硕士论文--干姜提取物制备工艺与质量控制研究（可编辑）

硕士论文--干姜提取物制备工艺与质量控制研究（可编辑） 成都中医药大学 硕士学位论文 干姜提取物制备工艺与质量控制研究 姓名:范婧娴 申请学位级别:硕士 专业:药物化学 指导教师:刘友平 2009-04中 文 摘 要 干姜为姜科植物姜 Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎,主产于四川、贵州、 山东、云南等地,其中以四川、贵州的产量大,品质好。在四川以犍为、沐川为 地道产区。干姜提取物以姜油树脂、姜油为主流产品。我国目前存在干姜提取物 的生产工艺和质量标准都有没有统一标准,本课以“两个标准三个规程” 药 材与提取物标准,药材采收加工SOP、提取物生产工艺SOP、检验操作SOP为重 点进行了以下研究: 1.干姜药材质量标准研究 在《中国药典》2005 年版一部干姜项下相关内容的基础上,对收 集样品进 行了质量标准的研究,本研究使干姜药材的质量标准更加完整、可控。 增加姜辣素含量测定项。参照《美国药典》(24),以辣椒碱为外标对照品, 建立了含量测定。经测定,6批干姜饮片的 6-姜酚、8-姜酚和 10-姜酚总含 量平均为 8.09(mg/g),6批干姜饮片的 6-姜酚、8-姜酚和 10-姜酚总含量基本 稳定,RSD为 0.81%。建立了干姜 HPLC标准指纹图谱,标定了 26个共有峰。 2.干姜提取物生产工艺的研究 2.1全面系统地研究了姜油树脂的生产工艺在提取工艺方面,以提取液中姜辣素含量为指标,筛选了提取溶媒,结果以 80%乙醇提取效率昀高;考察了提取方法,结果以温浸法昀佳,采用正交试验设 计法考察了固液比、提取时间以及提取温度等主要因素对姜辣素提取率的影响, 优选了姜油树脂的提取工艺,结果以加入 8倍量 80%乙醇,60?温浸提取 90min 为宜。 在干燥成型工艺方面,由于姜油树脂对温度、光、氧等外界因素 十分敏感, 且对人体黏膜有较强的刺激性,β-环糊精能增加稳定性,并使黏稠液体固态化, 本课题采用β-环糊精包合技术作为姜油树脂的干燥成型方法,以姜辣素的包合 率为指标,考察了β-CD/姜油树脂质量比、包合时间和包合温度等主要因素,确 定工艺为:加入 1.5倍的β-环糊精 60?包合1h,4?放置24h,过滤,45?减压 干燥24h,研磨得到得姜油树脂。 2.2研究了超临界 CO 萃取法提取姜油的生产工艺 2 2.2.1水蒸气蒸馏法和超临界 CO 萃取法的比较研究 2使用水蒸气蒸馏法和超临界 CO 萃取法提取姜油,得油率分别为 0.9%和 2 2.5%;以 GC-MS比较水蒸气蒸馏法和超临界 CO 萃取法提取的姜油,结果表明 2 两种提取方法得到的挥发油组分及含量相差较大。水蒸气蒸馏法所得姜油只含有 低极性的挥发性成分,而超临界 CO 萃取法所得姜油既含有低极 性成分,又含 2 有极性较高的姜辣素类成分,姜辣素是干姜的主要药效成分,所以选用超临界 CO 萃取法提取姜油。 2 2.2.2超临界 CO 萃取姜油的工艺研究 2 以姜油提取率和姜辣素含量为指标,采用正交实验设计考察了萃取压力、萃 取温度及萃取时间等主要因素的影响,又选了姜油的超临界 CO 萃取工艺,结 2 果以萃取压力20MPa、温度50?、时间3h、CO 流量 8~14 L/h, 分离压力为7~ 2 8Mpa,分离温度为40?为佳。 3.干姜提取物质量标准研究 3.1首次研究建立了姜油树脂的质量标准 对姜油树脂的性状、鉴别、检查、含量测定等质量控制项进行了研究。建立 了TLC鉴别方法;对水分、灰分和重金属、砷盐等有毒有害物质 做了检查;建立 了姜辣素HPLC含量测定方法,通过对10批样品的测定,各批次含量基本稳定, 暂定姜辣素含量不少于5.0%。完成了姜油树脂的质量标准草案。 以 10批样品建立了姜油树脂 HPLC标准指纹图谱,标定了 17个共有峰。10 批样品指纹图谱与标准指纹图谱相似度大于 0.9,其共有指纹峰面积、保留时间 比值及非共有峰面积比值均符合指纹图谱技术要求,药材与提取物指纹图谱相关 性良好,表明不同批次样品质量稳定。 3.2首次研究建立了姜油的质量标准 对姜油的质量标准进行了研究,完成了姜油的质量标准草案,以含量测定、 相对密度和折光率为作为姜油质量的控制项。规定姜油中姜辣素含量不低于 15%,相对密度为 0.948~0.958,折光率为 1.498~1.508。 关键词 干姜提取物 制备工艺 质量控制 指纹图谱 Abstract Ganjiang is the dry root of Zingiber officinale Rosc., which main place of production is Sichuan, Guizhou, Shandong, Yunnan and so on. The famous-region is Qianwei and Muchuan in Sichuan. There are two products contained ginger oil and ginger oleoresin in market. Because the current norms and quality standards of Ganjiang extracts are not uniform, we did a systematic study on “two standards and three regulations”standards of medical material and extracts, SOP of medical material’s process ,SOP of extracts’ preparation process, SOP of analysis as focal point. The main research content and results are as follows: 1. Study on quality standard of Ganjiang We did quality inspection Of Ganjiang according to the 2005 edition Chinese Pharmacopoeia. Reference to "the United States Pharmacopoeia" 24, Take capsaicin for external standard reference substance,eastbish a method of Determination. The determination: 6-gingerol, 8-gingerol and 10-gingerol content of the total average of 6 approved Ganjiang Slices is 8.09(mg/g),6-gingerol, 8-gingerol and 10-gingerol content of 6 approved Ganjiang Slices is the basic stability. RSD5 is 0.81%Established a fingerprint of the standard medicines, and Calibrated 26 common peaks2. Study on preparation process of ginger extracts 2.1 Study on the preparation technology of ginger oleoresin Study on extraction preparation technology is as follows: study on the extraction method, extraction solvent for the single-factor, and using three-factor three-level orthogonal design, Investigated the amount of ethanol, extraction time, extraction temperature of factors and so on, the result is that using 8 times amount of 80% ethanol, digeraturing 90min in 60?Drying process is as follows: Because ginger oleoresin to extraneous factors such as temperature, light, oxygen is very sensitive, and has the strong irritating quality to the human body mucous membrane, β-CD can increase the stability, and make the liquid to solid state, we used theβ-CD technology as Drying process. Investigated the amount of β-CD, clathration time, clathration temperature of factors, the result is that using 1.5 times amount ofβ-CD, clathrating 1h in 60 ?,seting 24h in 4 ?, filtering and vacuum drying 24h2.2 Study on the preparation technology of ginger oil by CO -SFE2 2.2.1 Comparative study on steam distillation and CO -SFE 2 Extracting ginger oil by steam distillation and CO -SFE, extraction rate is 0.9% 2 and 2.5%. Comparing the two type of ginger oil which are extracted by CO -SFE and 2 steam distillation by GC-MS, we found the two methods have significant difference in constitution of ginger oil. So we extract the ginger oil by CO -SFE2 2.2.2 Study on the preparation technology of ginger oil by CO -SFE 2 Using three-factor three-level orthogonal design, studied the following factors: extraction temperature, extraction pressure, extraction time, and the result is that extraction pressure 20Mpa, extraction temperature 50?, extraction time 3 hours, resolution temperature 40 ?, resolution pressure 6-8Mpa,CO flow 8~14 L/h2 3. Study on quality standard of ginger extracts 3.1 Established quality control standards of the ginger oleoresin fistly Studied on the characters of the ginger oleoresin of quality control, including identification, inspection, determination. TLC was established to identify medicine, and moisture, ash, heavy metals, arsenic salt were examined, established the method of HPLC determination of gingerol,. The content of gingerol can not be less than 5.0%. We made a draft about quality standards for ginger oleoresinEstablished the ginger oleoresin standard HPLC fingerprint by using 10 batches of samples. The similarity of 10 batches of samples HPLC fingerprints is greater than 0.9.The ratio of common peaks area and reservation time are all coincident with the request of fingerprinting technology. and ginger oleoresin is good correlation3.2 Established quality control standards of ginger oil firstly Studied on the characters of the ginger oil of quality control, including relative density, refractive index, determination. Established the method of HPLC determination of ligustilide. The standard gingerol content is no less than 15%, relative density range of 0.948~0.958, refractive index range of 1.498~1.508. We made a draft about quality standards for ginger oilKeyword: ginger extracts the Preparation Process Quality Control Fingerprint 成都中医药大学硕士学位论文 附件二: 声 明 硕士学位论文“干姜提取物生产工艺与质量标控制研究”是本人 在成都中医药大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的,该论 文成 果归成都中医药大学所有。有关学位论文成果的开发、转让、论 文发 表等,均需征得导师和成都中医药大学同意。硕士签名: 导师签名: 年 月号 62成都中医药大学硕士学位论文 1 前言 1.1 文献综述 1.1.1 中药提取物研究进展 1.1.1.1 中药提取物发展现状 中药提取物是对中药材的深度加工,是从中药产业中分化出来的新兴领域, 具有开发投入少、技术含量高、产品附加值大等优势和特点。包括中药提取物在 内的植物提取物可作为原料应用于营养补充剂、化妆品、医药保健品等产品的开 发,具有广阔的市场前景。据统计,中药提取物每年以20%以上增长,市场总容量 已达到200亿美元以上。中药提取物经过数年的发展,已具备一定的产业规模, 出口比例已超过中药,并呈现上升趋势。目前中药提取物品种在80种以上, 现有 的品种可分为3类:单味中药提取物,如枳实、当归、黄芪、五味子、灵芝、蒺 藜、厚朴、刺五加、贯叶连翘、红车轴草、银杏叶等提取物;复 方中药提取物, 如 补中益气方提取物等;纯化提取物,包括活性部位和单体化合物,如大豆异黄酮、 人参皂苷、茶叶儿茶素、白藜芦醇、石杉碱甲等。目前国家缺乏一套完善的管理 规范指导中药提取物的研制、生产、流通等各个环节,以致中药提取物质量良莠 [1-2] 不齐,提取物平均出口价格大幅下降 。 1.1.1.2 中药提取物生产工艺研究 中药提取物对生产条件、生产技术要求较高,目前已有先进的提取、分离、 纯化、干燥技术及相应的设备应用于中药提取物的生产。如大孔吸附树脂分离技 术应用于银杏叶提取物的制备;离子交换树脂应用于分离辛弗林、石杉碱甲的制 备;吸附色谱应用于分离紫杉醇、白果内酯的制备;连续逆流萃取应用于红车轴 草提取物的制备;超临界萃取应用于芳香油类提取物的制备;酶解技术应用于白 藜芦醇的制备等。但先进的技术并非普及至每个提取物生产企业, 更多的小企业 [1-5] 由于资金、人才、信息的缺乏, 技术和装备较为落后 。 1.1.1.3 中药提取物的质量控制研究 中药提取物除控制其有效成分外,昀基本的是其常规品质控制要求。常规品 1成都中医药大学硕士学位论文 质的控制要求通常包括色泽、颗粒度、均匀度、杂质、样品的包装情况等指标; 也包括一些与安全性有关的指标,如农药残留、重金属、溶剂残留、卫生学指标 等。除将HPLC、HPCE、LC-MS、GC-MS、UV、IR 等先进的方法广泛应 用于植物提取物的质量分析检测外,国际上更多地采用了指纹图谱技术对提取物 的质量进行控制。我国业内技术水平较低的企业往往不具备仪器分析能力,商业 企业很少具备这些条件。目前绝大多数的中药提取物没有国家标准或行业标准, 企业多以中的质量条款作为产品交付的依据, 产品质量的检测方法尚不统 [1-5] 一 。 1.1.2 干姜的研究进展 [6] 干姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎 ,主产于四川、贵州、 山东、云南等地,其中以四川、贵州的产量大,品质好。在四川以犍为、沐川为 地道产区。 1.1.2.1化学成分 干姜的化学成分复杂,主含挥发油、酚类衍生化合物和二苯基庚烷三大类成 分。 1挥发油 如今己发现姜油中有100多种组分,其化学成分主要为萜类物 质:倍半萜烯类碳水化合物,氧化倍半萜烯,其余主要是单萜烯类碳水化合物和 氧化单萜烯类。倍半萜烯类碳水化合物中主要有α-姜烯,β-红没药烯、芳基- 姜黄,α-法呢烯和p-倍半水芹烯。低沸点的单萜烯含量通常较低,其组份以α- [7、8] 蒎烯、β-水芹烯为主。氧化倍半萜烯含量较少 。 2姜辣素 姜辣素(gingerol)是多种物质构成的混合物,其结构 中均含有 3-甲氧基-4-羟基苯基官能团,根据该官能团所连接脂肪链的不同,可把姜辣素分 为姜酚类(gingerols)、姜烯酚类shogaols 、 姜酮类zingerone、姜二酮类 gingerdiones、 姜二醇类gingerdiols等不同类型。各结构类型见图1。姜酚 gingerol为主要天然成分的系列酚类衍生化合物,包括3-、4-、6-、 8-、10-、 12-姜酚,其中6-姜酚是昀主要的成分;以及姜酮( zingerone)、6-姜烯酚(6- shogaols)、 8-姜烯酚(8-shogaols)、 10-姜烯酚(10-shogaols)、姜酮(zingerone)、 , , 。 [9 10 11] 姜二酮类(gingerdiones)、姜二醇类(gingerdiols)等 2成都中医药大学硕士学位论文 CH nCH CH nCH 2 3 2 3 O OH O OMe OMe OH OH姜酚类姜烯酚类 CH nCH CH nCH 2 3 2 3 O O O OMe OMe OH OH 姜酮类 姜二酮类 CH nCH 2 3 OH OH OMe OH 姜二醇类 图1 姜辣素类化合物的结构类型 3二苯基庚烷 可分为线性二苯基庚烷类和环状二苯基庚烷类化 合物,具 [12] 有抗氧化活性 。 [13,14] 4其他类 含有游离氨基酸、淀粉、树脂状物质 。 1.1.2.2药理作用 1抗氧化作用 生姜可以调节大鼠脂质过氧化和氧化度,降低体内脂质过 氧化物。生姜提取物中主要的抗氧化活性物质是姜辛醇类、姜烯酚和某些相关的 [15] 酚酮类衍生物,它们能清除超氧化阴离子和苯自由基 。生姜乙醇提取物也可 [16] 能成为一种具有抗氧化作用的天然抗缺氧药物 。 2抗微生物作用 生姜水浸液对伤寒杆菌、霍乱弧菌、堇色癣菌及阴道滴 [17] 虫有不同程度的抑制或杀灭作用,并有防治血吸虫卵孵化及杀灭血吸虫作用 。 用液态沙堡琼脂基稀释为一定浓度的生姜乙醇提取物对培养基中常见的皮肤癣 [18] 菌红色毛癣菌等有极为显著的抗菌杀菌作用 。 3抗炎作用 生姜精油能明显抑制组胺和醋酸所致小鼠毛细血管通透性的 3成都中医药大学硕士学位论文 增加,显著抑制二甲苯所致耳廓炎症,明显抑制肉芽组织增生;6-姜酚对环脂氧 [19] 化酶呈浓度依赖性抑制作用,不仅对炎症,而且对变态反应也有效 。生姜乙 醇提取物腹腔给药能抑制5-羟色胺5-HT引起的大鼠足趾肿胀和皮肤水肿,提示 [20] 其抗炎作用机制与阻断5-HT受体有关 。 4降低胆固醇作用 给由Trilon WR-1339诱导的高胆固醇血症实验小鼠喂 饲E-8β-17-环氧-12-烯-15,16-二醛ZT,发现鼠肝脏匀浆中胆固醇的生物合成 [21] 减少。此外给切除肝脏的小鼠喂饲ZT,也观察到胆固醇的生物合成减少 。 5抗动脉粥样硬化作用 生姜提取物可以阻止致动脉粥样硬化的脂蛋白浸 入动脉壁;存在于损伤处的胆固醇被转化为游离胆固醇,并被高 密度脂蛋白转运 到肝脏进行异化代谢;6-姜酚能促进胆囊的排泄功能,是动脉粥样硬化的抑制剂 [22] 。 6增强免疫功能 荷瘤鼠灌胃生姜醇提取物结果能明显升高脏器指数,提 高巨噬细胞吞噬率,使α-ANAE阳性率和IgM水平回升,表明生姜醇提取物明显 [23] 改善荷瘤鼠免疫功能低下状态,起到防治肿瘤的作用 。 7辐射防护作用 生姜提取物高剂量组小鼠睾丸中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 G-6-PD活性降低P0.05,乳酸脱氢酶LDH明显升高P0.05;低剂量组 G-6-PD酶活性明显提高。说明适当剂量的生姜提取物对X射线照射导致的小鼠睾 [24] 丸酶活性变化起着稳定作用 。 8护肝作用 生姜油对四氯化碳致大鼠肝损害有明显降低血清谷丙转氨酶 的作用,并对四氯化碳致小鼠肝损害有预防作用。 9止吐作用 对非健康混血狗静脉注射3mg/kg顺铂100%呕吐剂量的同时 给予生姜的丙酮,50%乙醇和水的提取物,结果生姜的丙酮和乙醇提取物有明显 的止吐作用,但效果不如5-HT,受体拮抗剂格雷丙隆,而水提取物则对顺铂所 致呕吐无效;无论哪一种提取物都不能拮抗去水吗啡所致呕吐。因此生姜可作为 化疗时有效而价廉的止吐剂。在泰国,妇产科把生姜作为妇科门诊患者腹腔镜检 [25] 查术后预防恶心呕吐的药物。生姜止吐与其调整胃肠功能、抑制胃运动有关 。 10抗过敏作用 对卵白蛋白致敏豚鼠以生姜油0.2mL/kg灌胃,证实生姜油 能明显抑制豚鼠过敏性支气管痉挛,还能抑制卵白蛋白致豚鼠回肠过敏收缩,也 能抑制组胺、乙酞胆碱致豚鼠回肠收缩,抑制程度随剂量加大而增加,提示其有 4成都中医药大学硕士学位论文 [20] 抗过敏作用 。 1.1.3 干姜提取物的研究进展 目前干姜提取物以姜油树脂、姜油为主流产品。我国干姜提取物的生产企业 很多,主要有湖南九汇现代中药有限公司、长沙华康技术开发有限公司、西安天 一生物技术有限公司等。干姜提取物目前还没有国家标准,商品提取物多标化为 含姜辣素5%。主要以HPLC测定干姜提取物中的姜辣素含量。可见干姜提取物的生 产工艺和质量标准都有待规范。 1.1.3.1干姜提取物的生产技术 目前干姜提取物的生产方法归纳起来主要有以下几种:水蒸气蒸馏法、溶剂 浸提法、压榨法、超声波法、液体 CO 浸提法和超临界 CO 萃取法。根据加工方 2 2 法及所含组分的不同,得到姜油和姜油树脂2种深加工产品。 1水蒸气蒸馏法 水蒸气蒸馏法是从姜中提取挥发性精油的昀常用方法, 该 法是利用道尔顿分压定律,分离难溶于水的成分。通常是将鲜姜在蒸馏前立即捣 碎,然后在常压或加压下通入水蒸汽以使姜油在低于其沸点的温 度下馏出,主要 获得姜中挥发性较大的精油,得率为 1.5%~2.5%,此法操作简单,投资少, 但缺点是蒸馏时间长,得油率低,且无法提取姜辣素组分,因而提取的姜精油风 味与生姜有一定的差别。 由于姜油储藏在根茎角状细胞的空隙中,在根茎的表皮和内部都有分布,在 提取姜油前,生姜的不同干燥方法对获得的姜油在组成、质量上有较大的影响, 鲜姜干燥成干姜将有许多低沸点的萜类丢失,即使采用冷冻干燥法,也有痕量组 [21] 分丢失,因此,采用合理的干燥法有利于保留单萜类 。 2溶剂浸提法 是获取姜油树脂的常用方法,包括直接溶剂浸提法和索氏提 取法。前者将固态生姜直接浸泡在溶剂中,使姜中所含的有效成分按一定的规律 如费克定律,逐渐溶解于溶剂中而被“浸泡”出来;后者利用对溶剂加热回流 及虹吸原理,使固态生姜中的有效成分能够连续多次地被“新”的溶剂所萃取。 以上2种溶剂浸提法获得的姜油树脂所含化学成分与选用溶剂关系很大,提 [22] 取时大多选用极性强的溶剂,如乙醚、丙酮、甲醇、乙醇和乙酸乙酯 。 3压榨法 利用压榨机械可以直接从生姜中获得姜汁,再处理提取获得姜 5成都中医药大学硕士学位论文 油,包含非发挥性和挥发性成分。该法所得的姜油量除与生姜本身的质量有关外, [23] 更与生姜的预处理压榨设备的操作情况有关 。 4超临界CO 萃取法 以高压液体作为萃取溶剂,在 6~8个大气压、32C?~ 2 35C?条件下,以 CO 为超临界流体,把姜中的姜油萃取出来,然后将这些携带着 2 姜油的CO 流体再经过由超临界状态或液态向气态的相转变,将其携带的姜油释 2 放出来,这种方法可同时获得挥发性和非挥发性姜油组分。优点 是无溶剂残留, 选择性易于控制,且CO 是惰性气体,萃取分离可在常温下进行,能减少姜油中 2 不稳定组分的分解,故抽提效率远远高于其他方法。 多项研究表明,超临界CO 萃取法萃取的姜油与水蒸气蒸馏法获取的姜油在 2 组分上有明显区别,前者既含有挥发油组分,又含有较高的姜辣素组分;而后者 几乎不含姜辣素组分。说明CO 萃取法在保留姜的风味及其特性方面有不可替代 2 [24] 的作用 。 1.1.3.2干姜提取物的质量控制 干姜的提取物化学成分可分为挥发油和姜辣素分析两部分,目前分析过程中 主要采用的方法有薄层层析法TLC、高效液相色谱HPLC、气相色谱GC、气 质联用GC-MS、顶空固相微萃取等手段,为取得较好的成分分析效果,大都是 几种方法配合使用。在生姜及其制品的指纹图谱评价时,采用气相、液相色谱数 据处理系统,用面积归一化法测得生姜净油各组分相对含量,除了相对保留时间 和相对峰面积之外,各峰的紫外图谱也可成为其特征指标。 1挥发油的组分分析法 姜的挥发油成份复杂,GC、GC-MS 是鉴定挥发油 组分含量的主要手段,为避免多峰相互重叠导致难以分辨,分析前大多采用 LC 将挥发油分成碳氢化合物和含氧化合物,甚至将含氧化合物进一步分成若干段 分,利用这些手段,使得挥发油的组分分析越来越明晰。 2姜辣素的测定 干姜中姜辣素的主要活性成分是姜酚,姜酚在姜中含量 少,且分离困难,干扰测定的成分较多。同时,由于姜酚具有化学和热不稳定性, 易氧化,受热易发生逆羟醛缩合降解,在生姜原料贮存或加工过程中,姜酚可脱水 转化成相应的姜烯酚,这些都为姜辣素的测定增加了难度,目前使用的姜辣素测 定方法有以下几种: ?铁氰化钾-三氯化铁比色法 张维勒利用酚类物质含有的羟基, 可还原铁 6成都中医药大学硕士学位论文 氰化钾-三氯化铁试剂成为普鲁士蓝的性质,提出了用铁氰化钾-三氯化铁比色法 测定姜辣素含量。该法灵敏、简便、重现性好,但对操作条件要求严格,且反应液 [25] 常易引起藤氏蓝沉淀而影响比色结果 。 ?Folin-酚试剂比色法 黄雪松等利用 Folin-酚试剂易被酚类物质还原而呈 蓝色反应的性质,提出了以香草醛为参考物的 Folin-酚试剂法测定姜辣素含量, [26] 该法简便易行,结果较准确 。 ?HPLC 香草醛内标法 黄雪松等以香草醛作内标用高效液相色谱HPLC法 测定姜辣素,该法准确度较辣椒碱外标法高,且对每次进样体积的重复性要求不 [27] 是很严格,但操作和计算较复杂,且需纯品做标样 。 ?HPLC 辣椒碱外标法 陈燕等以辣椒碱作外标,用高效液相色谱HPLC测 定姜中姜辣素,无需纯品标样,可直接对生姜中姜酚及姜烯酚进行定性及定量分 析。该法操作和计算简单,但对操作过程中的操作条件的稳定性和每次进样体积 [28] 的重复性要求高 。 1.2 立题依据 近年来,随着现代高新分离技术和设备在提取物行业中的引入,提取更为便 捷、经济,提取物质量也有了较大提高。中药提取物作为一种新型中药原料和半 成品,也越来越受到市场的青睐。但由于国内提取物厂家众多,整个行业又缺乏 统一标准,使得各厂家产品质量良莠不齐。现阶段,我国的提取物生产可以作为 标准进行参考的主要是《中国药典》2005年版一部中的植物油脂和提取物部分, 绝大多数的提取物没有国家标准或行业标准,企业多以合同中的质量条款作为产 品交付的依据,产品质量的检测方法亦较为混乱。因此对提取物生产工艺和质量 控制方法进行系统研究,制定生产和检验标准(SOP),制 定提取物质 量标准,对规范提取物市场和应对国际市场技术壁垒具有重要意义。 目前干姜提取物以姜油树脂、姜油为主流产品。我国干姜提取物的生产企业 众多,干姜提取物的生产工艺和质量标准都没有统一的标准,因此生姜提取物的 生产工艺和质量标准都有待规范。为了建立统一的提取物质量标准,首先要制定 药材的质量标准。《中国药典》2005年版(一部)规定了干姜的来源、显微和薄 层鉴别方法,挥发油含量不得少于0.8%(mL/g)。研究表明姜辣素是姜呈多种药 7成都中医药大学硕士学位论文 [29-32] 理作用的主要功能因子 。因此药材的质量标准应控制姜辣素的含量。 对干姜提取物生产工艺和质量控制方法进行系统研究,制定生产和检验 SOP ,拟定质量标准以上升为国家标准和行业标准,不仅有利于规范干姜提取 物市场,也对其它川产药材的开发利用起到示范性作用。 1.3 研究工作内容 干姜为姜科植物姜 Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎,主产于四川、贵州、 山东、云南等地,其中以四川、贵州的产量大,品质好。在四川以犍为、沐川为 地道产区。干姜提取物以姜油树脂、姜油为主流产品。我国目前存在干姜提取物 的生产工艺和质量标准都有没有统一标准,本课题以“两个标准三个规程” 药 材与提取物标准,药材采收初加工SOP、提取物生产工艺SOP、检验操作SOP为 重点进行了以下研究: 1.3.1 干姜药材的质量标准研究 运用姜辣素含量测定及指纹图谱分析技术对药材的质量进行控制。研究建立 了干姜药材 HPLC色谱指纹图谱检测方法。 1.3.2 姜油树脂制备工艺研究 对干姜提取物的制备工艺进行全面、系统的研究,所建立的小试工艺参数 为干姜提取物的大生产奠定基础。制备工艺研究具体如下: 1.3.2.1姜油树脂提取工艺研究 本工艺研究首先以姜辣素的含量为评价指标,考察了提取溶媒为 水和不同浓 度乙醇时姜辣素的溶出效果,其次考察了溶媒用量、提取时间及温度等因素,经 重复性试验,得到优选提取工艺。 1.3.2.2 姜油树脂纯化工艺研究 大孔吸附树脂目前已广泛应用于中药提取物的制备,本纯化工艺选择大孔吸 附树脂纯化技术纯化姜辣素,以适应大生产的要求。 1.3.2.3 姜油树脂干燥成型工艺研究8成都中医药大学硕士学位论文乙醇提取液减压回收得到的姜油树脂,采用β-环糊精包合制备固体姜油树 脂。对β-环糊精的用量、包合时间、包合温度等因素进行考察,筛选昀佳条件。 1.3.3 姜油的制备工艺研究 采用 GC-MS方法比较了水蒸气蒸馏法所得的姜精油和超临界 CO 萃取姜油 2 的化学成分。选择较优的提取方法。 采用超临界 CO 萃取装置提取姜油,对萃取压力、萃取温度、萃取时间等 2 因素进行考察,筛选昀佳条件。 1.3.4 姜油树脂质量标准研究 研究并建立了干姜提取物 HPLC 指纹图谱;研究并建立了姜油树脂含量测 定、薄层鉴别方法及水分、灰分、重金属、砷盐检查。 1.3.5 姜油质量标准研究研究并建立了姜油含量测定、薄层鉴别方法及折光率、旋光度等物理常数检 查。 2.实验部分 2.1 实验仪器与材料 2.1.1 实验仪器 日本岛津 GC-17A气相色谱仪,GCMS- QP5050A质谱仪,FID检测器;高 效液相色谱仪岛津 LC10-ATVP, CLASS-VP 工作站;色谱柱为 Hypersil BDS C18 (250mm×4.6mm,5μm,大连依利特分析仪器有限公司;UV1100 紫外-可见 分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);HA221-50-06 超临界萃取装置(江 苏?南通华安超临界萃取有限公司);DZG-6050 型真空干燥箱(上海森信实验仪 9成都中医药大学硕士学位论文 器有限公司);电子分析天平 BP211D(十万分之一),BP121S(万分 之一)(德 国 Sartouris股份有限公司);SHB-?循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限 公司)BUG25-12 超声波清洗机(上海必能信公司),W201B恒温水浴锅(北京 国华医疗器械厂);调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司) ;WAY 阿贝折射 仪(上海精密科学仪器有限公司),马弗炉(沈阳节能电炉厂)。 2.1.2 材料及试剂 硅胶G薄层层析用,青岛海洋化工有限公司 ;D101、DA201、DM301大孔吸 附树脂(天津农药厂);D140、AB-8大孔吸附树脂(晨光化工研究院);辣椒碱对 照品(中国药品生物制品检定所,批号:200601,含量测定用);甲醇(色谱纯, 美国Fisher公司);乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);所用试剂均为分析纯(成 都化学试剂厂)。 2.1.3 药材 [1]干姜提取物常以干姜投料,有文献报道 使用生姜打浆提取姜辣素,因为原 料生姜含水量约在90%左右,不易储存、控制,制备姜提取物通常 要先干燥、粉 碎,再投料。 干姜为四川犍为县生姜GAP基地2008年1月采收,经成都中医药大学陈新教 授鉴定为为姜科植物姜(Zingiber officinalis Rosc.)的根茎。 2.2 干姜药材的质量标准研究 实验所用药材按照《中国药典》2005 年版一部干姜项下进行质量检查,符 合规定。根据提取物的需要,本研究对干姜质量标准进一步研究,增加了 HPLC 测定姜辣素的含量测定项。 2.2.1 干姜药材中 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量测定姜酚ginerol为酚类化合物,不易分离纯化,且长时间储藏后易分解,因此 作为对照品有一定的局限性。本研究参考美国药典 24 版中的姜项下的方法,选 10成都中医药大学硕士学位论文 用与姜酚具有相同发色团和相近分子量的辣椒碱Capsaicin作为直接定量分析 姜辣素的外标。建立了以辣椒碱为外标对照品,HPLC测定生姜中 6-姜酚、8-姜 酚、10-姜酚三者含量占姜酚总量的 60%以上的含量的方法。研究表明,该法测 定含量准确可靠,简便易行,重现性好,灵敏度高,具有实用价值。 2.2.1.1对照品溶液的制备 精密称取辣椒碱对照品适量,置同一量瓶中,加甲醇制成每 1ml 含辣椒碱 0.156mg的溶液,即得。 2.2.1.2供试品溶液的制备 6-姜酚是姜酚类化合物的主要成分,故以 6-姜酚为指标性成分分别考察了不 同溶剂、不同提取方式、不同提取时间、不同溶剂比的影响。1提取溶剂的考察 分别考察了 70%甲醇、50%甲醇、甲醇、无水乙醇对 含量测定结果的影响。取干姜粉末约 2g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密加 入相应的溶剂 50ml,密塞,称定重量,超声处理(25kHz,500W )30min,放 至室温,再称定重量,以相应的溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续 滤液 10ml,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至 5ml 量瓶中,加甲醇至 刻度,摇匀,即得。 取上述四种供试液,用 0.45μm 滤膜滤过,分别精密吸取 0.2ml 辣椒碱对照 品溶液及 0.2ml 供试品溶液混合均匀。取系统溶液 10μl,分别注入液相色谱仪, 测定,计算,结果见表 1。 表 1不同提取溶剂对提取效率的影响n3提取溶剂 6-姜酚含量(mg/g) 70%甲醇2.65 50%甲醇1.86 甲醇3.63 无水乙醇2.61 由表 1可见,提取溶剂采用甲醇较优,故选择甲醇作为提取溶剂。 2提取方法选择 分别考察了回流提取、超声提取和索氏提取三种方法对测 定结果影响,方法及结果如下: 回流提取法 取干姜药材粉末约 2g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入 甲醇 50ml,密塞,称定重量,75?下水浴回流提取 30min,放至室温,再称定 重量,以甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液 10ml,置蒸发皿 11成都中医药大学硕士学位论文 中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至 5ml 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。 超声提取法 取干姜药材粉末约 2g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密加 入甲醇 50ml,密塞,称定重量,超声处理(25kHz,500W )30 分钟,放至室 温,再称定重量,以甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液 10ml, 置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至 5ml 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀, 即得。 取上述两种供试液,用 0.45μm 滤膜滤过,分别精密吸取 0.2ml 辣椒碱对照 品溶液及 0.2ml 供试品溶液混合均匀。取系统溶液 10μl,分别注入液相色谱仪, 测定,计算,结果见表 2。 表 2 不同提取方法对提取效率的影响n3 提取方法 6-姜酚含量(mg/g) 回流提取 4.46 超声提取 3.63 由表 2可见,提取方法采用回流提取较超声提取为优,故选择回流提取法作 为提取方法。 3提取时间考察 分别考察了回流提取 30min、60min、90min、120min 对 含量测定结果的影响。取干姜药材粉末约 2g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密 加入甲醇 50ml,密塞,称定重量,75?下水浴回流提取相应的时 间,放至室温, 再称定重量,以甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液 10ml,置 蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至 5ml 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即 得。 取上述四种供试液,用 0.45μm 滤膜滤过,分别精密吸取 0.2ml 辣椒碱对照 品溶液及 0.2ml 供试品溶液混合均匀。取系统溶液 10μl,分别注入液相色谱仪, 测定,计算,结果见表 3。 表 3 不同提取时间对提取效率的影响(n3)提取溶剂 6-姜酚含量(mg/g) 30min4.46 60min4.43 90min3.63 120min3.88 由表 3可见,回流提取 30min即可。 4溶剂比例考察 分别考察了甲醇(1:25)、(1:50)对含量测定结果 的影响。取干姜药材粉末约 2g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入甲醇 50ml、 100ml,密塞,称定重量,75?下水浴回流 30min,放至室温,再称定重量,以 12成都中医药大学硕士学位论文 甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液 10ml、20ml, 置蒸发皿中 蒸干,残渣分别加甲醇溶解并转移至 5ml 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。 取上述两种供试液,用 0.45μm 滤膜滤过,分别精密吸取 0.2ml 辣椒碱对照 品溶液及 0.2ml 供试品溶液混合均匀。取系统溶液 10μl,分别注入液相色谱仪, 测定,计算,结果见表 4。 表 4 不同溶剂比例对提取效率的影响(n3)提取溶剂 6-姜酚含量(mg/g)1:254.461:505.13 由表 4可见,1:50的溶剂比较好。 经以上实验研究,确定供试品溶液的制备方法:取干姜药材粉末约 1g,精 密称定,置圆底烧瓶中,精密加入甲醇 50ml,密塞,称定重量,75?下水浴回 流 30min,放至室温,再称定重量,以甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密 量取续滤液 20ml,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至 5ml 量瓶中,加 甲醇至刻度,摇匀,即得。 2.2.1.3系统适应性溶液的制备 分别精密吸取 0.2ml 辣椒碱对照品溶液及 0.2ml 供试品溶液 混合均匀,即可。 2.2.1.4色谱条件的优化 对色谱柱、流速、柱温、检测波长分别进行了考察,结果如下。 1色谱柱的选择 色谱柱考察了 Hypersil ODS250mm×4mm, 5 μm,Hypersil ODS150mm×4.6mm, 5 μm ,Alltech-ODS (250mm×4.6mm,5μm)和 Hypersil BDS C18(250mm×4.6mm,5μm。 2流速的选择 流速考察了 1ml/min、0.8ml/min、0.6ml/min、0.5ml/min。 3检测波长的选择 姜酚、姜烯酚和姜酮均为酚类化合物。这些化合物分 子在苯环部分的取代状况相同,差仅在边链。它们在紫外光谱中具有相同的生色 和助色结构,在λ230nm和λ280nm处有两个吸收峰,吸收强度前者略大于后者。 姜酚类化合物的紫外吸收特征是 A /A 1.75。姜酚边链上的羟基脱水后生 230nm 280nm 成姜稀酚。脱水产生的α、β-不饱和羰基也是一个生色结构,这一结构的?? ?跃迁使λ230nm处的吸收峰大大增强,由此形成了姜烯酚类的 紫外光谱特征, 即 A /A 4.75。辣椒碱是辣椒的主要辛辣味成分,其分子结构与姜酚、姜 230nm 280nm 烯酚类似。酰胺 n??*跃迁虽然也出现在λ280nm 左右,但ε很小,其影响可 以忽略。因此辣椒碱可以作为姜辛辣成分测定外标化合物,适宜检测波长为 13成都中医药大学硕士学位论文 280nm。 以上研究结果表明,采用如下色谱条件,能得到满意的测定结果。色谱柱: Hypersil BDS C18(250mm×4.6mm,5μm;流动相:乙腈-0.1%磷酸-甲醇 (55-44-1);检测波长为 280nm;流速 1m