠; 0.1mol/L β-巯基乙醇 5(0.1% DEPC处理水 6(苯酚 7(2.0mol/L，pH4.0的醋酸钠 8(10倍凝胶缓冲液:含吗啉代丙磺酸(MOPS)(pH7.0) 200mmol醋酸钠 100 mmol/L;EDTA(pH8.0) 10 mmol/L过滤除菌后避光保存 9(5倍变性上样缓冲液:含16µL水饱和的溴酚蓝;80µL d的500 mmol/L EDTA(pH8.0);720µL 37,(12.3mol/L)的甲醛; 3084µL 甲酰胺;4 mL 10 倍凝胶缓冲液，用0.1% DEPC处理水定容至10 mL，4?保存。 10(甲醛(37,) 11(溴化乙锭染液:溴化乙锭为0.5µg/ mL，用0.1mol/L的甲酰胺配制。 四、操作步骤 关键步骤边演1(RNA提取 示边讲解。 (1)称取0.2g新鲜肝组织, 剪碎后放在-20?预冷的研钵中倒入液氮快速研 磨，并及时添加液氮(操作过程中戴棉手套防止冻伤)。 (2)将冰冻组织碎末移入加3mL溶液D的离心管中，振荡处理15,30s。 (3)将振荡处理后的溶液分成3份，在离心管中每毫升溶液D加入0.1mL 2.0mol/L的醋酸钠(pH4.0);1 mL苯酚;0.2 mL氯仿-异丙醇，盖严管 盖，倒置混匀。 (4)剧烈振荡10s。再冰浴15min，使核蛋白质复合体彻底裂解。 (5)10000g 4?离心20min。 与前面所做的(6)吸取上清，加入等量体积的异丙醇，充分混匀后在-20?沉淀 质粒DNA的电 RNA 30min或更长的时间。 泳作对比，相同 之处和不同之(7)10000g 4?离心30min，收集RNA沉淀。 处。 (8)用0.5mL 75%乙醇RNA沉淀，离心后吸去上清，再用0.5mL 75% 乙醇洗涤一次。离心后彻底吸去上清，空气干燥后，用无RNase水溶解 备用。 2(RNA的电泳鉴定 (1)称取1.2g琼脂糖，加入72 mL 0.1% DEPC处理水，加热熔化。冷却至60? 后在通风橱中加入10倍凝胶缓冲液10mL，甲醛(37,)18 mL，混匀后 倒胶。待胶完全凝固后，放入电泳槽，倒入稀释好的1倍的凝胶缓冲液， 以刚好没过胶面0.5ml为宜，小心拔下梳子。 (2)将RNA样品与5倍变性上样缓冲液以4:1的比例混合，65?温浴10min。 迅速在冰上冷却5min，瞬时离心数秒。 (3)上样前凝胶预电泳5min。将混合好的RNA样品小心点入点样孔，注意别 点在外面～以5V/cm的电压电泳1.5,2h， (4)待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3或4/5处结束电泳。将胶置于溴化乙锭 染液中染色30min。 (5)在紫外灯下观察结果。 五、注意事项 再次强调本实 1. 所有可能与RNA接触的器材均得用DEPC处理。 验的注意点 2. 操作过程中应带口罩，手套。 3. DEPC有致癌之可能，尽量避免接触皮肤。 六、思考与作业 在RNA提取时，为降低RNase的作用，采取了哪些必要措施, 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 生物化学实验 课程名称 实验十五 人血清IgG(免疫球蛋白)的制备与纯化 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解40 min 操作:200min 时间分配 1.掌握人血清IgG(丙种球蛋白)的制备和纯化流程。 2.熟悉其制备方法。基本原理及操作技术，包括盐析、脱盐(装拄、上样与洗脱、课时目标 收集)等。 血清IgG(丙种球蛋白)的制备方法 授课重点 血清IgG(丙种球蛋白)的制备原理 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1.根据实验过程的体会，总结如何做好葡聚糖凝胶层析实验,哪些是关键步骤, 思考题 2.根据实验结果，总结实验过程中要有哪些注意事项, 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院理论课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 基本内容 教学手段和 教学组织 实验十五 人血清IgG(免疫球蛋白)的制备与纯化 一、目的和要求 1. 掌握人血清IgG(丙种球蛋白)的制备和纯化流程。 2. 熟悉其制备方法。基本原理及操作技术，包括盐析、脱盐(装拄、上样与 洗脱、收集)等。 二、原理 结合以前学习 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学及其生物功能的重要手段。不同的蛋 的蛋白治纯化白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同，可以根据有关理论知识 介绍 这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。利用硫酸铵分段盐析法将血清中 的γ-球蛋白及清蛋白及α、β球蛋白分离，再利用葡聚糖过滤除盐，即可得 到较纯的γ-球蛋白。 三、主要仪器、材料和试剂 试剂: 饱和硫酸溶液、磷酸盐缓冲液0.01mol/L, pH7.2 、纳氏试剂 。 看图 仪器及材料: 离心机、层析柱、镊子、培养皿、离心管、烧杯、量筒，吸管，滴管， 瓷比色盘、正常人混合血清样品。 四、操作步骤 1. 盐析 取血清2.0ml加入离心管中，加磷酸盐缓冲液(PBS)2.0ml，混匀。再 关键步骤演示 逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵液4.0ml，边加边摇匀。静置30分钟后离心 (3000rpm?10分)倾去上清液(此液中主要含清蛋白)，并尽量倒净。沉淀 为球蛋白。 将上述离心管中的沉淀用1.0ml PBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵液 0.5ml，混匀，静置30分钟后离心(3000rpm?10分)，倾去上清液(此液中 主要含球蛋白)，并尽量倒净，其沉淀为初步纯化的γ-球蛋白。若要获得更 纯的γ-球蛋白，可以重复此过程1-2次，最后用1.0ml PBS将沉淀溶解。 2. 脱盐 (1)装柱:取层析柱(1?20cm),关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加葡 聚糖凝胶G-25悬液，待底部沉积1,2cm厚的凝胶后，打开下端图示介绍 出口，继续加入凝胶至凝胶沉淀10,15cm高，注意凝胶床表面 应平整。凝胶柱经PBS流洗平衡后即可使用。 (2)上样与洗脱:小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降到 凝胶床表面，关紧下端出口。用滴管吸取γ-球蛋白液，小心缓 慢地加到凝胶床表面上，注意不要破坏凝胶床表面的平整。打开 下端出口，使样品进入凝胶床，小心加入少许PBS于柱内，待 进入凝胶床后再加入少许的PBS，如此重复三次，以洗净柱内壁 上的样品溶液，然后可加入多量的PBS进行洗脱。流速为4,5 滴/分。 (3)收集:事先应准备好15支小试管，于加样后开始立即收集洗脱液。每 收集约1ml换一管。 检查:取瓷比色盘2个(一个为黑色背景， 另一个为白色背景)，按洗脱液的管号顺序分别取1滴滴于比色 盘中，前者各加10,三氯醋酸5滴，出现白色混浊或沉淀者即有 蛋白质存在;后者各加纳氏试剂1滴，出现颜色反应者存在 NH4+。将检查结果用“-，+，++，+++”等符号记录于下表中。 选取蛋白含量高且不含铵离子的样品液进行纯度鉴定。 五、 注意事项 1. 盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避强调注意事项 免产生气泡。 2. 注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。 3. 注意检查层析柱的情况，主要明确层析住是否均匀，表面是否平整，有无气泡、裂隙。 六、思考与作业 1.根据实验过程的体会，总结如何做好葡聚糖凝胶层析实验,哪些是关键步骤, 2.根据实验结果，总结实验过程中要有哪些注意事项, 新乡医学院实验课教案首页 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 生物化学实验 课程名称 实验十六 SDS-PAGE分离蛋白质 授课题目 2007级本科生物技术专业，2006级药学专业 授课对象 讲解40 min 操作:200min 时间分配 掌握SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)基本原理及操作技术，包括制胶、灌胶、加样、剥课时目标 胶及染色等。 1.SDS-PAGE电泳原理2.操作技术 授课重点 胶体制备 授课难点 实验课教学，小班分组实验 授课形式 参考相关教材;收集相关素材(图片等)，制作多媒体课件，做预实验。 授课方法 1.《生物化学实验指导》 自编教材 2.《生物化学实验》.北京. 科学出版社，2004. 4. 参考文献 3.《生化实验方法和技术》张龙翔等，高等教育出版社，1997 1(SDS-PAGE原理是什么,得到的是蛋白单体还是完整蛋白, 思考题 教研室主任,签字 , 课程负责人,签字, 教研室主任 及课程负责 人签字 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称:生物化学实验 授课教师姓名及职称:闫清华 助教 教学手段和 基本内容 教学组织 实验十六 SDS-PAGE分离蛋白质 一、目的和要求 多媒体教学，启 发式教学，传统掌握SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis， 讲授与演示 SDS-PAGE)基本原理及操作技术，包括制胶、灌胶、加样、剥胶及染色等。 二、原理 在聚丙烯酰胺凝胶中，加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS)，使蛋白质样品 与SDS结合成带负电荷的复合物，电泳时都以相同的荷质比向电性相反的方向移 详细 动;由于复合物分子量的不同，在电泳中反映出不同的迁移率，分子量小者在凝 胶电场中移动速度快，分子量大者移动速度慢，从而将不同分子量的蛋白质在凝 胶中得以分离。 三、主要仪器、材料和试剂 器材 演示 垂直平板电泳槽、直流稳压电泳仪、微量加样器、牛血清样品。 试剂 AA/BA:30g丙烯酰胺(AA)，0.8g甲叉丙烯酰胺(BA)，0.4g活性碳溶 于100ml双蒸水，室温搅拌两小时，然后双层滤纸过滤至棕色瓶内，4?保存。 简单介绍 Tris-HCl(1.5M, pH8.8):0.4gSDS，18.17gTris溶于80ml双蒸水中，搅拌， 用HCl调至pH8.8，然后定容至100ml，单层滤纸过滤，4?保存。 Tris-HCl(1M, pH6.8):0.4gSDS，12.12gTris溶于80ml双蒸水中，搅拌，用 HCl调至pH6.8，然后定容至100ml，单层滤纸过滤，4?保存。 10,AP:0.1g过硫酸铵，1ml双蒸水(新鲜配制)。 TEMED:四甲基已二胺(市售分析纯)。 10×电泳缓冲液:甘氨酸72.2g，Tris 15g，SDS 5g+双蒸水500ml，pH值为 8.5。 3×样品缓冲液:10,甘油，3,巯基乙醇(酶复性电泳不加)，3.5,Tris液 (0.5M Tris-HCl)，10,SDS，加双蒸水至量。 0.1,溴酚蓝:3×样品缓冲液33ml，0.1g溴酚蓝，66ml生理盐水，充分溶解。 1,琼脂:1g琼脂，100ml电泳缓冲液，加热溶解(用时稍冷却)。 固定液:乙醇:冰乙酸:蒸馏水= 5:1:4(体积比)。 脱色液:乙醇:冰乙酸:蒸馏水= 5:1:5。 染色液(0.25%考马斯亮蓝R-250溶液):0.5g考马斯亮蓝R-250，200ml脱 色液，充分搅拌溶解。 表1 浓缩胶(5,)配方 板 1 1.5 2 3 数 试 剂 双蒸水 5.25ml 7.88ml 10.5ml 15.75ml AA/BA 1.5ml 2.25ml 3.0ml 4.5ml Tris-HCl(pH6.8) 2.25ml 3.38ml 4.5ml 6.75ml AP(10%) 36µl 54µl 72µl 108µl TEMED 18µl 27µl 36µl 54µl 表2 分离胶(10,)配方 板 1 1.5 2 3 数 试 剂 双蒸水 7.5ml 11.25ml 15ml 22.5ml AA/BA 6.0ml 9.0ml 12ml 18ml Tris-HCl(pH8.8) 4.5ml 6.75ml 9.0ml 13.5ml AP(10%) 36µl 54µl 72µl 108µl TEMED 18µl 27µl 36µl 54µl 四、操作步骤 1(凝胶的制备 根据所需的板数，按配方(表1、表2)把各工作液混匀后，首先把夹好的玻 璃板垂直放平，利用1,琼脂封底边和侧边，待冷却后，将分离胶缓慢注入胶液 演示 槽中，上面留出4cm，为以后灌浓缩胶用，并在上面均匀覆盖2ml蒸馏水，室温 静置1.5 h左右，胶液聚合成凝胶后，弃去水，用蒸馏水洗涤凝胶面2次，将样 品梳子插入胶液槽中，把混匀的浓缩胶缓慢加入槽中，在室温下静置1h左右， 待浓缩胶凝固后，轻轻拔出梳子，立即用蒸馏水冲洗样品槽3次，然后把胶板组 装成电泳系统。 2(加样 依次在样品槽中缓慢加入血清蛋白样品(30µl,槽，样品?样品缓冲液= 2?1，最好做个浓度梯度)，勿触及胶面。 3(电泳 加入上下槽电极液，并在上槽电极液中加入少许溴酚蓝作为前沿指示剂， 在常温下进行电泳;电泳起始电压为50V，当样品到达分离胶后，调电压为 100V;待前沿指示剂到达分离胶下沿2cm时(约10h)，停止电泳。 4(剥胶和固定 电泳结束后，回收电极液，卸下玻璃板，取出垫片并将玻璃板撬开，小心地 取出凝胶板，在胶板一端切除一角作为标记。将胶置于培养皿内，放入固定液， 没过凝胶板，室温固定20 min。 5(染色 弃去固定液，加入染色液，轻轻晃动染色10 min。 6(脱色 染色完毕，倾去染色液，加入脱色液，直至凝胶的蓝色背景褪去，蛋白质条 带清晰为止(约2 h中间换一次脱色液)。 7(观察 将凝胶板置灯箱上观察蛋白质区带。牛血清蛋白主要有白蛋白(又称清蛋白， 3 Mr为66×10，占血清总蛋白的65%)和球蛋白(分为α、β和γ球蛋白，分子量 较大)组成。 五、思考与作业 1. 根据实验过程的体会，总结如何做好SDS-聚丙烯酰胺垂直板电泳,哪些布置思考题 是关键步骤, 2. 根据实验结果，绘出人血清蛋白质图谱。