孕酮对精子获能及顶体反应影响的研究

孕酮对精子获能及顶体反应影响的研究 山东大学 硕士学位论文孕酮对精子获能及顶体反应影响的研究 姓名:于庆 申请学位级别:硕士 专业:细胞生物学 指导教师:苗俊英 20090510 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的威:果。除文中已经注明引用的内秽卜，本论(支刁难靠洼,巾孵喜他介人或集体已经发或撰写过的科研，威:果。刘席攻碰阿,究作出重要贡献越价入和躺均已在文中以明确方溯。本声明的法僦卣巷懒。 论妤徽:立童,,期:(丝～墨?:兰 席丛,裣了解山东头焉鲜穷锄、使用学位论:文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子慨允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可眺绺栏澍撇的全韶彭湖,分内容编入有关数据南影再:,匿凛，可以稠影印、缩印弱新也复带蜉锻保存沧妇蝴本学位做。 佑壤滋汶在解密后应遵守,四四:三芷撇:秀丝日期: 山东大学硕士学位论文 引 言 体外受精(，, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,)或(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为，,,。由于它与胚胎移植技术(,,)密不可分，又简称为，,,—,,。其中精卵结合的成功与否是整个体外受精的关键步骤。获能和顶体反应是受精的重要步骤。近年的研究发现多种物质均能在体外诱导人精子的顶体反应，但这些物质大都很难获取(如卵泡液和透明带)或有较大的细胞毒性(如钙离子载体,,,,,,)，因而妨碍了它们在临床上的应用。最近的研究证明孕酮(,)可以诱发精子的顶体反应。 人类及哺乳动物精子在离开生殖道时，还不能立即与卵子受精。它必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程，才能获得受精能力。在自然情况下，在子宫处完成获能的精子并不能参与受精，真正参与受精的精子主要在输卵管中获能。输卵管及其分泌物在调节精子获能中起重要作用。排卵期输卵管液中孕酮浓度达,, , ,,,,,。 本研究在精子获能培养中添加不同浓度孕酮，作为项体反应的诱发剂，研究了其对人精子穿透人卵透明带能力的影响，观察应用孕酮与否对精子透明带结合试验结果的影响，以期了解孕酮对精子透明带结合的影响。研究患者应用中药后对精子结合透明带能力的影响，为实验室及，临床提供此方面的研究信息，也为孕酮在男性不育病治疗中的应用提供了理论依据。 山东大学硕士学位论文 第一部分概述 ,、受精机制 近年来辅助生殖技术(,,,)发展很快，,,,中最主要、最常用的是体外受精(，,,)。但，,,患者的平均周期临床妊娠率仅为,,,”,,,,,，原因之一为受精失败，即精子和卵子形态均正常，卵子成熟，精子活力正常，但无卵子受精。此情况常见于原发的多年不孕夫妇，推测可能存在受精机制障碍。尽管许多学者在受精机制方面做了大量研究，由于受伦理及实验的限制，迄今受精的具体机制仍不明确。，,,受精过程可分为几个阶段:处理精液使精子体外获能;获能精子识别并穿过卵子透明带(,,);精卵质膜相互作用;精卵相互激活;雌雄原核形成，胚胎开始分裂。受精各阶段都涉及复杂的生理、生化及分子事件。 ,(,精子获能 人类及哺乳动物精子在离开生殖道时，还不能立即与卵子受精。它必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程，才能获得受精能力。,,,,年著名华裔科学家张明觉(,(,,,,,,)博士和,(,(,,,,,,分别发现了这一生理现象。翌年，,,,,,,将这一现象称之为精子获能(;,,,;,,,,,,,)。在自然情况下，在子宫处完成获能的精子并不能参与受精，真正参与受精的精子主要在输卵管中获能。输卵管及其分泌物在调节精子获能 中起重要作用。 精子获能的基本机制有:(,),,,、,,,、,,,、,,,,等促进精子膜胆固醇的流失，精子膜组分的重排有利于,,,一和,,,，内流，两者激活精子膜上的,,(,,促进;,,,合成。其依次激活,,,，通过酪氨酸蛋白激酶和磷酸酪氨酸磷酸酶的双重调节而促进蛋白质酪氨酸磷酸化，最终引起获能。磷酸二酯酶(,,,)可通过调节;,,,含量而调节获能。(,)氧自由基可能通过直接或间接促进;,,,增加而进入,,,途径，或通过抑制磷酸酪氨酸磷酸酶而促进蛋白质酪氨酸磷酸化以诱导获能。(,)肝素可通过精子膜上肝素结合蛋白而促进细胞内,,,，升高、,,升高及;,,,增加，三者皆可通过,,,途径促进精子获能。(,)葡萄糖进入精子后的代谢可促进,,,和,,,,的生成(其对获能为正调节还是负调节尚难确定。(,)精子膜的超极化促进,,,，内流，细胞内的,,,，升高亦可通过;,,,,,,,途径促进获能。由于以上获能机制的研究来自不同物种，这几条获能途径可能在不同物种有所不同(而第一条途径可能为所有物种共有。 , 山东大学硕士学位论文 精子获能是受精成功的必要条件。射出的精子表面牢固附着一些来自附睾和精浆的成分，如糖蛋白、去获能因子、多肽、纤粘蛋白等。除去或改变这些精子质膜的稳定因子及保护物质是精子获能的基础【?】，尤其是抑制顶体反应(,;,,,,,, ,,,;,,,,，,,)的去获能因子的去除是精子获能中的重要事件【,,。去获能因子可能是一种或几种物质，且不同物种又有所不同。有研究认为精胺是人类、鼠类精子体外获能的抑制剂，通过阻断,,:，通道、抑制,,,，内流、使胞内环磷酸腺苷(;,,,)水平降低等作用抑制获能、,,及受精【,】;精液中血小板活化因子(,,,,,,,,—,;,,,,,,,, ,,;,,, ,;,,,,,,,,,,,,,，,,,)水平在不同男性个体中差异很大，而且与精子活力明显相关，被认为是候选的去获能因子,,〕,,〕。以往的一些候选去获能因子多是由体外实验证实，最近,,,,,,等【,,利用体内实验鉴定了小鼠的一种去获能因子(精囊腺分泌蛋，刍,(,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, ,,;,,,,,,,，,,,,)。用,,,,处理的精液，受精率会从,,,下降到,,,，人类,,,,同源蛋白是否也有相似功能还不明确;此外，,,,，在人类精浆中浓度很高，是精子膜的稳定剂，也常被视为一种去获能因子。正常，,,操作中，通过使用含适量能量物质和白蛋白的培养基对精子洗涤、离心即可使其体外获能。但如果某种遗传方面的异常使精子表面的附着物或去获能因子不易除去，将使精子不能获能，从而影响正常受精。 ,(,精子与卵子透明带(,,)作用 获能后的精子活力增强，出现超激活运动(,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,)。,,,与精子穿过,,的能力密切相关。精子接触,,前必须穿过卵丘。卵丘的存在对，,,有利，因为其中存在着刺激精子活力、促进精子发生,,的因子，能够增加精子对,,的敏感性。但如果卵丘中有抗精子抗体或卵丘基质化学特性异常，将使获能精子在卵丘内被捕获，致使受精失败。精子与,,相互作用大致可分,步:?项体完整的精子与,,结合。?正在进行,,和完成,,的精子与,,结合。?完成,,的精子进入并穿过,,。,,是一层包被在卵外的糖蛋白，其组成成分有,,,，,，,,,。精卵识别是通过精子表面的卵子结合蛋白与,,上的精子受体相互作用而实现的。位于,,，内夕’〕,表面的,,,是精子的初级受体，与精子质膜上的特异蛋白结合后，使精子附着在,,上， 同时还能够诱发精子,,的发生,,,。研究表明，人,,基因序列存在着多个单核苷酸多态(,,,)，其中,,,位于调控区和第,外显子的,个,,,位点不同的基因型与，,,受精失败相关,,,。,,发生后，精子顶体质膜脱落，与,,,结合的受体也随之丢失，此时，,,,做为精子受体介导精卵间的次级识别。,,,主要起到连接,,,和,,,的结构支撑功能，但最近有研究表 山东大学硕士学位论文明，,,，可能也作为一种次级受体在精卵结合中起作用。与,,上精子受体相对应，精子项体区质膜上和顶体内膜存在着初级和次级卵子结合蛋白。参与,,诱发,,的分子通过调节其他信号级联分子，如,蛋白、酪氨酸激酶或离子发挥作用。研究发现了一些人类精子可能的卵结合蛋白，主要有酶类和凝集素类。酶类包括酪氨酸激酶、甘露糖苷酶、,,受体激酶(,,,)、,,(,,和,,(,。凝集素类包括,,,,，,,,,和,,(,等。其中研究较多的是,,,，,,(,,和,,(,:,,,是一种酪氨酸磷酸化蛋白，通过与,,,的配体(受体结合参与精卵相互识别;,,(,,是糖基磷脂酰肌醇(,,，)锚定的单链膜糖蛋白，集中于精子顶体内膜，包含,,,个氨基酸。,,(,,广泛存在于哺乳动物精子中，在进化过程中相当保守，具有透明质酸酶活性，可协助精子穿过卵丘并参与精子与,,间的次级识另簦穑铮臁, 芯糠?郑 樱校龋 玻盎 蚯贸 坌允蠡竦玫木 樱 」芷浔砻嫒笔В校龋 玻埃 阅艽?嘎炎樱冢胁?孤炎邮芫 崾酒湓谑芫 械淖饔每赡懿?潜匦琛尽В薄,苤 佑耄冢械淖饔檬窍嗟备丛拥模 卸嘀 绻 忍旎蚝筇斓穆呀岷系鞍住?冢刑堑鞍滓斐,志 拥鞍撞斡氤跫逗痛渭妒侗穑 蓟嵊跋炀 颜 ,岷希 率故芫 О堋?,(,精卵质膜相互作用 精子进入,,后，随之发生的精卵质膜融合是一个多种分子参与、多对配基与受体协同作用的过程。此过程中许多分子水平因素会限制精卵质膜的正常融合，从而影响受精。研究发现，精子穿过,,后，最先与卵子质膜接触的部位是顶体内膜，然后是赤道段,顶体后区的质膜，而卵子参与质膜融合的部位一般是微绒毛丰富的区域。精卵质膜融合的相关分子包括糖类物质、基质金属蛋白酶、,,,,,,, ，，、纤维蛋白原激活因子等。不同物种与卵子质膜相互作用的精子相关蛋白有所不同。位于人类精子质膜上、已有报道的候选蛋白包括:受精素〔,,,，,,,,,，,,,,,，纤连蛋白，补体,,？，,,(,，,,,,和,,,,等。最近，,,,,等,,,,鉴定并克隆了小鼠，,,,,基因，并证明，,,,,蛋白是精子特异性的精卵融合关键分子，其基因敲除雄性鼠不育，但精子形态及活力均正常，且采用胞浆内单精子注射(，,,，),,邕，使卵子受精，提示其主要在精卵融合过程起作用，但不参与精卵识别及结合。现在人类,,,,,基因已被克隆，其是否在精卵融合中起重要作用还有待进一步研究。用蛋白酶处理卵子质膜会阻断精卵结合及融合，说明卵子表面存在着“精子受体”。这些受体分为整合素类、免疫球蛋白超家族类和选择素家族类。整合素属糖蛋白，以跨膜二聚体的形式存在，包含,,和,亚基。两个亚基不同的组合可形成,,种不同的整合素分子。人卵子质膜上存在一种以上的整合素分 山东大学硕士学位论文子，以受体的形式与精子上的纤粘蛋白和玻粘蛋白结合发挥作用;人卵子表面存在着免疫球蛋白类受体,,,，,,,，,,，,,和,,等，可与精子质膜上相应配体作用介导质膜融合。其中,,,对精卵融合尤其重要。,,,基因敲除后的雌性小鼠卵细胞能正常成熟，但有精卵融合的缺陷，而将野生型,,,,,,,注入,,,敲除卵细胞，精卵融合将会恢复到极高 水平【,，】。此外，在人卵子质膜和细胞质内存在着,(选择素，而精子上存在的,,,,正是,(选择素的一种配体，提示其可能在精卵质膜作用的最初阶段发挥精子滞动作用【一,】。 ,(,精卵相互激活 精卵质膜相互作用不仅是一个膜融合的过程，而且与卵子活化信号的传导密切相关。可以说卵子活化信号的启动就是从精卵质膜相互作用开始的。卵子激活是通过卵子内钙波及钙振荡实现的。引起卵子内钙释放有,种途径:，,,诱导的,,,，释放(，，,,)和,,,,,,,,,诱导的,,,，释放(刚,,)。,，,,是通过磷脂酶,(,,,)水解磷酸肌醇(,，,,)产生，,,实现的，而，,,作用于卵胞质钙库的，,,受体可引起细胞内,,的释放，释放出的,,,，反过来又激活,,,增力【〕，,,产生量，继而使其他位点的钙库释放,,寸，形成钙波;,，,,与此途径相似，只是诱导物和受体不同。精子激活卵子机制有多种假说，目前公认氖蔷 右蜃蛹偎怠,眉偎等衔 炎拥募せ钍怯捎诰 幽诖嬖谧怕鸭せ钕喙匾蜃印,芯糠?郑 犹崛?锬苡盏悸炎硬 胝 ,芫 耆 嗤 母普竦础荆斓丁,恚海纾疲桑茫 私 徊街С郑 吹ジ鼍 幽诘奈镏首阋杂盏悸炎臃? 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