Tm值

Tm值就是DNA熔解温度,指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA, Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。Tm是PCR引物设计中 一个非常重要的参数.是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50%的引物与模板配对,而另外50%的引物处于解离状态时的温度,Tm值一般高于55度,,设计引物时要注意使两个引物的Tm值相近,否则两个引物不能同时达到退火温度,将影响PCR的扩增结 果!! 计算方法 核酸Tm值(解链温度)计算 评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度,当核酸达到Tm值时,其260nm吸收量可增加百分之四十(紫外吸收量随解体程度而增加,直至完全解体。 (1)长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) (2)对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为: Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中,Size = 引物长度 影响Tm值的因素: ①DNA碱基组成:C-G含量越多,Tm值越高;A-T含量越多,Tm值越低。 ②溶液的离子强度:在低离子强度中,Tm较低,而且解链的温度范围较宽;在高离子强度中,Tm值较高,解链的温度范围较窄。 ③PH值:溶液的PH值在5~9范围内,Tm值变化不明显,当PH>11或PH<4时,Tm值变化明显。 ④变性剂:各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值。 ⑤DNA双链本身的长度。