动物细胞培养心得

动物细胞培养·心得 在学习动物细胞培养的过程中,我了解到是动物细胞中最常用的技术手段,而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础点,细胞培养是生物医学中一项重要技术,应用较为广泛,目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。在这次PPT 制作中,我对无脊椎动物和脊椎动物两大领域细胞培养取得的进展及应用作了较为详细的了解,并在此基础上探讨了动物细胞培养存在的问以及未来的发展方向。为相关领域研究者探讨其他种类细胞系的建立及筛选合适的细胞系培养方法作为理论的参考依据 我了解到历史上组织培养技术创建于 18 世纪末,之后于 1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下,以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后,才逐渐发展成为一种从体内组织取出细胞,模拟体内生存环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。特别是随着近年来现代生物科学领域的迅速拓展,各种分子生物学实验诸如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等,都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而,在种类繁多的动物世界里,细胞培养实验技术的发展并不均衡,构建动物细胞培养体系的研究效率和效果上也存在较大的局限性。而动物细胞培养,在1907年,哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基,培养蛙胚神经组织存活数周,并观察到神经细胞突起的生长过程,由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法,奠定了动物组织体外培养的基础。之后,又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养,提高了传代效率并减少了污染;1923年,卡雷尔(Carrel)设计了卡氏瓶培养法,扩大了组织生存空间。 1951年,厄尔(Earle)发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。1951年,波米拉(Pomerat)设计了灌流小室,使细胞生活在不断更新的培养液中,便于作显微摄影和细胞代谢的研究。1957年,格拉夫(Graff)用灌流技术进一步提高了细胞悬浮培养的效率。1957年,杜尔贝科(Dulbecco)等人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法,获得了单层细胞培养。单层培养法的出现,对组织培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。20世纪60年代后,动物细胞大规模培养技术开始起步,并逐步发展。20世纪80年代后,随着基因工程和其他细胞工程技术的发展,细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础,在现代生物技术中发挥着重要的作用 我从资料查得根据细胞种类:原代细胞培养,传代细胞培养。原代细胞:将动物各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法处理,分散成单细胞,在合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。培养的细胞为正常的动物细胞,一般培养10代后不再增殖,死亡。传代细胞:传代培养是细胞培养常规保种方法之一,也是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶,细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量供实验所需细胞。细胞传代要在严格的无菌条件下进行,每一步都需要认真仔细地无菌操作。培 养的细胞为癌变或人为癌化的细胞,理论上可以无限增殖。癌化的方式有很多:进行癌基因突变,感染病毒,从癌症供体体内分离,物理或化学方法(如紫外,化学试剂)等。 在我们动物细胞培养的实验中,其基本过程是取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将剪碎,并用胰蛋白酶(或用胶原蛋白酶)处理(消化),形成分散的单个细胞,将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,成为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时,细胞就会停止分裂增殖,出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。另外,原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。当细胞从动植物中生长迁移出来,形成生长晕并增大以后,科学家接着进行传代培养,即将原代培养细胞分成若干份,接种到若干份培养基中,使其继续生长、增殖。通过一定的选择或纯化方法,从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。当培养超过50代时,大多数的细胞已经衰老死亡,但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性,即癌变。此时的细胞被称为细胞系。 我们做实验时,其基本条件:1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清目前,大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一,具有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。3、无菌无毒细胞培养环境,无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡。因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物。4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度。5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。 实验中,动物细胞培养基按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便。合成培养基的主要成分有:氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质。氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺。无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因 素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ~320 mOsm/kg。培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。缓冲系统HEPES 是一种非离子缓冲液,在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲力,但是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g/L)共用,以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含有酚红作为pH 指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色。 老师告诉我们细胞培养温度:维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃1 小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-41℃1 小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复; 41-42℃1 小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1 小时,细胞全部死亡。相反,温度不低于0℃时,对细胞代谢虽有影响,但并无伤害作用;把细胞放入25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢;放在4℃数小时后,再回到37℃培养,细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时,细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是,如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油),可在深低温下如-80℃或-196℃(液氮)长期保存。 细胞培养中,我们从以下几个方面来预防支原体的污染:控制环境污染,严格实验操作,细胞培养基和器材要保证无菌,在细胞培养基中加入适量的抗生素。清除支原体,常用方法有:抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮;其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用,所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体,不影响细胞本身的代谢,并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞,不会重新感染支原体。 而我了解查资料到,其在生物学基础研究中的应用:离体培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测的特点,因而可广泛应用于生物学领域的基础研究中。在细胞生物学上,动物细胞培养可用于研究动物的正常或病理细胞的形态、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。如神经细胞的增殖、突起生长、相互识别、刺激传递等机理就是通过进行各种神经细胞的培养才弄清楚的。在遗传学研究中,除可用培养的动物细胞进行染色体分析外,还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学进行遗传分析和杂交育种;在胚胎工程中通过体外培养卵母细胞并进行体外受精、胚胎分割和移植已发展成了一种较成熟的技术而应用于家畜的繁殖生产中。另外,分离和培养具有多潜能性的胚胎干细胞,还可用于动物克隆、 细胞诱导分化、动物育种的研究,并可作为基因转移的高效表达载体;在病毒学研究中用培养的动物细胞代替试验动物做斑点分析,不仅方法简便、准确、而且重复性好。 利用动物细胞大规模培养技术生产大分子生物制品始于上世纪60年代,当时是为了满足生产FMD 疫苗的需要。后来随着大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用,人们发现利用动物细胞大规模培养技术来生产大分子药用蛋白比原核细胞表达系统更有优越性。随着大量永久性细胞株的创建在商业利益的刺激下,动物细胞大规模培养技术也迅速发展起来,并被付之于应用。目前,用动物细胞可生产的生物制品有各类疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、病毒杀虫剂、单克隆抗体等,其销售收入已占到世界生物技术产品的一半以上。我们相信,随着动物细胞培养技术的发展,以后还会有更多的生物制品被开发并用于造福人类。 大学学习中,我认真学习了动物细胞培养的基本过程和原理,觉得动物细胞培养的发展很有前景,在之后的学习道路中会更加努力。