引物延伸分析(primer extension analysis)

引物延伸(primer extension analysis)主要用于mRNA 5′端作图。poly(A)+RNA 首先与过量5′端标记的且与靶RNA互补的单链寡核苷酸引物杂交,然后用反转录酶延伸这个引物。产生的cDNA与RNA互补且长度与引物5′端和RNA 5′端之间的距离相等。该法在mRNA 5′端作图方面具有下述优势:一旦引物被子起始合成,延伸反应大多会进行到RNA 模板的5′最末端,产物大小可精确测定。此外,产物长度不会受靶基因内含子分布与大小的影响。 几乎所有的引物延伸实验多采用长20~30 bp合成寡核苷酸引物。当用于和靶序列杂交的寡核苷酸引物位于距mRNA 5′端150 bp以内时,可获得最佳结果。在更远距离处杂交的引物能增加异源延伸产物,因为反转录酶会在模板RNA的二级结构复杂区终止。因此,在设计引物时,除实际的序列之外还应考虑到杂交的位置。应尽可能使寡核苷酸的GC含量在50%左右且在3′端为G或C。用两个引物在mRNA相距一段已知距离(20~50 bp)的区域上分别杂交则更为理想。大小差别等于两个引物间距的延伸产物,可对结果进行验证。为了找到一对能产生明确延伸产物的引物,合成多个引物也许是必须的。 在很多情况下,引物延伸反应会产生两个产物:全长cDNA分子和短2~2 bp的反转录产物。这可能代着多个转录起始位点导致的mRNA 5′端不均一性。有时,在临近靶mRNA 加帽位点的甲基化残基处的提前终止将产生更短的产物。与帽子结构相关的条带在不同mRNA 样品中的化学定量是不同的,对于一份给定样品总是一个定值。为了区分反转录假象和真正的mRNA 5′端不均一性,用5′端标记的探针进行S1核酸酶分析是一个很好的。 与未进一步分离的哺乳动物RNA相比,poly(A)+RNA样品可得到干净得多的结果,因为前者分产生多到不可接受的提前终止产物。通过在更高浓度(5 mmol/l)dNTP下进行延伸反应,并在用互补区位于mRNA 5′端50~100 bp以内的引物可将假象降至最低。 用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸引物一度是必须的。这些年来,除非总是产生延伸产物的梯状条带,许多研究者已不再费心纯化了。 在杂交反应中,核苷酸引物分子的量应大约10倍于靶mRNA。更多量的引物可能会导致非特异延伸和人为条带的出现。所以,且一定量RNA与不同量的引物(通常为20~40 fmol, 104~105 cpm)进行一系列预实验是可取的。 复性温度极大地影响引物延伸实验的质量,值得在预实验中调查以确定最佳复性温度。多数情况下,对于GC含量为50%,20~30 bp的引物,其最佳复性温度在40~60℃之间。可以设置一系列以5℃为间隔的引物延伸反应来确定最佳复性温度。 当用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析延伸产物时,大小已知、末端标记的DNA片段可用作相对分子质量标记参照物。但最好是采用与延伸反应相同引物的基于DNA模板的测序图,通过对照测序图读出引物延伸反应产物的大小,靶RNA的5′端可定位于一个特定的碱基。 在研究启动子区时往往采用引物延伸分析(primer extension analysis,看了些相关资料,感觉收获不小,和大家分享一下。 1、引物延伸分析(primer extension analysis) 引物延伸分析用于定量mRNA的量,测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端,确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域,随后用RNA作为模板,用反转录酶延伸引物得到cDNA,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数,所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 长度为20-40个核苷酸,与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸,可得到最佳分离效果。引物延伸 实验非常灵敏,可检测2 pg的转录产物,这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。 (1)引物延伸分析所用试剂:引物延伸实验需要模板RNA,可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物,用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物,还需要反转录酶,AMV或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶试剂,和电泳装置。所得结果用放射自显影和磷成像仪分析。 (2)引物延伸系统的组分:引物延伸系统中AMV反转录酶和反应溶液、焦磷酸钠、正对照RNA模版和对照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物、T4多核苷酸激酶和溶液、样品溶液、AMV反转录酶2X溶液100 mMTris-HCl(pH8.3, 42℃)、100 mMKCl、20 mM MgCl2、20 mM DTT、2 mM每一种dNTP、1 mM精胺。PhiX174标准分子参照物和T4 多核苷酸激酶用作引物标记,和确定延伸产物长度的标准。对照RNA可得到87个碱基的延伸产物作为正对照。引物延伸反应中用焦磷酸钠和精胺可增加全长cDNA的得率,抑制模板RNA产生发卡结构。虽然其作用方式未确定,但结果是增加全长cDNA的得率,抑制模板RNA产生发卡结构。MMLV被焦磷酸钠和精胺抑制,如使用MMLV,放线菌素D可用于增加全长cDNA的得率,抑制模板RNA产生发卡结构。焦磷酸钠和放线菌素D抑制cDNA第二条链的合成。 (3)引物延伸实验的优化: ①杂交温度。引物延伸实验中所用的杂交温度是最关键的需优化的因素。一般而言,最高紧密度,或引物和互补序列完全杂交所需的最适条件是,低于引物溶解温度的5oC。低于最高紧密度的温度可极大地增加杂交速度。应在不同的紧密度的杂交温度下作杂交,以控制引物和特异RNA的杂交。增加杂交紧密度时,带来的延伸产物的丢失表明,引物和相关的却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下,RNA在较高温度会降解,应用 甲酰胺杂交操作,这可有效降低溶解温度,因此可使杂交在较低的温度进行。可在杂交步骤中用以下的溶液:40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺。如用这个杂交溶液,延伸步骤前甲酰胺和盐需用乙醇沉淀后除去。 ②模板RNA和引物的量。以下讨论了所用RNA模板和引物的起始量。反转录酶对不同模板使用的效率不同。这部分是由于RNA中存在的次级结构干扰反转录酶的聚合酶活力。如产生短的产物,这通常不是一个问题。如用AMV反转录酶,延伸温度可达55℃。 ③每次反应所用RNA的量。每次反应所用RNA和引物的量取决于分析的RNA的种类(总RNA或poly(A) + RNA),目的RNA的相对丰度。如用总RNA,起始量为10ug,但分析稀有信号,每次反应用100 ugRNA。poly(A)+RNA每次反应用0.1-1.0 ug,具体决定于总RNA中poly(A)+RNA的富含量,需分析的特异RNA的浓度。在引物延伸分析前需检查目的RNA的完整。通过凝胶分析总RNA,应有完整的18S和28S核糖体RNA带。在引物延伸反应中用Northern印迹和RT-PCR分析来确定特定RNA的存在。 ④每次反应所用引物的量。用引物延伸实验定量RNA,标记的引物必须多于目的RNA。引物应是互补RNA的5-10倍。但一般,总RNA或poly(A)+RNA中,特定目的RNA量未知。对未分析的转录物,初次分析用50 ug总RNA和100fmol引物。如所有RNA中与引物互补的位点饱和,测试信号和投入的RNA的量成正比,而不依赖于引物的浓度。引物应至少为20个核苷酸,杂交位点应位于转录产物5`-末端下游的100个碱基处,而不会自互补。也可用从限制性酶切片段所得的ssDNA作为探针,长度应不长于50-100个核苷酸,以获得最佳分辨率。 ⑤AMV和MMLV的选择。引物延伸反应通常用AMV,AMV性能更好,对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55℃, 以消除次级结构,但在这样温度下,引物延伸反应的得率通常降低。MMLV的最适温度为37℃,在更高温度下,MMLV不稳定,但MMLV可合成更长的 产物,这一特点对引物延伸反应不适用,因引物延伸反应所得的产物一般较短,为100-500个核苷酸。 ⑥会导致非特异,短的和多个引物延伸产物的影响因子:所研究的转录的差异程度可导致产生不同长度的延伸产物,它们来源于选择式剪切和使用不同的转录起始位点。差异核RNA的存在也能导致产生多个延伸产物。引物和RNA中相关或无关序列的交叉杂交也会导致非特异延伸产物的产生。产物短于预测可能和RNA模板的降解有关,或者是转录产物中次级结构阻制了反转录酶的合成,产生断缺的cDNA。RNA样品中存在DNA污染同样可得延伸产物,加放线菌素D(75ug/ml)可抑制这类产物的产生。应作无RNA模板的负对照实验,以确定所用试剂中无RNA和DNA污染。同时还应用从不表达目的转录产物的细胞或组织中提取的RNA模板作负对照实验。 (4)计算RNA转化为cDNA的量。RNA转化为cDNA的量可对引物延伸产物,和`无RNA`对照实验的cpm作测量得到。从凝胶中分别切割引物延伸产物和`无RNA`对照实验中产物,在闪烁液中测定凝胶块的读数,可有效平衡聚丙烯酰胺凝胶的湮灭和32P的衰退。以下的例子表明如何计算fmol的RNA转化为cDNA,在这个例子中,一半的引物延伸产物(20ul/40ul)加入凝胶中作分析。`无RNA`对照实验的引物浓度为100 fmol,一半的反应液加入凝胶中作分析。切割的带的读数为:样品为3912 cpm,引物为142359 cpm,首先计算引物cpm/ fmol: cpm/ fmol=142359 cpm/[100 fmolX(20/40)]=2847 cpm/ fmol,接下来计算引物延伸产物的fmol,或cDNA:3912 cpm/[2847 fmolX(20/40)]=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。 (5)确定引物延伸产物的精确长度的分子标准参照物。为确定引物延伸产物的精确长度,应同同位素标记的DNA分子标准参照物对照。DNA分子标准参照物末端作了标记,上变性凝胶前先作变性,引物延伸产物也作变性。长度在20-500核苷酸范围的分子标准参照 物在确定引物延伸产物的长度方面很有用。去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物非常方便,已去磷酸,可作5`末端标记,分子标准参照物的长度为24-726核苷酸。用于引物延伸产物分离的聚丙烯凝胶的规格为16X18cm, 含8%聚丙烯、7M尿素、1′TBE溶液。这种胶和测序胶很相似,故一般可用测序胶。应注意不使引物延伸产物和自由引物跑到胶外,特别是需对cDNA定量时。 2、核酸酶S1作图(Mapping RNA with Nuclease S1) 三种不同的核酸酶——S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII被用来进行RNA定量,确定内含子位置,及鉴定在的DNA模板上mRNA的5`-末端和3`-末端的位置。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。在反应的末期,用核酸酶用来降解未杂合的单链RNA和DNA。余下的DNA-RNA或RNA-RNA 杂合体用凝胶电泳分离,接着用自显影或Southern杂交来观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时,信号强度与样品中目的mRNA的浓度成正比。用过量探针与一系列定量的靶序列杂交作出标准曲线,从而可准确估算样品的浓度。在真核系统中,S1核酸酶消化过的5`-末端通常代表转录起始点,而3`-末端代表聚腺苷酸化的位点。同样的策略可用来对拼接位点的5`-末端和3`-末端作图。